糞腸球菌Z096 對副溶血弧菌生物被膜及群體感應(yīng)的抑制作用

韓翔鵬，陳清瑩，張杏果，何 雙，鐘青萍

（廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

副溶血弧菌（）為革蘭氏陰性兼性厭氧菌，通常分布于沿海地區(qū)，如海水、海鮮產(chǎn)品中，也常見于鹽漬類食品中，是我國沿海區(qū)域最常見的食源性致病菌。感染副溶血弧菌會出現(xiàn)腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐、痙攣等癥狀，嚴(yán)重時會出現(xiàn)脫水、休克，甚至死亡。副溶血弧菌的高致病性與其產(chǎn)生多種毒力因子有關(guān)，其主要的毒力因子包括溶血性毒素、Ⅲ型分泌系統(tǒng)（Type Ⅲ secretion systems，T3SS）、Ⅵ型分泌系統(tǒng)（Type Ⅵ secretion systems，T6SS）、胞外蛋白酶、粘附因子和脂多糖等。在世界范圍內(nèi)，副溶血弧菌引起的食物中毒事件位居微生物食物中毒事件的首位，嚴(yán)重威脅著人類生命健康安全。

在食品加工過程中，副溶血弧菌能夠在玻璃、瓷磚、不銹鋼、塑料和聚合物涂層管道上形成生物被膜。許多研究表明，浮游菌體一旦形成生物被膜后，細(xì)菌對傳統(tǒng)抗生素的抵抗能力最高可提升至1000 倍，這是因?yàn)榧?xì)菌生物被膜產(chǎn)生的胞外多聚物基質(zhì)（多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA）可以形成一道保護(hù)屏障。當(dāng)生物被膜細(xì)胞暴露于營養(yǎng)缺乏、抗菌劑、高鹽度、缺氧、低溫等惡劣環(huán)境中時依然能夠正常生長和繁殖，這使得致病菌的防治變得更為困難。群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是細(xì)菌利用信號分子進(jìn)行信息交流的一種方式，通過分泌特定的信號分子如autoinducer（AI）調(diào)控細(xì)菌群體的生理特征，如生物被膜形成、菌體運(yùn)動、毒素分泌等。副溶血弧菌的QS 信號分子主要是AI-2（呋喃基硼酸二酯類化合物），主要由基因編碼產(chǎn)生。因此，通過干擾致病菌QS 系統(tǒng)，阻止信號分子的產(chǎn)生和積累或阻止其被受體蛋白識別和結(jié)合，就能達(dá)到防治致病菌生物被膜和毒素的效果。

目前，在醫(yī)療衛(wèi)生、食品加工等領(lǐng)域防控致病菌污染的主要方式是使用消毒劑和抗生素，然而消毒劑并不能徹底地清除致病菌生物被膜，而且抗生素的長期使用也極易造成耐藥菌株的產(chǎn)生。因此，開發(fā)新型抗菌劑以及探尋新型致病菌防治策略顯得尤為重要。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是食品工業(yè)、醫(yī)療保健行業(yè)、飼料產(chǎn)業(yè)以及化妝品行業(yè)等廣泛使用的公認(rèn)安全性（generally recognized as safe，GRAS）菌。乳酸菌能夠在腸道內(nèi)定植，增強(qiáng)腸道屏障，并且其代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸、生物表面活性劑、細(xì)菌素、胞外多糖（extracellular polysaccharides，EPS）等對致病菌及其生物被膜具有很強(qiáng)的拮抗作用，如YAN等從乳酸片球菌27167 和植物乳桿菌27172 的發(fā)酵液中提取得到的生物表面活性劑有效抑制金黃色葡萄球菌在聚苯乙烯載體表面的粘附，破壞生物被膜致密完整的結(jié)構(gòu)，而且對QS 信號分子AI-2 活性也具有良好的淬滅作用；黃湘湄等從海洋源乳酸菌中分離得到一株淬滅單增李斯特菌QS 信號分子AI-2 活性的戊糖乳桿菌zy-B-1，發(fā)現(xiàn)其乙酸乙酯提取物能夠顯著抑制單增李斯特菌生物被膜的形成，降低鞭毛的運(yùn)動能力。值得注意的是，目前有關(guān)乳酸菌對常見食源性致病菌如金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌等生物被膜的拮抗作用及淬滅其QS 的研究比較豐富，但對副溶血弧菌在相關(guān)方面的研究相對匱乏。因此，本文以副溶血弧菌為研究對象，考察糞腸球菌Z096 乙酸乙酯提取物對其生物被膜及QS 調(diào)控系統(tǒng)的抑制效果，為防控致病菌生物被膜形成以及開發(fā)新型抗菌劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

哈維氏弧菌（）BB170、副溶血弧菌（）ATCC17802 廣東微生物菌種保藏中心；糞腸球菌Z096 由本實(shí)驗(yàn)室從內(nèi)蒙古開菲爾中分離；結(jié)晶紫、酸水解酪蛋白 麥克林生化科技有限公司；L-精氨酸 上海源葉生物科技有限公司；乙酸乙酯、二甲苯、濃硫酸、冰乙酸、苯酚、丙酮、NaCl、葡萄糖、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸三銨、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫-80、甘油 廣州化學(xué)試劑廠；TCBS 培養(yǎng)基、牛肉膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；XTT、甲萘醌 生工生物工程（上海）股份有限公司；Bradford蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒 索萊寶生物科技有限公司；TSB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨15 g，大豆蛋白胨5 g，NaCl 15 g，pH7.2，蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌15 min；MRS 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母粉4 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀1.52 g，乙酸鈉3.53 g，檸檬酸三銨2 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.038 g，吐溫-80 1.0 mL，蒸餾水1000 mL，pH6.0，121 ℃滅菌15 min；AB 培養(yǎng)基：硫酸鎂12.3 g，NaCl 17.5 g，酸水解酪蛋白2 g，蒸餾水1000 mL，氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH7.5，121 ℃滅菌15 min 后添加10 mL 1 mol/L 無菌磷酸氫二鉀溶液（pH7.5）及10 mL 0.1 mol/L L-精氨酸溶液（pH7.5），20 mL 50%甘油。

Forma ClassⅡ A2 生物安全柜、Multiskan FC酶標(biāo)儀 Thermo 公司；R1001-VN 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào)公司；SP-02 型生化培養(yǎng)箱 恒豐醫(yī)療器械有限公司；TS-200B 搖床 上海天呈科技公司；SpectraMax i3x 多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices 公司；Bioscreen C 全自動生長曲線儀 芬蘭Biosrceen。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化 糞腸球菌Z096 接種于5 mL 的MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h。副溶血弧菌接種于5 mL 3% NaCl-TSB 培養(yǎng)基中，并置于搖床中37 ℃，150 r/min 培養(yǎng)12 h。哈維氏弧菌BB170接種于5 mL AB 培養(yǎng)基中，置于搖床中30 ℃培養(yǎng)12 h。上述菌株均按上述液體培養(yǎng)方法活化3 代后使用。

1.2.2 Z096 對副溶血弧菌生物被膜的影響 參考MARIANA 等和WOO 等的方法并稍作改動，以競爭、清除、排阻試驗(yàn)來模擬微菌落環(huán)境中乳酸菌與副溶血弧菌的相互作用。

1.2.2.1 競爭試驗(yàn) 在24 孔板中，加入2 mL TSB培養(yǎng)基（含副溶血弧菌終濃度10CFU/mL、Z096 終濃度10CFU/mL），37 ℃靜置培養(yǎng)2 d，在8、16、24、32、48 h 時間點(diǎn)，平板計(jì)數(shù)法測定浮游態(tài)和生物被膜態(tài)副溶血弧菌菌體數(shù)量。

1.2.2.2 清除試驗(yàn) 在24 孔板中加入2 mL 3% NaCl-TSB 培養(yǎng)基（含副溶血弧菌終濃度10CFU/mL），37 ℃靜置培養(yǎng)48 h 形成成熟生物被膜，棄菌液，用無菌生理鹽水洗滌生物被膜3 次，加入2 mL TSB 培養(yǎng)基（含Z096 終濃度10CFU/mL），培養(yǎng)和計(jì)數(shù)方法同上。

1.2.2.3 排阻試驗(yàn) 在24 孔板中，加入2 mL MRS培養(yǎng)基（含Z096 終濃度10CFU/mL），37 ℃靜置培養(yǎng)24 h 形成成熟生物被膜。棄菌液，用無菌生理鹽水洗滌生物被膜3 次，加入2 mL TSB 培養(yǎng)基（含副溶血弧菌終濃度10CFU/mL），培養(yǎng)和計(jì)數(shù)方法同上。

1.2.3 Z096 乙酸乙酯提取物（Z096-E）的制備 將活化后的Z096 菌液以2%接種到MRS 液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h 后，冷凍離心（4 ℃，12000 r/min，10 min），將上清液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，得到Z096 無細(xì)胞上清液，選取乙酸乙酯作為萃取劑，將無細(xì)胞上清液與乙酸乙酯等體積混合，置于搖床（150 r/min，2 h），隨后將混合液置于分液漏斗中靜置2 h，收集有機(jī)相，重復(fù)上述的操作3 次。將3 次萃取獲得的有機(jī)相合并后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)相，用無菌水復(fù)溶后得到Z096-E。

1.2.4 Z096-E 對副溶血弧菌及哈維氏弧菌生長的影響 全自動生長曲線儀測定乳酸菌Z096-E 對副溶血弧菌和哈維氏弧菌生長的影響。在100 孔微型板中分別加入200 μL 含Z096-E 濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL 的3%NaCl-TSB 培養(yǎng)基或AB 培養(yǎng)基，將活化后的副溶血弧菌或哈維氏弧菌接入孔內(nèi)（終濃度10CFU/mL），37 ℃下培養(yǎng)24 h，每隔2 h 測定一次OD。

1.2.5 Z096-E 對副溶血弧菌生物被膜形成的影響采用結(jié)晶紫染色法測定生物被膜的生物量，在96 孔板中分別加入200 μL 含Z096-E 濃度為0、0.4、0.8、1.6 mg/mL 的3% NaCl-TSB 培養(yǎng)基，將活化后的副溶血弧菌接入孔內(nèi)（終濃度10CFU/mL），37 ℃下分別培養(yǎng)12、24、48 h 后，棄菌液，用無菌生理鹽水輕緩洗滌2 次。將孔板置于60 ℃烘箱中固定30 min。固定完成后，每孔中加入200 μL 0.1%的結(jié)晶紫溶液，染色5 min 后，用無菌生理鹽水清洗3 次，干燥30 min。在孔中加入200 μL 33%的冰乙酸，脫色10 min 后，用酶標(biāo)儀測定OD，按照式（1）計(jì)算抑制率。

采用XTT 法測定生物被膜的代謝活性，副溶血弧菌在96 孔板中37 ℃下分別培養(yǎng)12、24、48 h后，移除菌液，用100 μL 無菌PBS 輕緩清洗2 次，每孔加入100 μL 無菌PBS 緩沖液和13.5 μL 的XTT-甲萘醌混合液（12.5:1），輕輕振動孔板，在37 ℃避光孵育2～3 h，用酶標(biāo)儀測定OD，按照式（1）計(jì)算代謝活性減少率。

式中：OD為未用Z096-E 處理（Z096-E 濃度為0 mg/mL）的生物被膜；OD為Z096-E 處理后的生物被膜。

1.2.6 Z096-E 對副溶血弧菌成熟生物被膜的清除作用 在96 孔板中加入200 μL 3% NaCl-TSB 培養(yǎng)基（含副溶血弧菌終濃度10CFU/mL），37 ℃下培養(yǎng)48 h 使其形成成熟生物被膜。培養(yǎng)結(jié)束后除去孔中的菌液，用200 μL 無菌生理鹽水輕緩清洗2 次，去除浮游菌體。再在孔中加入200 μL 含Z096-E 濃度為0、1.6、3.2、6.4、12.8 mg/mL 的生理鹽水，37 ℃下分別孵育1、2、4 h，按照1.2.5 中的結(jié)晶紫染色法和XTT 法分別測定生物被膜的生物量及代謝活性，計(jì)算清除率。

式中：OD為未用Z096-E 處理的生物被膜；OD為Z096-E 處理后的生物被膜。

1.2.7 Z096-E 對副溶血弧菌群集和泳動的影響 參照上官文丹等的方法進(jìn)行。在含有0、0.4、0.8、1.6 mg/mL Z096-E 的群集和泳動培養(yǎng)基平板的中央，加入2 μL 活化三代的副溶血弧菌菌液。37 ℃正置培養(yǎng)24 h 后，觀察菌株的遷移情況，并用游標(biāo)卡尺測量群集、泳動平板中，副溶血弧菌的群集或泳動直徑。

1.2.8 Z096-E 對副溶血弧菌細(xì)胞表面疏水性和自聚性的影響 細(xì)胞表面疏水性和自聚性的測定參考SALAHEEN 等的方法進(jìn)行，并稍作改動。將活化三代的副溶血弧菌接種于含0、0.4、0.8、1.6 mg/mL Z096-E 3% NaCl-TSB 培養(yǎng)基中（含副溶血弧菌終濃度10CFU/mL），37 ℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后，在4 ℃、8000 r/min 下離心10 min，收集沉淀，用無菌PBS（pH7.2）洗滌2 次并重懸菌液，測量OD，記作H。將菌液與二甲苯等體積混合，徹底振蕩3 min后，室溫靜置10 min，測定水相的OD，記作H，并計(jì)算疏水性。

式中：H為加入二甲苯前PBS 菌懸液的OD；H為加入二甲苯后水相的OD。

將上述培養(yǎng)的副溶血弧菌菌液離心收集菌體，用無菌PBS（pH7.2）洗滌2 次并重懸菌液，并測量OD，記作A。然后，將菌懸液渦旋混勻后，在37 ℃靜置孵育2 h，測定菌液OD，記作A，并計(jì)算自聚性。

式中：A為靜置孵育前PBS 菌懸液的OD；A為靜置孵育后PBS 菌懸液的OD。

1.2.9 Z096-E 對副溶血弧菌信號分子AI-2 活性的影響 采用哈維氏弧菌BB170 生物發(fā)光法測定信號分子AI-2 活性。將活化三代的副溶血弧菌接種于含0、0.4、0.8、1.6 mg/mL Z096-E 的3% NaCl-TSB培養(yǎng)基中（終濃度10CFU/mL），37 ℃，150 r/min，培養(yǎng)24 h，6000 r/min 離心5 min，0.22 μm 濾膜過濾，收集無細(xì)胞上清液。同時，將活化三代的BB170 菌液的OD調(diào)節(jié)為0.8 左右，用AB 培養(yǎng)基按1:5000 的比例稀釋該菌液，混勻備用。按1:50 的比例將收集的無細(xì)胞上清液與BB170 稀釋菌液混合，30 ℃，100 r/min 孵育3 h，然后取200 μL 于黑色不透明酶標(biāo)板中，用多功能酶標(biāo)儀的化學(xué)發(fā)光模式檢測BB170 的發(fā)光情況，并計(jì)算抑制率。

1.2.10 Z096-E 對副溶血弧菌胞外多聚物的影響按照ZHANG 等的方法并稍作修改進(jìn)行。在24孔板中加入2 mL 含不同濃度Z096-E（0、0.4、0.8、1.6 mg/mL）的3% NaCl-TSB，每孔以2%接種量接種副溶血弧菌（終濃度為10CFU/mL），加入無菌蓋玻片（14 mm×14 mm），37 ℃培養(yǎng)24 h，取出蓋玻片置于試管中，加入1 mL 生理鹽水，振蕩洗脫30 s，超聲處理30 min，再振蕩30 s，置于1.5 mL 離心管中，4000 r/min 離心30 min，收集上清液，過0.22 μm濾膜。

苯酚-硫酸法測定胞外多糖的含量。取0.5 mL上述所制備的上清液于試管中，加入0.5 mL 5%苯酚，混合振蕩15 s 后加入2.5 mL 濃HSO，避光反應(yīng)10 min，振蕩10 s 后放入25 ℃水浴中孵育10 min，孵育完成后測定OD，按照式（1）計(jì)算抑制率。

考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)的含量。在96 孔板中加入20 μL 上述制備的上清液，然后再各添加200 μL 的G-250 染料，將孔板于室溫下放置5 min后測定OD，按照式（1）計(jì)算抑制率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Means±SD）表示，利用GraphPad Prism 8.0 繪圖，以SPSS 25.0 進(jìn)行ANOVA 方差分析，＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Z096 對副溶血弧菌生物被膜的影響

在微菌落環(huán)境中，乳酸菌通過競爭、清除、排阻的方式與副溶血弧菌相互作用，干擾副溶血弧菌在介質(zhì)表面的定殖和生物被膜的形成。與對照組相比，Z096 能夠明顯降低副溶血弧菌浮游細(xì)胞和生物被膜細(xì)胞的數(shù)量（圖1）。在競爭試驗(yàn)中，副溶血弧菌與Z096 共培養(yǎng)48 h 后，浮游細(xì)胞和生物被膜細(xì)胞數(shù)量分別減少0.69、1.37 lg CFU/mL（圖1A）。相似地，SHANGGUAN 等發(fā)現(xiàn)在干酪乳桿菌L10 與副溶血弧菌共培養(yǎng)的體系中，干酪乳桿菌能夠有效阻止副溶血弧菌在介質(zhì)表面粘附，可使培養(yǎng)體系中浮游狀態(tài)和生物被膜狀態(tài)的副溶血弧菌菌體數(shù)量減少約1.5 個數(shù)量級。在清除實(shí)驗(yàn)中，副溶血弧菌成熟生物被膜中加入Z096 處理48 h 后，浮游細(xì)胞和生物被膜細(xì)胞數(shù)量分別降低1.29、0.52 lg CFU/mL（圖1B）。在排阻試驗(yàn)中，Z096 明顯干擾副溶血弧菌在介質(zhì)表面的定殖，處理48 h 后，浮游細(xì)胞和生物被膜細(xì)胞的數(shù)量分別下降1.01、1.48 lg CFU/mL（圖1C）。亦有研究報道乳酸菌生物被膜的形成阻礙了食源性致病菌在載體表面的定植，如MARIANA 等利用清酒乳桿菌CRL1862 在不銹鋼和聚苯乙烯表面預(yù)先形成成熟生物被膜，顯著降低了培養(yǎng)體系中單增李斯特菌浮游菌和生物被膜菌的數(shù)量。此外，WOO 等報道了副干酪乳桿菌KACC 12427 在排阻實(shí)驗(yàn)中可使單增李斯特菌和沙門氏菌生物被膜中的菌體數(shù)量降低2 個數(shù)量級，但其對兩種致病菌生物被膜的清除效果均不明顯。

圖1 糞腸球菌Z096 對副溶血弧菌生物被膜的影響Fig.1 Effects of Enterococcus faecalis Z096 on biofilm of V.parahaemolyticus

2.2 Z096-E 對副溶血弧菌和哈維氏弧菌生長的影響

由圖2A 所示，副溶血弧菌的生長趨勢隨著Z096-E 濃度的增加而逐步下降，呈濃度依賴效應(yīng)，當(dāng)Z096-E 濃度≥1.8 mg/mL 時，副溶血弧菌的生長完全被抑制。圖2B 表明，在Z096-E 處理的濃度范圍內(nèi)，哈維氏弧菌BB170 的生長基本不受影響，這一結(jié)果確保了后續(xù)采用哈維氏弧菌BB170 生物發(fā)光法測定信號分子AI-2 活性的準(zhǔn)確性。

圖2 Z096-E 對副溶血弧菌（A）和哈維氏弧菌（B）生長的影響Fig.2 Effects of Z096-E on the growth of V.parahaemolyticus(A) and Vibrio harvey (B)

2.3 Z096-E 對副溶血弧菌生物被膜形成的影響

圖3 顯示Z096-E 對副溶血弧菌生物被膜的形成具有顯著的抑制作用，且抑制作用強(qiáng)度與Z096-E的濃度成正相關(guān)。0.8 和1.6 mg/mL 的Z096-E 處理12 h，其對副溶血弧菌生物被膜形成的抑制率分別為43.50%和70.43%，代謝活性減少率分別為81.92%和84.15%；當(dāng)處理24 h 時，Z096-E 對副溶血弧菌生物被膜的形成仍然具有良好的抑制效果，其對生物被膜形成的抑制率分別為38.27%和55.30%，代謝活性減少率分別為46.66%和61.20%，然而隨著處理時間的進(jìn)一步延長，其對副溶血弧菌生物被膜形成的抑制效果減弱。這一現(xiàn)象與WASFI 等的研究結(jié)果一致，他們考察了四株益生性乳桿菌對變異鏈球菌生物被膜的影響，發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵上清液對變異鏈球菌生物被膜生物量和代謝活性抑制作用隨處理濃度的增加而增大，但延長處理時間后抑制作用相對減弱。

圖3 Z096-E 對副溶血弧菌生物被膜生物量（A）和代謝活性（B）的影響Fig.3 Effects of Z096-E on biofilm biomass (A) and metabolic activity (B) of V.parahaemolyticus

2.4 Z096-E 對副溶血弧菌成熟生物被膜的清除作用

Z096-E 作用于副溶血弧菌成熟生物被膜后的處理效果呈現(xiàn)在圖4 中。加入梯度濃度的Z096-E 處理成熟生物被膜1 h 的清除效果總體偏低，而處理2 h 后，6.4 和12.8 mg/mL 的Z096-E 對副溶血弧菌成熟生物被膜的清除率分別可達(dá)到26.23%和31.41%，代謝活性減少率分別為35.28%和56.45%，處理4 h 后，兩種濃度的Z096-E 對副溶血弧菌成熟生物被膜的清除率分別上升至45.33%和58.21%，代謝活性減少率分別達(dá)到54.97%和69.84%。結(jié)果表明，Z096-E 能有效清除副溶血弧菌成熟生物被膜，且清除率與Z096-E 的濃度和作用時間呈正相關(guān)。

圖4 Z096-E 對副溶血弧菌成熟生物被膜生物量（A）和代謝活性（B）的影響Fig.4 Effects of Z096-E on biomass (A) and metabolic activity(B) of V.parahaemolyticus mature biofilm

2.5 Z096-E 對副溶血弧菌群集和泳動能力的影響

鞭毛是副溶血弧菌進(jìn)行群集和泳動的重要運(yùn)動性結(jié)構(gòu)，在副溶性弧菌生物被膜形成的初期和后期都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。由圖5A和5B可知，副溶血弧菌未經(jīng)Z096-E 處理，其群集和泳動遷移直徑分別為（11.51±0.44）mm 和（55.58±3.08）mm，表明副溶血弧菌具有較強(qiáng)的群集和泳動能力。然而，在群集和泳動平板中添加Z096-E 后，副溶血弧菌群集和泳動能力顯著降低（＜0.05）。當(dāng)Z096-E 濃度為0.4 mg/mL時，群集和泳動所形成的圓形直徑與對照組相比顯著減?。ǎ?.05），直徑分別為（9.46±0.33）mm 和（43.18±1.47）mm，對應(yīng)抑制率分別為17.81%和22.31%（圖5A和圖5B）。當(dāng)Z096-E 濃度為1.6 mg/mL時，群集和泳動所形成的圓形直徑分別為（6.07±0.18）mm 和（25.81±1.09）mm，對應(yīng)抑制率分別為47.26%和53.56%（圖5A和圖5B）。因此，Z096-E對副溶血弧菌群集和泳動的抑制呈濃度依賴作用。亦有研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌Y42 無細(xì)胞上清液可通過抑制單增李斯特菌運(yùn)動能力來干擾菌體在介質(zhì)表面的粘附，從而抑制單增李斯特菌生物被膜的形成；戊糖乳桿菌DF9 發(fā)酵上清液提取物對副溶血弧菌泳動和群集能力的抑制率分別為47.91%和39.02%，且呈現(xiàn)濃度依賴性的抑制作用。

圖5 Z096-E 對副溶血弧菌群集（A、C）和泳動（B、D）能力的影響Fig.5 Effects of Z096-E on swarming (A,C) and swimming(B,D) abilities of V.parahaemolyticus

2.6 Z096-E 對副溶血弧菌細(xì)胞表面疏水性和自聚性的影響

食源性致病菌的自聚能力與致病菌的粘附性有關(guān)，其能使致病菌在復(fù)雜的微菌落中形成競爭優(yōu)勢，促進(jìn)生物被膜的發(fā)育和成熟。細(xì)胞表面疏水性是致病菌的毒力標(biāo)記，致病菌細(xì)胞表面的粘附性和生物被膜的形成能力增強(qiáng)與細(xì)胞表面疏水性增強(qiáng)密切相關(guān)。圖6A 結(jié)果顯示，未加入Z096-E 的對照組副溶血弧菌細(xì)胞表面疏水性為47.01%，當(dāng)Z096-E 濃度為0.8 和1.6 mg/mL 時，副溶血弧菌表面疏水性分別為37.16%和17.22%，顯著低于對照組（＜0.05），對應(yīng)抑制率分別為20.95%和63.37%。圖6B 結(jié)果顯示，未加入Z096-E 的對照組副溶血弧菌自聚性為22.6%，當(dāng)Z096-E 濃度為0.4、0.8 和1.6 mg/mL 時，副溶血弧菌自聚性分別為15.76%、9.45%和2.40%，均顯著低于對照組（＜0.05），對應(yīng)抑制率分別為30.27%、58.19%和89.38%。因此，Z096-E 能明顯降低副溶血弧菌細(xì)胞表面疏水性和自聚性，且抑制效果與處理濃度呈劑量依賴效應(yīng)。這一現(xiàn)象與宋瑩龍等的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌-12 分泌的胞外多糖可使志賀氏菌細(xì)胞表面疏水性和自聚性分別降低90%和30%，且作用效果隨著胞外多糖濃度的增加而增強(qiáng)。

圖6 Z096-E 對副溶血弧菌細(xì)胞表面疏水性（A）和自聚性（B）的影響Fig.6 Effects of Z096-E on the cell surface hydrophobicity（A）and auto-aggregation（B）of V.parahaemolyticus

2.7 Z096-E 對副溶血弧菌QS 信號分子AI-2 活性和生物被膜胞外聚合物合成的的影響

AI-2 型QS 系統(tǒng)是調(diào)控副溶血弧菌運(yùn)動性和生物被膜形成的關(guān)鍵。圖7 顯示，Z096-E 能明顯抑制副溶血弧菌信號分子AI-2 的產(chǎn)生，且抑制效果隨著Z096-E 處理濃度的增加而增大。3 種濃度的Z096-E 處理后AI-2 的活性有顯著性差異（＜0.05），1.6 mg/mL 的Z096-E 對AI-2 的抑制作用最強(qiáng)，抑制率達(dá)70.77%，而0.8 和0.4 mg/mL 的Z096-E 對AI-2 也具有明顯的抑制效果，抑制率分別為48.29%和26.55%。相似地，PELYUNTHA 等的研究表明從發(fā)酵葡萄中分離得到的乳酸菌對沙門氏菌毒力和生物被膜的抑制作用與降低其AI-2 活性有關(guān)。

圖7 Z096-E 對副溶血弧菌AI-2 活性、胞外多糖和胞外蛋白質(zhì)合成的影響Fig.7 Effects of Z096-E on AI-2 activity,EPS and extracellular protein synthesis of V.parahaemolyticus

胞外多糖有助于菌體的粘附和生物被膜的形成，對生物被膜復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)具有重要的支撐作用，而且能夠誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。胞外蛋白在細(xì)菌粘附于介質(zhì)表面的過程中起到重要的作用，是促進(jìn)細(xì)菌生物被膜形成的主要粘附分子。ONBAS等研究報道了一株植物乳桿菌F-10 無細(xì)胞上清液通過降低生物被膜重要組成成分胞外多糖和蛋白的含量，從而抑制銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。而本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的Z096-E處理后，生物被膜胞外多糖和胞外蛋白的含量有不同程度的降低，0.4 mg/mL 的Z096-E 對胞外多糖和胞外蛋白的抑制率分別為57.60%和42.51%，隨著Z096-E 處理濃度的增加，胞外多糖和胞外蛋白的含量也在逐漸降低，在1.6 mg/mL 濃度下抑制率達(dá)到最高，分別為77.65%和51.91%（圖7）。結(jié)果表明，Z096-E 可通過抑制副溶血弧菌AI-2 型群體感應(yīng)系統(tǒng)和生物被膜重要組成成分胞外多糖和胞外蛋白的合成，從而抑制副溶血弧菌生物被膜的形成。

3 討論與結(jié)論

本文采用競爭、清除和排阻三種試驗(yàn)?zāi)M微菌落中菌體之間的相互作用，以評估乳酸菌對致病菌生物被膜形成的抑制作用。在競爭試驗(yàn)中，處于浮游和生物被膜狀態(tài)的副溶血弧菌菌體數(shù)量與對照組相比明顯減少，這一結(jié)果與RATTI 等和WINKELSTROTER 等的研究結(jié)果一致，他們認(rèn)為乳酸菌在與致病菌共培養(yǎng)的過程中，產(chǎn)生了抑制性化合物（細(xì)菌素、有機(jī)酸、生物表面活性劑等）會抑制致病菌生長，阻止致病菌在介質(zhì)表面附著，甚至?xí)偈怪虏【?xì)胞從生物被膜結(jié)構(gòu)中脫離。在排阻試驗(yàn)中，乳酸菌在載體表面預(yù)先形成成熟生物被膜對副溶血弧菌定殖有很強(qiáng)的抑制效果，生物被膜狀態(tài)的細(xì)胞數(shù)量顯著降低，這是因?yàn)槿樗峋置诘腅PS 更有利于乳酸菌在載體表面的定殖，而且EPS 也可有效防止致病菌在載體表面粘附。在清除試驗(yàn)中，副溶血弧菌生物被膜狀態(tài)細(xì)胞數(shù)量的減少程度低于競爭和排阻試驗(yàn)，這一現(xiàn)象與TAHMOURESPOUR 等的研究結(jié)果一致。生物被膜形成的過程中，致病菌在非生物載體表面的粘附是第一階段，因此，干擾致病菌的粘附能力是控制致病菌污染的有效策略。

乳酸菌對致病菌生物被膜的抑制作用機(jī)理，除了與致病菌對營養(yǎng)物質(zhì)和粘附位點(diǎn)的爭奪外，還與其自身產(chǎn)生的抑菌活性成分對致病菌的殺傷作用密切相關(guān)。GIORDANI 等從格氏乳桿菌中分離出具有生物表面活性劑作用的脂質(zhì)體，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有抗生物被膜作用。PRADEEPA等研究報道了一株植物乳桿菌產(chǎn)生的胞外多糖能夠抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成及細(xì)胞表面疏水性，降低金葡菌對抗生素的耐藥性。WANG 等從植物乳桿菌中分離純化得到細(xì)菌素能夠抑制地衣芽孢桿菌在不銹鋼和玻璃表面形成生物被膜，為乳品加工生物被膜的防治提供了一個安全有效的策略。本文研究發(fā)現(xiàn)，Z096-E 能夠顯著抑制副溶血弧菌生物被膜的形成，清除副溶血弧菌成熟生物被膜，而且對生物被膜重要組成成分胞外多糖和胞外蛋白的合成也具有很強(qiáng)的抑制效果。

致病菌形成的生物被膜使得消毒劑和抗生素的有效性大大降低，這給當(dāng)前食品工業(yè)和醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)帶來巨大的挑戰(zhàn)。與傳統(tǒng)抗菌劑相比，群體感應(yīng)抑制劑（quorum sensing inhibitors，QSIs）以QS 系統(tǒng)為靶點(diǎn)，在不殺死菌體的情況下，有效抑制致病菌生物被膜的形成及各種毒力因子的產(chǎn)生。CUI 等發(fā)現(xiàn)面包乳桿菌ZHG2-1 發(fā)酵液乙酸乙酯提取物通過下調(diào)銅綠假單胞菌信號分子合成基因和的表達(dá)，抑制生物被膜的形成及幾丁質(zhì)酶、綠膿桿菌素、鼠李糖脂等毒素的產(chǎn)生。MELIAN 等從彎曲乳桿菌中分離得到一種細(xì)菌素AL705，其可通過淬滅單增李斯特菌信號分子AI-2 的活性，從而降低單增李斯特菌在介質(zhì)表面的黏附，抑制了生物被膜的形成。研究結(jié)果表明，Z096-E 濃度在低于0.8 mg/mL時基本不影響副溶血弧菌的正常生長，但其能夠明顯抑制副溶血弧菌生物被膜的形成、細(xì)胞表面疏水性、自聚性、群集泳動能力、AI-2 活性以及胞外多糖和胞外蛋白的合成，且抑制效果與濃度呈劑量依賴效應(yīng)。因此，可以推測Z096-E 通過降低AI-2 活性，干擾副溶血弧菌QS 系統(tǒng)，調(diào)控鞭毛的運(yùn)動性、胞外多糖和胞外蛋白的合成，從而達(dá)到抑制生物被膜形成的效果?？偟膩碚f，Z096-E 對副溶血弧菌生物被膜具有很強(qiáng)的抑制效果，而且其能夠通過干擾副溶血弧菌QS 系統(tǒng)的方式來調(diào)控生物被膜的形成，是一種防控副溶血弧菌污染的新型生物制劑，但值得注意的是，其調(diào)控副溶血弧菌生物被膜的分子機(jī)制還需更加深入的研究。