昆布多酚通過調(diào)控Wnt/ β-catenin 信號通路抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖侵襲的研究

徐貴穎，張連波，王英麗，尚立華，熊蔚蔚，張 陽*

(1.吉林省腫瘤醫(yī)院 乳腺外二科，吉林 長春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所；3.吉林省前衛(wèi)醫(yī)院)

乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展是一個涉及多基因和多信號通路的過程，Wnt/β-catenin經(jīng)典通路與乳腺癌的關(guān)系是近年來的研究熱點(diǎn)，該通路的活化可能導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生。昆布屬于褐藻門藻類，主要含有礦物質(zhì)、多糖類、多酚類等多種化合物，藥典記載其具有抗炎，抗氧化，抗病毒，抗腫瘤等作用[1]，其中昆布多糖類和多酚類對肝癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、大腸癌、鼻咽癌、卵巢癌、三陰乳腺癌的抑制作用皆有研究報道[2-7]。本研究探討昆布多酚通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路對MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖侵襲的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7(吉林省腫瘤防治研究所細(xì)胞庫提供)。

1.2 主要試劑與儀器干燥昆布(藥材購于吉林省長春市福百草大藥房，由長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室張景龍教授鑒定為翅藻科植物昆布Ecklonia kurome Okam的干燥葉狀體)，IMDM培養(yǎng)基，Gibco產(chǎn)品；MTT(噻唑藍(lán))，Sigma產(chǎn)品；胎牛血清，天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；DMSO(二甲基亞砜)，Sigma產(chǎn)品；低溫離心機(jī)，SORVALL RTT USA；全自動酶標(biāo)儀，labsystems Dragon；電泳儀，上海天能；兔抗β-catenin 抗體(一抗)、兔抗β肌動蛋白(β-actin) 抗體，Abcam 公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(二抗)，北京西化儀科技有限公司；TUNEL試劑盒，德國Merk-Calbiochem 公司；Transwell小室，美國Corning公司。

1.3 方法

1.3.1藥品制備 取干燥昆布4 kg，用高速粉碎機(jī)粉碎后過30目篩后，液料比40∶1，30%乙醇浸泡2 min，微波450 W，100 s，水浴70℃，30 min，重復(fù)3次提取，合并提取液，離心5 000 r/min，15 min，上清真空抽濾，抽提液4℃冰箱靜置12 h，取上清1∶10醇沉，4℃放置24 h，重復(fù)醇沉4次，再次離心濃縮醇沉，即得到昆布多酚提取物，冷凍干燥為粉末，即得到純化后的昆布多酚類化合物[8-9]。用沒食子酸標(biāo)定昆布多酚。用無血清IMDM培養(yǎng)液配制不同劑量組。昆布多酚高劑量組(100 μg/mL)、中劑量組(50 μg/mL)、低劑量組(25 μg/mL)。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng) 將人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2培養(yǎng)。接種對數(shù)期生長細(xì)胞至96孔培養(yǎng)板，1×105/孔，分為5組，包括陰性對照組(PBS)，陽性對照組(阿霉素5 μmol/L)，昆布多酚高劑量組(100 μg/mL)，中劑量組(50 μg/mL)，低劑量組(25 μg/mL)，共培養(yǎng)48 h。

1.3.3細(xì)胞增殖能力檢測 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7培養(yǎng)24 h、48 h后，每孔加入濃度為5 g/L的 MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清加200 μl DMSO，避光震蕩10 min，490 nm酶標(biāo)儀檢測OD值，計算細(xì)胞增殖抑制率。

1.3.4Transwell 法檢測MCF-7細(xì)胞侵襲能力 藥物共培養(yǎng)48 h后，取細(xì)胞懸液1×105/mL，200 μl接種上室中，底部基質(zhì)膠上加500 μl 含胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基。放入二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去上室中的基底膠和MCF-7細(xì)胞，放入4%多聚甲醇溶液中固定，附著在上室中的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行吉姆薩染色，拍照計數(shù)。

1.3.5劃痕愈合實驗檢測MCF-7細(xì)胞遷移能力 藥物作用48 h后，將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿板內(nèi)80%空間，用加樣槍頭對細(xì)胞劃線，PBS緩沖液清洗掉落的細(xì)胞殘渣，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，鏡下拍照。細(xì)胞遷移率=(1-培養(yǎng)48 h后細(xì)胞間距/起始劃痕間距)×100%。

1.3.6TUNEL法檢測MCF-7細(xì)胞凋亡情況 分別用不同濃度昆布多酚處理MCF-7細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，按試劑盒說明進(jìn)行DAB顯色后，封片，光學(xué)顯微鏡下選取5個視野觀察細(xì)胞凋亡情況，計算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.7Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量 不同濃度昆布多酚處理細(xì)胞48 h后，裂解細(xì)胞提取總蛋白和核蛋白，80 μg/30 μL每孔上樣，電泳后濕法轉(zhuǎn)膜，封閉4 h。按試劑盒說明書操作，加一抗(1∶1000)、二抗(1∶1000)，內(nèi)參為β-actin蛋白，計算相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1經(jīng)藥品制備后得到昆布多酚提取物3 280 mg，昆布多酚得率為4.1 mg/5 g。

2.2 昆布多酚對MCF-7細(xì)胞增殖抑制率的影響

與陰性對照組相比，昆布多酚提取物可顯著升高對MCF-7的增殖抑制率(P<0.05)，且表現(xiàn)為時間劑量依賴性。結(jié)果見表1。

表1 昆布多酚對MCF-7細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.3 昆布多酚對MCF-7侵襲能力的影響

昆布多酚提取物各組與陰性對照組相比，顯著降低Transwell小室上室底部細(xì)胞數(shù)(P<0.05)，表現(xiàn)為劑量依賴性，結(jié)果見圖1A和1B。

圖1A 昆布多酚對MCF-7侵襲能力的影響(×100)

圖1B 昆布多酚對MCF-7侵襲能力的影響

2.4 昆布多酚對MCF-7遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示，昆布多酚各劑量組與陰性對照組相比，顯著降低MCF-7細(xì)胞遷移能力(P<0.05)，表現(xiàn)為劑量依賴性，結(jié)果見圖2A和2B。

圖2A 昆布多酚對MCF-7遷移能力的影響(×100)

圖2B 昆布多酚對MCF-7遷移能力的影響

2.5 昆布多酚對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

與陰性對照組比較，昆布多酚顯著升高M(jìn)CF-7的凋亡率(P<0.05)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。結(jié)果見圖3A和3B。

圖3A 昆布多酚對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 (×100)

圖3B 昆布多酚對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

2.6 昆布多酚對凋亡相關(guān)蛋白β-catenin表達(dá)量的影響

昆布多酚不同濃度組，總蛋白β-catenin表達(dá)都不受影響(P>0.05)，而細(xì)胞核中β-catenin表達(dá)隨著劑量的增加逐漸減少(P<0.05)。結(jié)果見圖4。

圖4 昆布多酚處理MCF-7細(xì)胞后總蛋白、核蛋白β-catenin表達(dá)情況

3 討論

復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和腫瘤耐藥是威脅乳腺癌患者預(yù)后的主要原因，因此探索新藥物及機(jī)制對于治療乳腺癌有著重要意義。昆布是藥食同源的多年生海藻植物，歐盟在2017年批準(zhǔn)腔昆布褐藻多酚(Ecklonia cava phlorotannins)為新資源食品，并允許其作為膳食補(bǔ)充劑[10]，昆布屬于褐藻門藻類，其中含有昆布多糖、昆布多酚等多種成分，各組分抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用均有相關(guān)報道[2-7,11-12]。

本研究采用昆布多酚提取物處理人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，陽性對照藥采用療效確切的阿霉素，發(fā)現(xiàn)昆布多酚提取物能夠抑制MCF-7細(xì)胞增殖，降低腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力，與現(xiàn)有研究結(jié)果一致[13-14]。本研究結(jié)果表明昆布多酚以濃度依賴的方式抑制 MCF-7人乳腺癌細(xì)胞株增殖能力，并促進(jìn) MCF-7細(xì)胞的凋亡。此外，昆布多酚提取物可降低MCF-7細(xì)胞核中β-catenin表達(dá)，β-catenin在癌細(xì)胞核中的累加表達(dá)，與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)[15-16]。提示昆布多酚可能通過抑制經(jīng)典的 Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對癌細(xì)胞發(fā)揮抑制作用。Aravindan等[17]研究提出海藻多酚通過干擾正常信號傳導(dǎo)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。Wnt/β-catenin信號通路參與維持胚胎發(fā)育和組織器官穩(wěn)態(tài)[18]。但人體中缺乏Wnt配體時，β-catenin在胞漿中呈游離狀態(tài)存在，并被多種蛋白組成的降解復(fù)合物所招募，通過一系列的激酶串聯(lián)反應(yīng)，從而促進(jìn)降解，而當(dāng)Wnt配體存在時，與細(xì)胞膜上相關(guān)蛋白結(jié)合，破壞降解復(fù)合物，無法有效降解β-catenin，其在胞漿中大量積累，移位至細(xì)胞核，啟動下游靶基因，促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。研究表明[19-20]，乳腺癌中Wnt信號通路過度活化，通過靶向作用于Wnt信號通路，抑制乳腺癌的發(fā)生與進(jìn)展[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，昆布多酚通過調(diào)控Wnt/β-catenin經(jīng)典通路抑制人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7增殖、侵襲、遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并呈現(xiàn)劑量依賴性。提示昆布多酚可能對乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有一定的抑制作用。