陶海萍 李雙 賈功雪 張璐瑤 方有貴 陳永偉 楊其恩*

(1 中國科學(xué)院西北高原生物研究所，中國科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進化重點實驗室，西寧810001)(2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)(3 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物學(xué)院生物技術(shù)國家重點實驗室，北京100193)(4 中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海省動物基因組學(xué)重點實驗室，西寧810001)(5 瑪多縣農(nóng)牧綜合服務(wù)中心，果洛813599)(6 青海省畜牧總站，西寧 810008)

低氧是以青藏高原為代表的高海拔低氣壓環(huán)境的顯著特征之一。短期的低氧應(yīng)激可在細胞和器官水平激活多種復(fù)雜途徑，以促進機體氧穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)(Bogdanovaet al.,2016;Patelet al.,2018)，而長期的低氧脅迫則對人和非習(xí)服動物的心肺系統(tǒng)(Jinet al.,2009；馮恩志等，2014)、消化系統(tǒng)(杜繼曾和張家興，2004)、免疫系統(tǒng)(程守科等，2001)和生殖系統(tǒng)(廖衛(wèi)公等，2006)等產(chǎn)生顯著持續(xù)的負影響，進而引起多種代謝疾病的發(fā)生。低氧暴露還會通過代際效應(yīng)影響小鼠后代胚胎發(fā)育、基因表達和精子發(fā)生(Taoet al.,2022;Li and Yang,2022)。研究低氧生理對深入了解動物適應(yīng)進化和低氧引起的病理過程有重要的意義。

肝臟是維持全身穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)合成、糖脂代謝、凝血因子合成和解毒等多種活動的中樞器官(Madrigal-Santillánet al.,2014;Wattet al.,2019)，而這些生物代謝過程均需要大量的氧氣攝入來發(fā)揮正常功能。同時，由于血液供應(yīng)的特殊性，肝臟內(nèi)形成的氧分壓呈梯度代謝，導(dǎo)致肝臟對缺氧損害極為敏感(榮黎等，2009)。供氧不足可能會直接引起多種肝臟疾病的發(fā)生(Nath and Szabo,2012)。缺氧是肝癌發(fā)生所有階段的關(guān)鍵微環(huán)境因素，因為缺氧影響肝臟中的所有細胞類型(Yuen and Wong,2020)。由于缺氧使肝細胞損害，導(dǎo)致肝細胞充血、水腫和脂肪變性，高原肝病患者均存在不同程度的肝腫大和肝功能異常，高原地區(qū)脂肪肝發(fā)病率也高于平原地區(qū)(榮黎等，2009)。動物實驗表明，低壓低氧可引起大鼠、狗的肝臟損傷(Reedet al.,1964;Shinguet al.,1982)。慢性低氧通過引起肝臟血管內(nèi)皮細胞功能紊亂，引起大鼠發(fā)生肝纖維化和非酒精性脂肪肝(Hernández-Bustabadet al.,2022)。肝臟遭受缺氧損傷后主要表現(xiàn)為肝細胞及其線粒體腫脹和死亡等形態(tài)學(xué)改變以及與代謝功能相關(guān)酶的變化(杜繼曾和李慶芬，1982)。既往研究認為凋亡相關(guān)基因p53、fas、cjun、Bcl-2等參與了缺氧所誘導(dǎo)的肝細胞凋亡，也有研究表明Hif-1α有促凋亡作用，Hif-1α可通過上調(diào)促凋亡蛋白P53、BNIP3、Noxa等的表達水平引起細胞凋亡(Piretet al.,2002;Cursioet al.,2008;Yuen and Wong,2020;Xionget al.,2020)。目前低氧引起肝臟損傷機制的研究主要集中于急性或慢性低氧暴露后親本的肝臟損傷，但由于生物體對高原低氧環(huán)境具有適應(yīng)性，這些損傷是否繼續(xù)影響子代肝功能，仍然未知。

本研究通過建立高原低氧暴露(海拔3 220 m)小鼠模型，對低氧處理小鼠及其后代肝功能和血液生化等項目進行檢測，分析低氧脅迫對小鼠及其子代肝臟功能的影響。同時，通過對低氧小鼠及其子代肝臟進行轉(zhuǎn)錄組測序及分析，探究動物肝臟基因表達調(diào)控對低氧暴露的應(yīng)激與適應(yīng)機制。

1 研究方法

1.1 實驗動物

8 周齡健康ICR 小鼠，購自北京維通利華實驗動物中心。動物實驗經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生物研究所動物倫理與福利委員會批準。

1.2 動物分組和處理

經(jīng)過1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，將小鼠隨機分為常氧對照組和低氧處理組。常氧對照組(常氧第0～5代)飼養(yǎng)于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)(北緯40°01′44″，東經(jīng)116°17′04″，海拔51 m)，低氧處理組(低氧第0～ 5 代)飼養(yǎng)于中國科學(xué)院海北高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)定位站(北緯37°32′50″，東經(jīng)101°24′27″，海拔3 220 m)。將雌雄小鼠合籠交配，繁殖子代(第1～5代)飼養(yǎng)至成年(18周齡)。各組均采用標準化飼養(yǎng)設(shè)施，環(huán)境溫度控制在20℃～25℃，濕度50%～60%，光控條件晝、夜各12 h，自由取食飲水。

1.3 樣品收集和處理

常氧和低氧第0～ 5 代雄性小鼠飼養(yǎng)至18 周，稱重后頸椎脫臼處死，取心、肝和肺稱重(精確到0.1 mg)。器官比重=器官重/體重×100；右心指數(shù)=右心室重/ (左心室重+室間隔重) (Chenet al.,2019)。使用4%多聚甲醛固定部分肝臟組織，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后用于組織形態(tài)學(xué)分析。使用無抗凝劑采血管收集血液，靜置20 min 后以4 000 r/min離心15 min，收集血清并使用自動生化分析儀(Cobas 513/1730-01)檢測血液生化指標。

1.4 組織形態(tài)學(xué)分析

將石蠟組織塊切成4 μm 的切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇梯度復(fù)水后，使用HE(南昌雨露實驗器材有限公司，YLYLSMJ-001)染色，自來水沖洗，晾干后使用封片劑(中性樹膠與二甲苯1∶1 混合)封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)，每組5個重復(fù)。

1.5 葡萄糖和胰島素耐量試驗

為驗證肝臟代謝功能的恢復(fù)程度，分別對3組小鼠(常氧第0 代、低氧第0 代和低氧第1 代)進行葡萄糖耐量試驗(glucose tolerance test,GTT) 和胰島素耐量試驗(insulin tolerance test,ITT) 來觀察機體血糖變化的敏感性。3 組雄性小鼠飼養(yǎng)至18 周，斷糧12 h 后稱重，并依體重注射2 mg/g 的葡萄糖(Sigma-G-6152) 或0.75 IU/g 的胰島素(Sigma-I2643)試劑。于注射葡萄糖后0 min、15 min、30 min、60 min 和120 min 時，分別由尾靜脈取血，使用血糖儀檢測血糖濃度。眼球采血，并以4 000 r/min離心15 min 取血清，使用小鼠胰島素ELISA 試劑盒(江蘇酶標生物科技有限公司，MB-3315A)測定血清胰島素濃度。于注射胰島素后0 min、30 min、60 min、90 min和120 min時，分別由尾靜脈取血，使用血糖儀檢測血糖濃度。每個樣本技術(shù)重復(fù)2次。

1.6 肝臟轉(zhuǎn)錄組分析

為探究高原低氧暴露對小鼠肝臟基因表達的影響，利用RNA-seq 對3 組小鼠肝臟的基因表達進行分析。每組(常氧第0 代、低氧第0 代和低氧第1 代)各取部分肝臟組織，隨后使用PBS 溶液沖洗干凈表面血液并加入1 mL TRIzol (ThermoFisher,15596026)試劑，凍存于液氮中。采用酚氯仿法提取總RNA，使用NanoPhotometer? 分光光度計(IMPLEN,CA,USA)、Qubit?3.0 Flurometer (Life Technologies,CA,USA) 和安捷倫2100 RNA Nano 6000 Assay Kit (Agilent Technologies,CA,USA) 對樣品進行質(zhì)檢，質(zhì)檢標準為OD260/280 ≥1.8，OD260/230 ≥1.8，25S/18S ≥1.5，RIN 完整性接近10。通過Oligo (dT) 磁珠富集純化，將得到的mRNA隨機打斷進行PCR，構(gòu)建cDNA文庫。將文庫稀釋至1 ng/μL，RT-PCR 對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度＞10 nmol/L)。將構(gòu)建的文庫送至安諾優(yōu)達基因科技(北京) 有限公司使用Illumina 平臺進行雙端測序。原始下機數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后比對到小鼠參考基因組mm10，使用HTSeq軟件統(tǒng)計每個基因的reads 數(shù)后使用FPKM 法計算基因表達量。使用DESeq2 軟件進行差異表達分析，差異表達基因篩選閾值為|log2(Fold Change)| ≥1 和P＜0.05。使用DAVID 軟件對差異基因進行GO 和KEGG富集分析。每組3個重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。低氧和常氧小鼠體重、右心比重、肺臟比重和肝臟比重均采用獨立樣本t檢驗分析，肺臟比重和肝臟比重數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，因此在t檢驗前在EXCEL中使用公式“=DEGREES(ASIN(SQRT(原變量)))”對數(shù)據(jù)進行反正弦轉(zhuǎn)換；血液生化指標、MAPK相關(guān)基因mRNA FPKM表達量、血糖和胰島素濃度均采用單因素方差分析和多重比較對數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果以平均值± 標準差(mean ± SD) 表示，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

本文常氧第0～5代所有數(shù)據(jù)均無顯著性差異，高原低氧脅迫對低氧第1代小鼠肝功能的影響最嚴重，且從低氧第2 代開始出現(xiàn)恢復(fù)，因此結(jié)果2.3～ 2.5 中均以常氧第0 代作為對照組，低氧第0代和低氧第1代作為處理組。

2 結(jié)果

2.1 高原低氧暴露對小鼠體重及器官比重的影響

低氧第0 代(0.39 ± 0.02vs.0.33 ± 0.01,P＜0.05)、第1 代(0.41 ± 0.01vs.0.33 ± 0.01,P＜0.01) 和 第2 代(0.45 ± 0.02vs.0.37 ± 0.02,P＜0.05)的右心指數(shù)均顯著高于常氧第0 代。證實了高原低氧暴露后，低氧小鼠模型的有效性(圖1A)。高原低氧會導(dǎo)致成年小鼠體重下降，與常氧第0代(41.38 g ± 0.47 g) 和第1 代(41.17 g ± 0.42 g) 相比，低氧第0代體重(39.94 g±0.50 g)和低氧第1代體重(39.56 g ± 0.64 g) 分別顯著下降了3.5%和4.0% (P＜0.05) (圖1B)。另外，低氧脅迫使肺臟比重在第0 代和第1 代顯著增加了13.99%(0.72%± 0.03%vs.0.63% ± 0.02%,P＜0.05) 和29.80% (0.82% ± 0.80%vs.0.63% ± 0.02%,P＜0.05)(圖1C)。低氧小鼠體重和肺臟比重從低氧第2 代開始有恢復(fù)至常氧小鼠的趨勢。與肺臟不同，低氧組的肝臟比重從第0 代至第3 代都顯著高于常氧 組10% 以 上 (5.49% ± 0.12%vs.4.94% ±0.16%;5.39% ± 0.12%vs.4.67% ± 0.30%;5.42% ± 0.24%vs.4.72% ± 0.19%;5.26% ±0.22%vs.4.56% ± 0.23%,P＜0.05)，第4 代和第5代恢復(fù)至常氧組(圖1D)。

圖1 高原低氧環(huán)境對小鼠體重及器官比重的影響.右心指數(shù)(A)、18周體重(B)、肺臟比重(C)和肝臟比重(D). n=9.*P ＜0.05，**P ＜0.01Fig.1 Effects of plateau hypoxic environment on body weight and organ proportion of mice.Right heart index (A),body weight at 18 weeks (B),lung specific gravity(C)and liver specific gravity(D). n=9.*P ＜0.05,**P ＜0.01

2.2 高原低氧暴露對小鼠肝臟組織形態(tài)的影響

肝臟HE 染色如圖2，常氧小鼠(第0～ 5 代)肝細胞圍繞中央靜脈均勻分布，細胞間界限非常清晰。而經(jīng)低氧暴露后，低氧第0 代小鼠肝細胞結(jié)構(gòu)開始紊亂，局部肝細胞發(fā)生腫脹，中央靜脈和肝索間出現(xiàn)大量紅細胞浸潤(圖2 中黃色箭頭)。在低氧第1代中，肝臟組織形態(tài)變化更為明顯，肝細胞界限明顯紊亂，出現(xiàn)大量腫脹的肝細胞，肝索間紅細胞顯著增多，肝小葉內(nèi)可見脂滴空泡(圖2 中綠色三角)。低氧第2 代至第5 代，肝臟組織形態(tài)逐漸恢復(fù)，但中央靜脈和肝索間仍可見紅細胞。

圖2 高原低氧環(huán)境對小鼠肝臟組織形態(tài)的影響.常氧和低氧第0～5代肝臟HE染色代表性圖.標尺=15 μm.紅細胞浸潤(黃色箭頭)，肝小葉內(nèi)脂滴空泡(綠色三角)Fig.2 Effects of plateau hypoxic environment on liver tissue morphology of mice.Representative images of HE staining of normoxic and hypoxic livers from generation 0 to generation 5.Scale bars represent 15 μm.Red blood cell infiltration(yellow arrow),intralobular lipid vacuoles(green triangle)

2.3 高原低氧暴露對小鼠血液生化指標的影響

低氧第0 代的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)(93.00 U/L±7.55 U/L)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST) (283.67 U/L ±40.38 U/L)濃度均顯著高于常氧第0代(46.33 U/L±2.52 U/L;132.67 U/L± 3.51 U/L,P＜0.05)，在低氧第1代中ALT濃度明顯降低(70.00 U/L±8.89 U/L)，但AST 濃度提高(385.00 U/L±111.67 U/L)，這證實了肝臟細胞損傷的發(fā)生(圖3A、B)。此外，血清白蛋白、球蛋白、總膽紅素和總膽固醇等指標均在低氧第0 代中下降，且分別降低了21.6%、27.3%、63.5%和29.0%，但是在低氧第1 代中出現(xiàn)回升，除血清白蛋白指標外，其他3項同對照組相比降低不顯著(圖3C～F)。

圖3 高原低氧環(huán)境對小鼠血液生化指標的影響.谷丙轉(zhuǎn)氨酶(A)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(B)，白蛋白(C)，球蛋白(D)，總膽紅素(E)，總膽固醇(F). n=3.不同字母代表各組間有顯著性差異(P ＜0.05)Fig.3 Effects of plateau hypoxic environment on biochemical indexes of mice.Alanine aminotransferase (ALT) (A),aspartate aminotransferase(AST) (B),albumin (C),globulin (D),total bilirubin (E),total cholesterol (F). n=3.Bars with different letters were significantly different (P ＜0.05)

2.4 高原低氧暴露對小鼠血糖和胰島素水平的影響

空腹12 h 后，3 組的基礎(chǔ)血糖值基本保持一致(4.37 mmol/L ± 0.74 mmol/L,5.58 mmol/L ±0.22 mmol/L,5.6 mmol/L± 1.85 mmol/L) (圖4A)，表明3組小鼠在饑餓刺激下具備類似的血糖代償能力。注射葡萄糖后，常氧第0 代小鼠血糖濃度在15 min時增高了428%，在之后2 h內(nèi)回落至基礎(chǔ)血糖值(5.35 mmol/L ± 0.75 mmol/L)；注射胰島素后，常氧第0 代小鼠血糖值在30 min 時降低至1.97 mmol/L± 0.33 mmol/L，在之后的2 h 內(nèi)未恢復(fù)；然而低氧第0 代和低氧第1 代小鼠的血糖濃度在2 h 內(nèi)均未出現(xiàn)明顯波動，說明低氧暴露后小鼠的葡萄糖耐受能力和胰島素敏感性均大幅減弱。血清ELISA試驗結(jié)果也證明了上述結(jié)論(圖4B)。

圖4 高原低氧環(huán)境對小鼠血糖水平和胰島素水平的影響.GTT 血糖濃度(A)，GTT血清胰島素水平(B)和ITT血糖濃度(C). n=3.不同字母代表各組間有顯著性差異(P ＜0.05)Fig.4 Effects of plateau hypoxic environment on blood sugar and insulin levels of mice.GTT blood glucose concentration(A),GTT serum insulin level(B),ITT blood glucose concentration(C). n=3.Bars with different letters were significantly different(P ＜0.05)

2.5 高原低氧暴露小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

小鼠常氧第0 代、低氧第0 代和低氧第1 代兩兩比對差異表達基因數(shù)量，分別為：低氧第0 代與常氧第0 代相比較，230 個基因下調(diào)，922 個基因上調(diào)(圖5A、D)；低氧第1 代與常氧第0 代相比較，246 個基因下調(diào)，769 個基因上調(diào)(圖5B、E)；低氧第1 代與低氧第0 代相比較，68 個基因下調(diào)，121 個基因上調(diào)(圖5C、F) (P＜0.05)。通過繪制維恩圖統(tǒng)計低氧第0 代和低氧第1 代獨有的差異基因，分別是660個和491個(圖6A)。通過差異表達基因KEGG 通路分析，發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境暴露后，對肝臟的影響主要集中在MAPK、細胞因子受體相互作用、脂肪酸代謝、TNF 信號通路、抗原呈遞和胰島素抵抗等信號通路(圖6B～D)。

圖5 低氧和常氧小鼠肝臟差異表達基因分析.低氧第0代vs. 常氧第0代，低氧第1代vs. 常氧第0代和低氧第1代vs. 低氧第0代差異表達基因數(shù)量(A～C)和熱圖(D～E)Fig.5 The differentially expressed gene analysis of mice liver in Hypoxic group and Normoxic group.Numbers of differentially expressed gene(AC)and Heatmap(D-E)of Hypoxic generation 0 vs. Normoxic generation 0,Hypoxic generation 1 vs. Normoxic generation 0 and Hypoxic generation 1 vs. Hypoxic generation 0

另外，低氧第0 代和低氧第1 代共有的差異表達基因共有459 個(圖6A)，這些基因主要與凋亡、脂質(zhì)代謝、蛋白磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和MAPK 級聯(lián)調(diào)控等生物學(xué)過程密切相關(guān)(圖7A)。對低氧第1 代特有的46 個差異表達基因進行GO 分析，這些差異基因主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運的調(diào)控、脂質(zhì)代謝、白細胞激活等生物學(xué)過程相關(guān)(圖7B)。低氧暴露導(dǎo)致MAPK 信號通路激活，隨低氧暴露時間延長，與MAPK 信號通路相關(guān)的基因：Madd、Map4k2、Tab1、Fgfr1、Mapk12、Ccl25和Map2k6顯著上調(diào)(P＜0.05)(圖7C)。

圖7 低氧小鼠肝臟差異基因表達分析.低氧第0 代與低氧第1 代差異表達基因的GO 分析(A，B)，MAPK 信號通路相關(guān)基因的mRNA FPKM表達量(C).不同字母代表各組間有顯著性差異(P ＜0.05)Fig.7 Effects of exposure to high altitude hypoxia on next generation liver.GO analysis of differentially expressed gene between Hypoxic generation 0 and Hypoxic generation 1(A,B),mRNA FPKM expression level of genes related to MAPK signaling pathway(C).Bars with different letters were significantly different(P ＜0.05)

3 討論

高原地區(qū)資源豐富，但環(huán)境惡劣，非習(xí)服動物長期生活在高原環(huán)境面臨低壓性缺氧問題。本研究通過在高海拔環(huán)境(3 220 m)建立低氧小鼠模型，發(fā)現(xiàn)長期低氧環(huán)境暴露后，低氧組小鼠肝臟比重增加，肝細胞腫脹，肝索間紅細胞浸潤；AST和ALT 水平顯著上升，肝功能紊亂，并且這種影響在子一代加劇。除上述損傷外，低氧組親代和子代的差異基因顯著富集在MAPK、細胞凋亡、脂質(zhì)代謝和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等信號通路。

肝臟不僅是能量代謝的關(guān)鍵決定器官，也是排泄毒物的重要器官(Corless and Middleton,1983)。本研究小鼠在受到低氧脅迫后肝細胞膜通透性及結(jié)構(gòu)完整性受到破壞，AST 和ALT 從細胞中溢出至血液，血清中AST 和ALT 含量升高。此結(jié)果與低氧環(huán)境下大鼠(Liet al.,2014) 和牦牛(Liuet al.,2015)血清中ALT 和AST 活力均上升的研究結(jié)果一致。通常根據(jù)血清中這兩種轉(zhuǎn)氨酶的活性變化判斷肝臟等組織器官的功能狀況，它們被認為是反映肝細胞損傷的金標準(李永慧等，2016)。正常情況下血液中ALT 和AST 參與小鼠機體蛋白質(zhì)代謝和能量轉(zhuǎn)換，在機體肝組織出現(xiàn)損傷和病變時，兩者的穩(wěn)態(tài)被打破，呈現(xiàn)快速上升的趨勢，此為適應(yīng)低氧和寒冷的環(huán)境，蛋白質(zhì)代謝率加強導(dǎo)致。另外，結(jié)合本研究低氧組肝臟組織切片中肝細胞出現(xiàn)脂肪變性和肝細胞腫脹的結(jié)果，推斷高原環(huán)境低氧暴露可能破壞了小鼠脂質(zhì)代謝過程，并誘發(fā)肝臟組織損傷。血清中的蛋白質(zhì)承擔(dān)著動物體免疫功能和正常生理的維持作用，其中血清白蛋白和球蛋白是與物質(zhì)運輸、能量供給和免疫力相關(guān)的兩種重要蛋白質(zhì)。本研究中這兩種蛋白的水平隨低氧暴露時間增加呈現(xiàn)先降低后升高趨勢，暗示低氧暴露小鼠在低氧第1代時損傷加劇，對肝臟物質(zhì)代謝和免疫系統(tǒng)影響加劇。

針對低氧導(dǎo)致的機體葡萄糖穩(wěn)態(tài)，本研究主要從糖耐量和胰島素敏感性來進行探討。糖耐量試驗已成為檢測血糖耐受和胰島素分泌最廣泛應(yīng)用的生理測試之一，與常氧組相比，低氧組在注射葡萄糖和胰島素后2 h 內(nèi)血糖無顯著波動，由此可見，低氧暴露小鼠出現(xiàn)糖耐量異常的現(xiàn)象。另外，低氧組胰島素水平顯著低于對照組，2 h 內(nèi)無明顯波動，說明胰島素已經(jīng)不能充分發(fā)揮其正常生理功能，可以確定已出現(xiàn)胰島素抵抗的現(xiàn)象。差異表達基因的KEGG 通路圖分析發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗受影響。胰島素抵抗作用導(dǎo)致機體血糖代謝進入惡性循環(huán)中。機體出現(xiàn)胰島素抵抗，胰腺β細胞分泌更多胰島素，高胰島素反過來進一步加重胰島素抵抗，胰島素抵抗和高胰島素血癥是2型糖尿病發(fā)病的基礎(chǔ)，也是代謝綜合征等疾病發(fā)生的重要根源(Tianet al.,2016)。另外，高原低氧暴露也影響了絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase,MAPK)信號通路。MAPK和氨基末端激酶 (phosphorylated Jun N-terminal kinases,JNK)在功能上相似，兩者的激活均具有負調(diào)控作用，導(dǎo)致細胞損傷和死亡(Cargnello and Roux,2011;Kanget al.,2017)。我們挖掘與MAPK 通路相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)Madd、Map4k2、Tab1、Fgfr1、Mapk12、Ccl25和Map2k6等的表達量顯著上調(diào)。其中CC 趨化因子受體9 (CC chemokine receptor 9,Ccr9) 是CC 趨化因子配體25 (CC chemokine ligand,Ccl25) 的獨特受體，主要表達于淋巴細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞(Vicariet al.,1997;Zaballoset al.,1999)。Ccr9介導(dǎo)炎性細胞趨化，參與炎性疾病的病理進展，Ccl25或Ccr9與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)(Chenet al.,2012)。Ccr9敲除小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，心肌梗死小鼠心臟中Ccl25和Ccr9表達量顯著上調(diào)，Ccr9通過NF-κB 和MAPK 信號通路調(diào)控心肌梗死后的病理進展(Huanget al.,2016)。此結(jié)果與本研究Ccl25在肝臟中的表達量顯著上調(diào)的結(jié)果一致。說明低氧暴露導(dǎo)致肝功能受損，同時也將影響心臟功能。

低氧誘導(dǎo)因子1(Hif-1)是從低氧的肝癌細胞株核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可誘導(dǎo)細胞對低氧微環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)并激活低氧反應(yīng)基因(ke and Costa,2006)。Hif-1由氧調(diào)節(jié)的Hif-1α亞基和組成型表達的Hif-1β亞基組成。在常氧條件下，Hif-1α通過依賴氧的泛素化作用持續(xù)降解，從而保持低濃度的Hif-1α。缺氧時，氧依賴性降解途徑被抑制，Hif-1α與Hif-1β形成二聚體并進入細胞核與靶基因的缺氧反應(yīng)元件(Hypoxia response element,HRE) 結(jié)合，從而使細胞在缺氧狀態(tài)下存活(Troeger and Schwabe,2011;Nath and Szabo,2012)。最近研究顯示，MAPK 參與了Hif-1α活性的調(diào)節(jié)(Myloniset al.,2008;Wanget al.,2013)。像其他應(yīng)激源一樣，缺氧也可激活p38 (p38α，p38β，p38δ，p38γ)信號通路，這是MAPK 超家族的一部分。

在小鼠低氧第1 代特有的差異表達基因的GO通路分析中發(fā)現(xiàn)，低氧影響了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能。研究發(fā)現(xiàn)缺氧、缺血、氧化應(yīng)激、熱休克、過量游離脂肪酸(脂肪毒性) 和營養(yǎng)過剩等應(yīng)激條件，可改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致肝血腦屏障內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS) (Henne,2019)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致肝細胞凋亡，這也是嚴重肝臟疾病的一個標志(Huanget al.,2014)。為了減輕ERS，機體激活了未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR) 信號通路(Riuset al.,2017)。適應(yīng)性UPR 可以保護細胞免受應(yīng)激和重建細胞穩(wěn)態(tài)；然而，持續(xù)的ERS 和UPR 激活促進細胞死亡(Xionget al.,2020)。大量證據(jù)表明，UPR 和ERS 參與肝臟并發(fā)癥的各種病理過程(Lebeaupinet al.,2018;Lukaset al.,2019)。此外，缺氧被認為是激活ERS相關(guān)通路的重要應(yīng)激源(Houet al.,2017)。值得注意的是，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)和UPR 的破壞所激活的信號通路與凋亡密切相關(guān)(Song and Malhi,2019)，這與GO分析中細胞凋亡通路受影響結(jié)果一致。

綜上所述，本文在高海拔環(huán)境建立低氧小鼠模型，發(fā)現(xiàn)長期處于低氧環(huán)境會引起親代和子代肝臟組織受損，引起MAPK 和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路受阻，肝細胞凋亡，引發(fā)炎癥損傷，導(dǎo)致肝功能受影響。因此，本研究對高海拔肝病患者的子代遺傳研究具有重要的借鑒意義。