孫海燕, 田 蕓, 郝丹青, 王 瑞, 裴金金, 陳 琛, 李新生,2
(1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中 723000; 2.陜西理工大學(xué)/陜西省資源生物重點(diǎn)實驗室,陜西漢中 723000;3.國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心秦巴地區(qū)保鮮工作站,陜西漢中 723000;4.貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院,貴州貴陽 550000)
天麻(Bl.)又稱赤箭、離母、神草等,屬于蘭科植物,廣泛分布于秦巴山區(qū),是一種傳統(tǒng)的名貴中藥材。天麻的主要有效成分是天麻素及其苷元、天麻多糖,對頭痛失眠等癥狀有較好的治療作用。目前,天麻主要作為藥材使用,在市面上以干品居多,新鮮樣品較少,這是因為天麻的采收時間較短,新鮮天麻容易潰爛,不易保鮮,一般僅可自然放置5~7 d。傳統(tǒng)的天麻貯藏大多采用保鮮劑、真空包裝、低溫冷藏等方法,在一定程度上可以延長天麻的保鮮時間。目前,國內(nèi)外對天麻保鮮的研究較少,國內(nèi)已有的報道主要集中于鮮食天麻貯藏工藝及鮮食天麻與傳統(tǒng)干制天麻貯藏方法的比較,也有一些報道是關(guān)于天麻失質(zhì)量率、可食率、口感、硬度、色度等進(jìn)行的研究。至今,天麻軟化相關(guān)酶是否會影響其后續(xù)保鮮效果尚仍不清楚。天麻在采收后仍具有活性,在其貯藏期間會逐漸軟化,活性物質(zhì)會被降解,不利于保鮮;天麻軟化是一個非常復(fù)雜的發(fā)育調(diào)控過程,包含一些生理生化反應(yīng),包括細(xì)胞壁的降解、內(nèi)含物的變化、呼吸速率的變化等,可能有多種軟化相關(guān)酶參與調(diào)控。果膠裂解酶(PL)是一種通過降解果膠使果實軟化的酶,可以隨機(jī)裂解高等植物的中膠層和初生細(xì)胞壁,主要功能是在果實成熟過程中參與果膠結(jié)構(gòu)的裂解以達(dá)到軟化果實的目的;果膠甲酯酶(PME)能夠催化細(xì)胞壁中多聚半乳糖醛酸的脫甲酯化,可以使植物細(xì)胞壁中的果膠多糖降解;過氧化物酶(POD)隸屬于氧化還原酶類,廣泛分布于大自然中,是造成植物木質(zhì)化的關(guān)鍵酶之一;木瓜蛋白酶主要存在于番木瓜中,是一種催化活性很強(qiáng)的蛋白水解酶;組織蛋白酶是蛋白酶類的一種,其主要功能是降解蛋白質(zhì)。
本研究所用天麻取自陜西省漢中市南鄭縣青樹鎮(zhèn),采收當(dāng)天運(yùn)回實驗室,篩選無損傷且大小均一的天麻。成熟天麻為黃褐色塊莖,取新鮮天麻,清洗干凈后切成塊狀,采用茶多酚涂膜、超高壓處理、茶多酚涂膜+超高壓處理3種方式處理,用聚乙烯保鮮袋保存于4 ℃冰箱中,以備后續(xù)試驗使用。本試驗以3種不同處理方式處理的天麻樣品為材料,首先進(jìn)行表型分析,然后提取樣品RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后用qPCR檢測天麻軟化調(diào)控相關(guān)酶的表達(dá)規(guī)律,為進(jìn)一步從分子水平揭示天麻軟化機(jī)制和保鮮效應(yīng)奠定研究基礎(chǔ)。
2019年3月于陜西省漢中市略陽縣采挖新鮮天麻,當(dāng)天運(yùn)回實驗室后,用清水清洗、晾干、去皮后切成1 cm厚的片狀,用3種不同方式處理(茶多酚涂膜、超高壓、茶多酚涂膜+超高壓)后,各個處理均稱取(250±2) g裝入聚乙烯塑料袋中,封口后存放于4 ℃冰箱中。
總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)、qPCR試劑盒、SYBR Premix Ex[寶生物工程(大連)有限公司,TaKaRa];三氯甲烷、異丙醇、75%冷乙醇、焦碳酸二乙酯(DEPC)水[上??评噭┯邢薰綸;TRIzol(西安熱默爾生物科技有限公司)。PCR擴(kuò)增儀(美國伯樂公司)、恒溫水浴鍋(上海精密儀器儀表有限公司)、離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)、電子分析天平(奧豪斯公司)、蛋白核酸分析儀(美國Thermo公司)、電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備公司)、凝膠成像(英國Syngene公司)等。
1.3.1 樣品處理 選取新鮮天麻,分別用3種方式(茶多酚涂膜、超高壓、茶多酚涂膜+超高壓)進(jìn)行處理。(1)茶多酚涂膜。在新鮮天麻表面均勻噴涂1.5%茶多酚保鮮液,陰涼避光處晾干后,裝入聚乙烯袋中保存。(2)超高壓處理。將新鮮天麻裝入聚乙烯袋中,封口后在20 ℃、300 MPa條件下超高壓處理10 min。(3)茶多酚涂膜+超高壓處理。在新鮮天麻表面均勻噴涂1.5%茶多酚保鮮液后,于陰涼避光處晾干,再將其裝入聚乙烯袋內(nèi),封口后在20 ℃、300 MPa條件下超高壓處理10 min。
1.3.2 取樣及表型觀察 每7 d取樣1次,每次取出2片鮮切天麻,觀察樣品表型差異并拍照記錄。再將樣品切成小塊,用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中。
1.3.3 RNA的提取 提取用不同方式處理的天麻樣品RNA的具體步驟如下:(1)取2 mL離心管,加入1 mL TRIzol,將試驗樣品和研缽(160 ℃滅菌)從-80 ℃冰箱中取出,先向研缽中加入液氮預(yù)冷,再將樣品放入研缽中研磨,邊研磨邊補(bǔ)充液氮,研磨至粉末狀,用藥匙將粉末加入離心管中,做好標(biāo)記;(2)室溫靜置10 min使粉末充分裂解,于12 000 r/min、4 ℃ 離心10 min,去除組織碎片,小心吸取上清(紅色)至新的2 mL離心管中;(3)向離心管中加入 200 μL 三氯甲烷(TRIzol體積的1/5),蓋緊離心管蓋,劇烈振蕩15 s,待液體充分乳化后,冰上靜置 5 min,于12 000 r/min、4 ℃離心15 min;(4)從離心機(jī)中取出離心管,此時勻漿分為3層,上層為無色水相上清(RNA所在層),中間層為白色蛋白層,下層為有機(jī)層,小心吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中并做好標(biāo)記,勿吸取白色中間層;(5)向上清液中加入與上清液等體積的異丙醇,上下輕柔顛倒,于室溫靜置10 min;(6)于12 000 r/min、4 ℃離心10 min;(7)輕輕倒掉上清液,沿離心管壁緩慢加入1 mL 75%預(yù)冷乙醇(提取RNA專用),輕輕上下顛倒洗滌沉淀,于12 000 r/min、4 ℃離心5 min,小心倒掉75%乙醇;(8)室溫下干燥沉淀2~5 min,待乙醇完全揮發(fā)后,加入60 μL DEPC水溶解沉淀;(9)用核酸定量儀測定RNA濃度,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.4 RNA反轉(zhuǎn)為cDNA 參照PrimeScript(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),合成相應(yīng)的cDNA。1 μL gDNA Eraser,2 μL 5×gDNA Eraser Buffer,1 μL樣品RNA,補(bǔ)加Rnase Free dHO至10 μL,于42 ℃水浴2 min,即可得到消除基因組的DNA體系。在上述體系中,加入Reaction solution from Step 1 10 μL,5×Primerscript Buffer 2 4 μL,Primerscripr Mix 1 μL,RT Primer Mix 1 μL,Rnase Free ddHO 4 μL,渦旋混勻,置于PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)程序:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃保存。
1.3.5 引物的設(shè)計 為了篩選天麻中的軟化酶,本研究在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中查閱相關(guān)文獻(xiàn),以了解軟化相關(guān)酶的種類,由于天麻軟化相關(guān)酶基因在NCBI數(shù)據(jù)庫上未見公布,因此選取與其同科植物的相關(guān)基因序列,用BLAST進(jìn)行比對,選取高度保守的序列,結(jié)合引物設(shè)計的原則,用Primer 5.0軟件,每個基因設(shè)計2~3對引物,共設(shè)計22對引物。
1.3.6 通過普通PCR法篩選引物 以cDNA為模板,按照PCR反應(yīng)體系將所需試劑依次加入PCR管中,具體反應(yīng)體系為0.6 μL模板DNA,7.5 μL Mix,0.7 μL上游引物,0.7 μL下游引物,5.5 μL滅菌水,總體積15 μL。反應(yīng)程序為:95 ℃預(yù)變性 2 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,循環(huán)34次;72 ℃ 延伸30 s,72 ℃充分延伸10 min,12 ℃保存。
1.3.7 Real-time qPCR檢測軟化相關(guān)酶編碼基因的mRNA表達(dá)水平 Real-time qPCR的具體操作參照TaKaRa的說明書,每個基因做3個重復(fù),20 μL 反應(yīng)體系:10 μL SYBR,1.6 μL上游引物(10 μmol/L),1.6 μL下游引物(10 μmol/L),2 μL cDNA模板,4.8 μL ddHO。采用兩步法PCR反應(yīng)程序,具體反應(yīng)程序為:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火1 min,循環(huán)50次;95 ℃延伸 15 s,72 ℃充分延伸10 min,12 ℃保存。
用Excel 97-2003進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并分析結(jié)果。
本試驗每隔7 d取樣1次,同時拍照記錄樣品的表型。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),天麻在保鮮過程中的表型變化具有以下特征:(1)天麻在自然條件下(空白對照組)逐漸變軟,顏色由白色變成淡黃色;(2)經(jīng)茶多酚涂膜的天麻顏色與空白組相比差異不顯著,用刀不易切開;(3)經(jīng)過超高壓處理的天麻整體變脆,很容易用小刀切成塊狀,且有汁液流出;(4)用茶多酚涂膜并進(jìn)行超高壓處理的天麻水分較多,取樣后袋中有較多汁狀液體殘余,相較于其他3種處理方式樣品的顏色更深(圖1)。
為了檢測RNA的質(zhì)量,隨機(jī)選取部分RNA樣品,并用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。從圖2可以看出,所有樣品總RNA的28S、18S RNA主峰單一、清晰無降解,說明提取的RNA質(zhì)量較好,可用于后續(xù)研究。
由于在NCBI等數(shù)據(jù)庫中未檢索到天麻軟化相關(guān)酶的編碼基因序列,因此本試驗選取多個與天麻同科或同種植物軟化相關(guān)酶的編碼基因序列,經(jīng)BLAST軟件比對,選取高度保守序列,結(jié)合引物設(shè)計原則,用Primer 5.0工具,每個基因設(shè)計2~3對引物,共設(shè)計22對引物,其中為內(nèi)參基因引物,引物序列見表1。
表1 天麻軟化表達(dá)酶相關(guān)基因引物
用PCR擴(kuò)增后,產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,由圖3、圖4可以看出,只有組織蛋白酶(Cathepsin)和過氧化物酶(POD)擴(kuò)增出相應(yīng)條帶,其他引物均未檢測到條帶。
以空白樣(處理0 d)為對照進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,并繪制成折線圖。由圖5可以看出,28 d前,PL、Cathepsin這2種酶的編碼基因的mRNA水平變化趨勢一致,都是先升后降;PME則前期出現(xiàn)一個快速下降的趨勢;Papain的表達(dá)水平為先升高再降低;POD相對表達(dá)量在處理28 d前與Papain相對表達(dá)
量變化趨勢相似,但在處理28 d后則迅速升高。
本試驗通過qPCR檢測PL基因的mRNA相對表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),PL在所有天麻樣品中都有表達(dá),經(jīng)過茶多酚涂膜的樣品,其PL的相對表達(dá)量明顯低于空白組;用超高壓處理的天麻樣品,在處理14 d時PL的表達(dá)量顯著低于空白組,但是隨著保鮮時間的增加,PL的相對表達(dá)量明顯升高;用茶多酚涂膜+超高壓處理的天麻樣品,在處理14 d時的表達(dá)量極顯著高于空白對照組,并且隨著保鮮時間的增加,其表達(dá)量迅速降低(處理21 d左右),之后有所上升,但表達(dá)水平的變化差異不明顯(表2)。
表2 PL的mRNA相對表達(dá)量
果膠甲酯酶可以降解植物細(xì)胞壁中的果膠,在植物中普遍表達(dá)。在處理時間為14 d時,茶多酚涂膜的天麻樣品中PME的表達(dá)量低于空白對照組,而在處理時間超過35 d后則高于空白對照組;經(jīng)茶多酚涂膜+超高壓處理的樣品在處理前21 d均低于空白對照組,在處理35 d時略有升高;超高壓處理樣品PME的相對表達(dá)量表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(表3)。
表3 PME的mRNA相對表達(dá)量
過氧化物酶具有抗氧化性,經(jīng)qRCR檢測發(fā)現(xiàn),處理14 d時,3種不同處理方式的天麻樣品中POD編碼基因的相對表達(dá)量均低于空白對照組,但在處理21 d時,經(jīng)超高壓處理的天麻樣品中POD編碼基因的相對表達(dá)量極顯著高于空白對照組,其他2種則與空白組差異不大;在處理28 d時,天麻樣品中POD編碼基因的相對表達(dá)量均高于空白組,且茶多酚涂膜的天麻樣品中POD編碼基因的相對表達(dá)量提高了20倍;在處理35 d時,茶多酚涂膜、超高壓處理的天麻樣品中POD編碼基因的相對表達(dá)量顯著低于空白對照組,而茶多酚涂膜+超高壓處理的天麻樣品中POD的相對表達(dá)量與空白組略接近(表4)。
表4 POD的mRNA相對表達(dá)量
為了分析Papain在天麻軟化過程中的表達(dá)情況,用qPCR檢測Papain編碼基因的表達(dá)水平。由表5可以看出,茶多酚涂膜處理的天麻樣品的Papain編碼基因相對表達(dá)量在處理前28 d均低于空白組,但在處理35 d后則略高于空白組;在超高壓處理下,天麻樣品的Papain編碼基因的相對表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白對照組,在處理35 d時提高到處理7 d時的437倍左右;在茶多酚涂膜+超高壓處理下,天麻樣品的Papain編碼基因相對表達(dá)量在處理 14 d 時高于空白對照組,但在處理21 d時迅速降低,隨后又緩慢提高,但都低于對照。
表5 Papain的mRNA相對表達(dá)量
Cathepsin的主要功能是降解蛋白質(zhì),經(jīng)qPCR檢測發(fā)現(xiàn),茶多酚涂膜處理的天麻樣品Cathepsin編碼基因的相對表達(dá)量始終低于空白對照組;在超高壓處理下,天麻樣品的Cathepsin編碼基因的相對表達(dá)量先升高后降低,且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白對照組;在茶多酚涂膜+超高壓處理下,天麻樣品的Cathepsin編碼基因的相對表達(dá)量在處理14 d時提高到處理7 d時的103倍,在處理21 d時提高至處理7 d時的8倍;在處理35 d時上升到處理7 d時的232倍(表6)。
表6 不同處理時間Cathepsin的mRNA相對表達(dá)量
近年來,關(guān)于天麻保鮮的研究主要集中在生理生化指標(biāo)測定方面,隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,相關(guān)研究正逐步向生物技術(shù)靠攏。大量研究發(fā)現(xiàn),果蔬的軟化與細(xì)胞壁有密切關(guān)系,植物細(xì)胞壁的主要成分為纖維素、果膠,而高等植物細(xì)胞壁中果膠含量較高,是植物細(xì)胞間質(zhì)的重要成分,因此,與植物細(xì)胞壁有關(guān)的酶與天麻的軟化程度密切相關(guān)。目前關(guān)于天麻軟化相關(guān)酶的報道較少,本試驗選取與天麻同科或同屬植物軟化相關(guān)酶的基因序列,用BLAST進(jìn)行序列比對,選取高度保守的序列,用Primer 5.0工具,每個基因設(shè)計2~3對引物,共設(shè)計22對引物,經(jīng)過普通PCR擴(kuò)增篩選及qPCR篩選,最終選取PL、PME、Papain、POD和Cathepsin等5種軟化酶進(jìn)行分析,分別在3種不同包裝方式的天麻樣品中檢測了上述軟化酶的表達(dá)差異。在天麻軟化過程中,這5個基因的mRNA表達(dá)水平均受到影響,果膠裂解酶在經(jīng)茶多酚涂膜后表達(dá)量顯著降低,說明這種處理方式抑制了PL的表達(dá),保鮮效果較好;而在經(jīng)過3種不同包裝方式處理后,PME的表達(dá)水平變化以顯著為主,說明PME的表達(dá)可能不受這3種包裝方式的影響;經(jīng)3種不同方式處理的天麻樣品貯藏35 d時POD的相對表達(dá)量均低于空白組,說明POD減緩了天麻的氧化程度,具有較好的保鮮效果;經(jīng)超高壓處理后,Papain的相對表達(dá)量升高,說明經(jīng)過這種方式促進(jìn)了Papain的表達(dá),天麻軟化程度加深,但經(jīng)過茶多酚涂膜+超高壓處理后的天麻Papain的相對表達(dá)量比超高壓處理的天麻的表達(dá)量低,進(jìn)一步說明茶多酚涂膜的保鮮效果較好;茶多酚涂膜的天麻樣品種組織蛋白酶的相對表達(dá)量始終低于空白組,而其他處理方式的Cathepsin相對表達(dá)量升高,說明茶多酚涂膜有利于天麻的保鮮。綜上所述,茶多酚對天麻保鮮的效果較好,而超高壓處理反而促進(jìn)了天麻的軟化,推測可能是超高壓處理時的溫度、壓強(qiáng)和處理時間不佳造成的;在分子水平上,天麻軟化過程是由多個基因共同調(diào)控的,而本試驗僅選取且研究了一小部分基因,不能夠完全展現(xiàn)天麻在保鮮過程中的軟化調(diào)控機(jī)制,天麻的軟化相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步探索,本試驗的結(jié)果可為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ),為天麻保鮮研究提供參考。