成若通 陳一博 孟祥瓊 陳家瑞 魏青

(青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，西寧 810016)

遺傳多樣性反映了物種應(yīng)對(duì)環(huán)境變化與進(jìn)化的潛力，遺傳多樣性越高，對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)(沈浩和劉登義，2001)。對(duì)于經(jīng)歷過(guò)人類(lèi)獵殺導(dǎo)致種群危機(jī)的野生物種，隨著短時(shí)間內(nèi)大量個(gè)體的消亡，很多潛在的優(yōu)良基因單倍型也會(huì)喪失，在后續(xù)種群數(shù)量恢復(fù)過(guò)程中，這些單倍型并不會(huì)隨著種群個(gè)體數(shù)量的增加而迅速恢復(fù)，即遺傳多樣性的恢復(fù)明顯滯后于種群數(shù)量的恢復(fù)(Frankhamet al.,2002)。張志和(2006)研究發(fā)現(xiàn)華南虎(Panthera tigris amoyensis)雖仍維持較高的遺傳多樣性，但很多稀有單倍型僅存于一個(gè)或兩個(gè)個(gè)體，極易因攜帶者死亡而丟失，其遺傳多樣性難以維持；朱鹮(Nipponia nippon)作為瀕危物種種群恢復(fù)的典型案例，1982年被發(fā)現(xiàn)時(shí)僅有7只，現(xiàn)在雖已恢復(fù)至7 000 多只，但由于種群奠基者數(shù)量太少，導(dǎo)致現(xiàn)有朱鹮種群近親繁殖系數(shù)高、遺傳多樣性低(Zhanget al.,2004)。因此，種群遺傳多樣性監(jiān)測(cè)是物種保護(hù)的重要內(nèi)容之一。

藏羚(Pantholops hodgsonii)是青藏高原動(dòng)物區(qū)系的典型代表，主要分布在以羌塘為中心的高原地區(qū)。20 世紀(jì)中期瘋狂的盜獵行為使數(shù)十萬(wàn)只藏羚喪生，其種群數(shù)量在2003年降到了最低的5萬(wàn)只左右(Leclercet al.,2015)，現(xiàn)已恢復(fù)至約30 萬(wàn)只(陳建偉和劉璐，2021)。近年來(lái)對(duì)藏羚線(xiàn)粒體基因和常染色體基因的STR 遺傳標(biāo)記分析表明藏羚種群仍然具有豐富的遺傳多樣性(Zhanget al.,2013;Duet al.,2016)。然而，對(duì)藏羚性染色體的基因多樣性研究目前仍處于空白。已有的研究表明，藏羚種群性別比例明顯偏雌(夏霖和楊奇森，2015)，即雄性藏羚在其生活史中面臨更高的死亡風(fēng)險(xiǎn)，且藏羚的婚配制度為一夫多妻(Blanchardet al.,2004)，Y 染色體遺傳多樣性特征對(duì)于全面掌握藏羚種群遺傳特征具有重要意義。Y染色體作為雄性特有的染色體，具有突變率低、遵循父系遺傳、不易受重組影響等特點(diǎn)(Clark,2014;Cortezet al.,2014)，基于Y 染色體的單核苷酸多態(tài)性(Y-SNP)是研究家養(yǎng)動(dòng)物常用的遺傳標(biāo)記，已被廣泛應(yīng)用于人(Keet al.,2001)、普通牛(G?therstr?met al.,2005)、牦牛(馬志杰，2019)、綿羊(王玉濤等，2011)等物種的遺傳多樣性、父系起源、分化和分類(lèi)等相關(guān)研究。然而，針對(duì)野生動(dòng)物Y-SNPs 的相關(guān)研究還相對(duì)較少。

為探索藏羚的Y染色體遺傳多樣性，更加全面掌握藏羚種群遺傳特征，本研究基于已發(fā)表的?？苿?dòng)物Y-SNP位點(diǎn)信息，篩選出藏羚特異性Y-SNP位點(diǎn)并進(jìn)行測(cè)序，利用多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)藏羚Y染色體遺傳多樣性進(jìn)行分析，為深入了解藏羚種群遺傳多樣性水平、群體遺傳結(jié)構(gòu)及父系起源等提供理論支撐，同時(shí)為藏羚種群的保護(hù)提供科學(xué)參考。

1 研究方法

1.1 樣品采集

2014 年和2021 年在三江源國(guó)家公園可可西里卓乃湖區(qū)域(北緯35°27′～ 35°29′，東經(jīng)91°50′～92°03′)共收集意外死亡藏羚肌肉和新生幼仔胎盤(pán)組織樣品77 份；2021 年在新疆阿爾金山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)兔子湖區(qū)域(北緯36°38′～ 36°42′，東經(jīng)87°13′～87°15′)共收集肌肉組織和新生幼仔胎盤(pán)組織樣品8份。野外收集樣品后保存于95%乙醇中帶回實(shí)驗(yàn)室，于冰箱中4℃保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

藏羚基因組DNA 的提取。參照Strauss (1999)的氯仿異戊醇(24∶1) 法抽提制備藏羚基因組DNA，NanoDrop 核酸檢測(cè)儀測(cè)定其濃度和純度，無(wú)菌水稀釋至80 ng/μL備用。

藏羚樣品性別的鑒定。參考?？苿?dòng)物性別鑒定通用引物SE47/SE48 (Weikardet al.,2006)，Y1/Y1 (Raoet al.,1995) 對(duì)樣品進(jìn)行性別鑒定，引物由上海生工生物工程有限公司合成。雄性樣品用于后期Y染色體遺傳多樣性分析。

藏羚Y-SNP 位點(diǎn)的篩選和測(cè)序。查閱相關(guān)文獻(xiàn)并整理已在其他牛科動(dòng)物Y 染色體上驗(yàn)證具有多態(tài)性的SNP 位點(diǎn)，選擇SRY15、SRY17、ZFY10、ZFY11、AMELY3、DDX3Y、UTY1、SRYOY1、DBY(Meadowset al.,2004)、UTY19(G?therstr?met al.,2005)、SRY(Meadowset al.,2006)、ZFY1、ZFY2、ZFY3、SRY4、SRY5、SRY6(Nijmanet al.,2008)、ZFY9、ZFY10-2、DDX3Y1、DDX3Y7(Ginjaet al.,2009)、USP9Y、ZFY(Bonfiglioet al.,2012)、SRY18(蔣利，2013)、OFD1Y1、OFD1Y9、SRY3、AMELY1、AMELY2、AMELY4(Liet al.,2014)等30個(gè)牛科動(dòng)物多態(tài)性Y-SNP位點(diǎn)，由上海生物工程股份有限公司合成引物后，篩選出藏羚Y染色體可用引物。篩選流程為：利用雄性藏羚基因組DNA 對(duì)所有引物進(jìn)行溫度梯度PCR 確定最佳擴(kuò)增溫度；以雌性樣品DNA 為陰性對(duì)照，ddH2O為空白對(duì)照，5個(gè)雄性藏羚樣品建立混池DNA，對(duì)具有單一擴(kuò)增條帶的引物進(jìn)行二次篩選；取雄性特異性擴(kuò)增產(chǎn)物送至測(cè)序公司進(jìn)行基因測(cè)序，篩選出多態(tài)性引物后再對(duì)所有雄性樣品進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序。測(cè)序由金唯智生物科技有限公司完成。PCR擴(kuò)增體系(25 μL)為：gDNA 80 ng，上下游引物各1 μL，2 ×Taq Mix 12.5 μL，ddH2O 補(bǔ)足。PCR 擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，X℃退火30 s(X為退火溫度)，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。測(cè)序結(jié)果基于SeqMan 軟件進(jìn)行人工核對(duì)，MEGA11 軟件(Tamuraet al.,2011)對(duì)序列結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，DnaSP V6 分析單倍型及多態(tài)性信息(Libradoet al.,2009)，利用Arlequin 3.1 計(jì)算藏羚青海種群和新疆種群之間基于Y 染色體的遺傳分化指數(shù)(FST)(Excoffieret al.,2005)。

2 結(jié)果

2.1 藏羚Y染色體特異性引物篩選

經(jīng)篩選，30 對(duì)牛科動(dòng)物多態(tài)性Y-SNP 位點(diǎn)引物中，有16 對(duì)引物在藏羚中具有擴(kuò)增條帶，其中11 對(duì)為藏羚Y 染色體特異性引物(表1)，部分引物擴(kuò)增條帶電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 藏羚Y染色體特異性引物信息表Table 1 Tibetan antelope Y chromosome specific primer information table

圖1 藏羚SRYOY1 位點(diǎn)PCR 擴(kuò)增條帶.M：Marker；♂：雄性樣品；♀：雌性樣品；CK：空白對(duì)照Fig.1 SRYOY1 locus PCR amplification bands of Tibetan antelope.M:Marker;♂:Male samples;♀:Female sample;CK:Control check

2.2 藏羚Y染色體遺傳多樣性分析

使用藏羚雄性特異性引物對(duì)混池DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至測(cè)序公司測(cè)序，結(jié)果顯示：SRY6、SRYOY1、SRY4、AMELY4、ZFY2、AMELY3、DDX3Y7、DDX3Y、USP9Y、UTY19、ZFY3等11 對(duì)引物獲得的有效測(cè)序基因長(zhǎng)度分別為452 bp、551 bp、791 bp、607 bp、546 bp、801 bp、262 bp、143 bp、423 bp、237 bp、587 bp；11個(gè)基因片段中AMELY3和SRYOY1兩個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性。AMELY3在723 堿 基 處 存 在C ＞T 轉(zhuǎn) 換 突 變；SRYOY1在167 堿基處存在G ＞A 轉(zhuǎn)換突變。使用AMELY3及SRYOY1兩對(duì)引物對(duì)藏羚雄性樣品進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，AMELY3測(cè)序結(jié)果包含2 個(gè)單倍型，其中g(shù).723 T 僅在一個(gè)樣品中出現(xiàn)，為稀有單倍型，基于AMELY3位點(diǎn)計(jì)算得到藏羚Y染色體單倍型多樣性為0.048±0.045，核苷酸多態(tài)性為0.00006±0.00005；SRYOY1共得到51個(gè)有效樣品測(cè)序結(jié)果，包含2個(gè)單倍型，其中單倍型H1(g.167 G)占總樣品的68.6%，為優(yōu)勢(shì)單倍型，單倍型H2(g.167 A)占總樣品的31.4%；基于SRYOY1位點(diǎn)計(jì)算得到藏羚Y 染色體單倍型多樣性(Hd) 為0.439 ± 0.050，核苷酸多樣性(Pi)為0.0008±0.0004(圖2)。

圖2 藏羚多態(tài)性位點(diǎn)測(cè)序峰圖.a：SRYOY1(g.167 G ＞A)；b：AMELY3(g.723 C ＞T)Fig.2 Sequencing peak map of polymorphic sites in Tibetan antelope.a:SRYOY1(g.167 G ＞A)；b:AMELY3(g.723 C ＞T)

2.3 藏羚父系起源分析

基于SRYOY1測(cè)序結(jié)果，采用最大似然法構(gòu)建雄性藏羚的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)，顯示所有雄性樣品聚為兩個(gè)分支，推斷藏羚種群可能具有兩個(gè)父系起源。基于SRYOY1對(duì)雄性藏羚青海種群和新疆種群Y 染色體種群遺傳分化指數(shù)進(jìn)行計(jì)算得出，F(xiàn)ST為0.6846 ± 0.0389，即兩個(gè)地區(qū)藏羚雄性種群之間已經(jīng)產(chǎn)生了明顯的種群分化。

圖3 基于SRYOY1 位點(diǎn)的最大似然法構(gòu)建雄性藏羚系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).QH：青海樣品；XJ：新疆樣品Fig.3 Maximum Likelihood tree of male Tibetan antelopes based on the sequencing of the SRYOY1 loci.QH: Qinghai samples;XJ: Xinjiang sample

3 討論

研究表明，Y染色體遺傳多樣性顯著低于常染色體和線(xiàn)粒體基因(Hellborget al.,2004)。本研究從30對(duì)?？苿?dòng)物Y染色體多態(tài)性引物中篩選出11對(duì)藏羚雄性特異性引物，共獲得AMELY3和SRYOY1兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。藏羚Y 染色體核苷酸多樣性高于綿羊(Pi=0.00009 ± 0.00005) (Meadowset al.,2004)、建昌馬(Pi=0.00038 ± 0.00008) (劉敏，2021)、中國(guó)馬(Pi=0.000 4) (張欽，2015)、梅花鹿(Pi=0.000 36) (周永娜等，2018) 等哺乳動(dòng)物。藏羚Y染色體單倍型多樣性低于建昌馬(Hd=0.767±0.090)(劉敏，2021)、馬鹿(Hd=0.877)(房瑞新，2021)、梅花鹿(Hd=0.696 80)(周永娜等，2018)、家牦牛(Hd=0.6946 ± 0.0143) (馬志杰，2019)、野生馬鹿(Hd=0.865) (房瑞新，2021)、野牦牛(Hd=0.8214 ± 0.1007) (馬志杰，2019) 等哺乳動(dòng)物。提示藏羚Y 染色體核苷酸多樣性較高，單倍型多樣性偏低。基于SRYOY1位點(diǎn)，將來(lái)自青海和新疆的51份樣品分為H1(g.167 G)和H2(g.167 A)兩種單倍型，且兩種單倍型在青海和新疆兩地的樣品中均有出現(xiàn)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)提示現(xiàn)有的藏羚種群可能具有2個(gè)父系起源。不同于利用線(xiàn)粒體和常染色體STR 遺傳標(biāo)記顯示的藏羚青海種群和新疆種群間極弱的遺傳分化(Duet al.,2010)，青海藏羚雄性種群與新疆藏羚雄性種群間已經(jīng)產(chǎn)生了顯著的遺傳分化。青海和新疆藏羚種群之間基于不同遺傳標(biāo)記分析得出的遺傳分化程度差異，與雌性藏羚和雄性藏羚不同的遷徙行為有很大的關(guān)系。三江源國(guó)家公園可可西里園區(qū)的太陽(yáng)湖—卓乃湖一帶是青海、新疆及西藏雌性藏羚種群共同的重要產(chǎn)羔地(劉務(wù)林，2008)，由此在產(chǎn)羔期帶來(lái)的混群效應(yīng)及基因流(Zhanget al.,2013)在一定程度上弱化了不同地理種群間的遺傳差異，再加上線(xiàn)粒體基因?yàn)槟赶颠z傳，因此在基于常染色體和線(xiàn)粒體遺傳標(biāo)記分析藏羚不同地理種群間的遺傳分化時(shí)，其分化程度較弱；而雄性藏羚不參與或者不完全參與雌性藏羚的產(chǎn)羔遷徙行為(Schalleret al.,1998,2006)，地理隔離效應(yīng)顯著，使得兩個(gè)地區(qū)基于Y 染色體遺傳標(biāo)記的雄性藏羚種群遺傳分化顯著。

基于以上認(rèn)識(shí)，本研究在藏羚中發(fā)現(xiàn)2 個(gè)YSNP 位點(diǎn)具有多態(tài)性，分別為AMELY3(g.723 C ＞T)和SRYOY1(g.167 G ＞A)，最大似然樹(shù)提示藏羚可能有2個(gè)父系起源。Y染色體遺傳多樣性分析顯示藏羚具有較低的Y 染色體單倍型多樣性(Hd=0.439 ± 0.050) 和較高的Y 染色體核苷酸多樣性(Pi=0.0008±0.0004)，青海藏羚雄性種群與新疆藏羚雄性種群間已經(jīng)產(chǎn)生了顯著的遺傳分化，提示藏羚的保護(hù)依然任重道遠(yuǎn)，跨區(qū)域的物種保護(hù)勢(shì)在必行，且從另一個(gè)層面提示我們今后對(duì)野生動(dòng)物種群遺傳多樣性的評(píng)價(jià)中需提高對(duì)性染色體的關(guān)注。