榛蘑與菌絲體中蜜環(huán)菌素的超聲波輔助提取條件優(yōu)化及其提取物中化合物分析

徐 偉，王植朔，王瑞琦，吳 凡，梁珊珊，謝紅瑤，張 雪

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150028）

食藥用菌是一類(lèi)天然無(wú)毒副作用的綠色資源真菌，蜜環(huán)菌（（Vahl.ex Fr.）Quel）是一種常見(jiàn)的食藥用菌，又名榛蘑，屬于擔(dān)子菌亞門(mén)（Bsaidiomycotina）、傘菌目（Agaricales）、口蘑科（Tricholomataceae）、蜜環(huán)菌屬（），其產(chǎn)地廣泛分布于歐洲、亞洲、北美國(guó)家等許多地區(qū)以及熱帶及溫帶的森林地區(qū)，我國(guó)主產(chǎn)于黑龍江、吉林、遼寧、河北等地。榛蘑中含有包括蜜環(huán)菌素類(lèi)、多糖類(lèi)、萜類(lèi)、多元醇、酚、有機(jī)酸、氨基酸、黃酮類(lèi)、維生素、微量元素在內(nèi)的多種活性成分，功能豐富，在新型天然藥用資源開(kāi)發(fā)利用中占據(jù)重要地位，目前，已被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于神經(jīng)疾病以及心腦血管治療藥物，其菌絲體被國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理部門(mén)批準(zhǔn)可用于輔助降血壓。榛蘑的子實(shí)體對(duì)眩暈、肢麻、失眠、耳鳴等有較好治療作用，有著明目、祛風(fēng)活筋、強(qiáng)筋壯骨的藥用功能，但其成分解析還不夠全面，構(gòu)效關(guān)系還有待于深入研究。

蜜環(huán)菌素是榛蘑中存在的特征成分，是由倍半萜醇和芳香酸及其衍生物通過(guò)酯化而成的原伊魯烷型倍半萜醇芳香酸酯類(lèi)化合物，該種結(jié)構(gòu)在天然產(chǎn)物中獨(dú)特存在。盡管倍半萜醇和芳香酸及其衍生物都獨(dú)立存在于自然界中，但二者酯化結(jié)合物目前僅在榛蘑中有發(fā)現(xiàn)，主要有蜜環(huán)菌甲素、蜜環(huán)菌乙素、蜜環(huán)菌戊素、蜜環(huán)菌酸等。隨著對(duì)蜜環(huán)菌素類(lèi)結(jié)構(gòu)解析的深入以及構(gòu)效關(guān)系的研究，近年來(lái)，不斷有榛蘑抑制癌細(xì)胞等研究報(bào)道，例如：用蜜環(huán)菌乙素可以抑制K562（人慢性骨髓性白血病細(xì)胞）、HEL 92.1.7（人慢性紅細(xì)胞白血病細(xì)胞）和U937（人急性單細(xì)胞白血病細(xì)胞）的生長(zhǎng)；蜜環(huán)菌乙素對(duì)人食管癌和人淋巴癌有細(xì)胞毒性作用，且能抑制人食道癌的xe-no 生長(zhǎng)和增加移植腫瘤模型中的放射性敏感，并能抑制巨噬細(xì)胞活化和分化；蜜環(huán)菌乙素作用于人肝癌細(xì)胞（HCC）后，微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（LC3）大量聚集，微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3-Ⅰ（LC3-Ⅰ）大量轉(zhuǎn)化成微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ），導(dǎo)致癌細(xì)胞自噬。蜜環(huán)菌庚素與活性氧（ROS）誘導(dǎo)人淋巴瘤和肝癌（HCC）細(xì)胞凋亡死亡；蜜環(huán)菌戊素通過(guò)Cys159 抑制5-脂氧合酶（5-LO）從而抑制花生四烯酸合成白三烯，增強(qiáng)免疫作用。

由于野生榛蘑資源有限，人工分離榛蘑母體純菌株進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)菌絲體，并獲取其生物活性成分，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供可行性。本研究以東北野生榛蘑子實(shí)體與其母體純種人工液態(tài)培養(yǎng)菌絲體為研究對(duì)象，利用超聲細(xì)胞破碎輔助溶劑萃取提取物，采用UHPLC-MS/MS 對(duì)其組分進(jìn)行檢測(cè)，在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行分析推測(cè)并鑒定其中化合物，分析活性物質(zhì)種類(lèi)及含量，揭示野生子實(shí)體與人工液態(tài)菌絲之間差異，為藥物開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)，并從中尋找新化合物，為輔助抗癌化療新型藥物的開(kāi)發(fā)提供方向，達(dá)到降低化療藥物的攝入以及對(duì)機(jī)體的損傷的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生榛蘑 采自黑龍江省孫吳縣鮮榛蘑，由本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)組織分離并鑒定，奧氏蜜環(huán)菌（）菌種獲得的母體純菌株，PDA 培養(yǎng)基4 ℃斜面試管保存；蜜環(huán)菌甲素標(biāo)準(zhǔn)品 實(shí)驗(yàn)室自制；二-氯苯丙氨酸 上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈 色譜級(jí)，Merck KGaA 公司；甲酸 色譜級(jí)，西亞試劑公司；PDA 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；葡萄糖 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；KHPO

天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；MgSO·7HO 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；石油醚 天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

Thermo Vanquish UHPLC 型超高效液相色譜儀、Q-Exactive HF 型高分辨質(zhì)譜 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；Zorbax Eclipse 型 C（1.8 μm×2.1 mm×100 mm）色譜柱 美國(guó)安捷倫科技公司；723N UV5100 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器公司；JY92-IIN 型超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；DK-8D 型電熱恒溫水槽上海一恒科技；HC-200 型多功能粉碎機(jī) 浙江省金穗機(jī)械制造廠；JJ200 型精密電子天平 美國(guó)雙杰兄弟有限公司；R-201 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申勝公司；SW-CJ-ECU 型超凈工作臺(tái) 蘇州其嘉凈化設(shè)備有限公司；DHG-9203A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、GHP-9050 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；SHB-III 型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 榛蘑液態(tài)菌絲體培養(yǎng) 將葡萄糖10.0 g、蛋白胨5.0 g、KHPO0.3 g、MgSO·7HO 1.0 g，加1000 mL水配制培養(yǎng)基，取100 mL 置于250 mL 錐形瓶中，高壓滅菌121 ℃、0.105 MPa 30 min，待冷卻至室溫，用滅菌打孔器取直徑為1 cm 的榛蘑菌塊，單塊接種于三角瓶中，紗布包扎瓶口置于轉(zhuǎn)速為160 r/min 的搖床中，溫度為26 ℃，振蕩培養(yǎng)13 d 后，獲得液態(tài)培養(yǎng)菌絲體。

1.2.2 液態(tài)菌絲體與子實(shí)體粉末制備 將榛蘑的菌絲體和發(fā)酵液真空抽濾，收集菌絲體，用流水沖洗數(shù)次，置于60 ℃，干燥至恒重取出；野生榛蘑子實(shí)體用流水沖洗表面沙塵，同樣在60 ℃下進(jìn)行干燥，2 種干燥物，用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)40 目篩，分別獲得菌絲體與子實(shí)體粉末，具體操作流程與樣品形態(tài)見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 樣品制備流程Fig.1 Sample preparation process

圖2 榛蘑野生子實(shí)體、液態(tài)菌絲體及粉末形態(tài)Fig.2 Wild fruiting body,liquid mycelium,and powder of Armillaria mellea

1.2.3 蜜環(huán)菌素的超聲輔助提取 稱(chēng)取預(yù)處理好的液態(tài)菌絲體和野生子實(shí)體粉末各1 g，分別加入石油醚溶液10 mL，設(shè)置好超聲波細(xì)胞破碎儀參數(shù)：功率300 W、時(shí)間20 min，放入原料粉末和提取溶劑后進(jìn)行超聲波破碎，再將破碎后的粉末和石油醚轉(zhuǎn)入到索氏提取器中進(jìn)行溶劑回流50 min，過(guò)濾后轉(zhuǎn)入設(shè)置好參數(shù)為真空度-0.085 MPa，水浴溫度60 ℃，轉(zhuǎn)速120 r/min 的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行濃縮處理，等到提取液減少至原體積的1/5 后即停，獲得提取物。

1.2.4 蜜環(huán)菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 稱(chēng)取蜜環(huán)菌甲素標(biāo)準(zhǔn)品（純度HPLC≥98%，實(shí)驗(yàn)室自制）1 mg，加入甲醇溶液定容至10 mL，即配制成濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液，分別稀釋成為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL 的工作液，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)波長(zhǎng)217 nm 處測(cè)量得到蜜環(huán)菌甲素質(zhì)量濃度隨吸光度值變化的方程為Y＝1.84x＋0.0961（=0.9997）。

1.2.5 蜜環(huán)菌素含量及提取物得率計(jì)算 將濃縮液移入被烘干的蒸發(fā)皿中，等到它冷卻至室溫后稱(chēng)定質(zhì)量。并取1 mL 濃縮液以甲醇稀釋至100 倍后，以甲醇為空白對(duì)照進(jìn)行校正，測(cè)其吸光度，超聲輔助法下液態(tài)菌絲體/野生子實(shí)體提取物得率及其中蜜環(huán)菌素含量的計(jì)算公式如下：

式中：Y-吸光度；c-蜜環(huán)菌素濃度（mg/mL）；C-蜜環(huán)菌素含量（mg/g）；V-體系總體積（mL）；n-稀釋倍數(shù)；m-蜜環(huán)菌素提取物質(zhì)量（g）；M-提取物濃縮液質(zhì)量（g）；M-榛蘑用量（g）。

1.2.6 單因素實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取適量的榛蘑菌絲體粉、子實(shí)體粉和一定量的石油醚于燒杯中，超聲波細(xì)胞破碎儀處理后，將實(shí)驗(yàn)原料和石油醚轉(zhuǎn)移到索氏提取器中，讓蜜環(huán)菌素充分溶解出。固定因素水平為料液比1:20 g/mL、超聲波功率300 W、超聲波時(shí)間20 min 和溶劑回流時(shí)間50 min，考察不同料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）、超聲波功率（200、250、300、350、400 W）、超聲時(shí)間（10、15、20、25、30 min）和溶劑回流時(shí)間（10、30、50、70、90 min）對(duì)榛蘑中提取物得率和蜜環(huán)菌素類(lèi)物質(zhì)含量的影響情況，用以確定超聲波輔助法提取液態(tài)菌絲體和野生子實(shí)體提取物各個(gè)因素的優(yōu)水平。

1.2.7 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，選擇適當(dāng)?shù)乃竭M(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)，確定超聲波輔助法提取液態(tài)菌絲體和野生子實(shí)體提取物的最佳工藝條件。采用四因素三水平的正交試驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案的因素水平表如表1 所示。

表1 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 L9 (34) Orthogonal experimental design factor level table

1.2.8 榛蘑菌絲體提取物的UHPLC-MS/MS 檢測(cè)分析 取榛蘑液態(tài)菌絲體、野生榛蘑子實(shí)體提取物0.01 g于5 mL 離心管中，加入1.5 mL 的70%甲醇，渦旋1 min，于4 ℃冰箱冷藏浸提過(guò)夜，加入100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)二-氯苯丙氨酸10 μL，使樣品溶液中內(nèi)標(biāo)濃度1 μg/mL。再進(jìn)行4 ℃、5000 r/min 離心5 min，取出上清液根據(jù)物質(zhì)內(nèi)含物含量進(jìn)行稀釋?zhuān)^(guò)0.22 μm濾膜后上機(jī)。參數(shù)設(shè)置為30 ℃柱溫，0.3 mL/min流速，A 相水+0.1%甲酸和B 相純乙腈組合的流動(dòng)相，2 μL 進(jìn)樣量，4 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器溫度。正模式參數(shù)設(shè)置為325 ℃加熱器溫度，45 arb 鞘氣流速，15 arb輔助氣流速，1 arb 吹掃氣流速，3.5 kV 電噴霧電壓，330 ℃毛細(xì)管溫度，55% S-Lens RF Level。負(fù)模式參數(shù)設(shè)置為325 ℃加熱器溫度，45 arb 鞘氣流速，15 arb 輔助氣流速，1 arb 吹掃氣流速，3.5 kV 電噴霧電壓，330 ℃毛細(xì)管溫度，55% S-Lens RF Level。掃描模式為一級(jí)全掃描（Full Scan，m/z 100～1500）與數(shù)據(jù)依賴(lài)性二級(jí)質(zhì)譜掃描（dd-MS2，TopN=10），參數(shù)設(shè)置為120000（一級(jí)質(zhì)譜）、60000（二級(jí)質(zhì)譜）分辨率，高能量碰撞解離（HCD）碰撞模式。流動(dòng)相梯度洗脫程序：0.0～11.1 min，95%～10% A；11.0～12.0 min，10%A；12.0～12.1 min，10%～95% A；12.1～14.0 min，95%A。利用色譜圖中對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間和MS/MS 信息對(duì)被檢測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定性，采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)化合物濃度進(jìn)行定量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)形式表示。利用Excel 2007 和 Origin 2018 對(duì)生物學(xué)特性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，差異顯著水平為＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助提取蜜環(huán)菌素條件優(yōu)化

2.1.1 料液比對(duì)蜜環(huán)菌素提取的影響 根據(jù)1.2.6 進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察料液比對(duì)蜜環(huán)菌素提取的影響，所得結(jié)果如下圖3 所示。

圖3 料液比對(duì)菌絲提取物得率及其中蜜環(huán)菌素含量的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on yield of Armillaria mellea extract and the content of Melleolides

超聲波細(xì)胞破碎法是利用超聲在提取溶劑中使能量產(chǎn)生和傳遞，生成強(qiáng)烈的空化效應(yīng)，瞬間破裂細(xì)胞壁和整個(gè)生物體，可使有效成分充分溶出達(dá)到提高提取率的目的。如圖3 所示，隨著料液比的增加，榛蘑菌絲提取物得率及其中蜜環(huán)菌素提取量也逐漸增加，當(dāng)料液比1:20 g/mL 的情況下，液態(tài)菌絲體和野生子實(shí)體提取物得率和提取出的蜜環(huán)菌素都達(dá)到最高值，液態(tài)菌絲體提取物得率為20.5%，蜜環(huán)菌素含量為0.401±0.0049 mg/g；野生子實(shí)體提取物得率為18.9%，蜜環(huán)菌素含量為0.386±0.008 mg/g，均低于菌絲體，可能是由于子實(shí)體的細(xì)胞壁較堅(jiān)固，破碎率低于菌絲體，從而導(dǎo)致溶于溶劑成分較少。楊峻山等以1 kg榛蘑菌絲體干燥物為原料，用丙酮進(jìn)行溶劑萃取，最終得到35 mg 蜜環(huán)菌寅素、56 mg 蜜環(huán)菌丑素、42 mg蜜環(huán)菌丁素，綜合蜜環(huán)菌素得率為0.013%，較于本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證石油醚作為提取溶劑更佳。之后隨著料液比的增加，提取物得率和蜜環(huán)菌素提取量逐漸降低，可能是因?yàn)楫?dāng)所使用的石油醚量較少時(shí)，提取溶劑不能充分進(jìn)入榛蘑的子實(shí)體和菌絲體中，不能充分帶出有效活性成分，使其溶解于提取溶劑中。隨著提取溶劑用量的增加，子實(shí)體和菌絲體與溶劑接觸面積增大，利于蜜環(huán)菌素的提取，但提取溶劑用量過(guò)大時(shí)，溶劑吸收到超聲波能會(huì)增大，子實(shí)體和菌絲體吸收的超聲波能減少，細(xì)胞壁破壞不充分，蜜環(huán)菌素?zé)o法充分溶出。綜合考慮提取效率和經(jīng)濟(jì)效應(yīng)等因素，確定最佳料液比為1:20 g/mL。

2.1.2 超聲波功率對(duì)蜜環(huán)菌素提取的影響 根據(jù)1.2.6 進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察超聲波功率對(duì)蜜環(huán)菌素提取的影響，所得結(jié)果如下圖4 所示。

圖4 超聲波功率對(duì)榛蘑菌絲提取物得率及其中蜜環(huán)菌素含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of Armillaria mellea extracts and the content of Melleolides

如圖4 所示，隨著超聲波功率的增加，榛蘑菌絲提取物得率和蜜環(huán)菌素提取量也逐漸增加，當(dāng)超聲波功率為300 W 時(shí)，菌絲體和子實(shí)體提取出的蜜環(huán)菌素都達(dá)到最高值，菌絲體提取物得率為22.7%，蜜環(huán)菌素的含量為0.582±0.0052 mg/g；子實(shí)體提取物得率為19.8%，蜜環(huán)菌素的含量為0.533±0.006 mg/g。王春蘭等以石油醚為提取溶劑，采用索氏提取器回流提取榛蘑12 h，菌絲體中得到0.0085%的蜜環(huán)菌甲素、0.0002%蜜環(huán)菌戊素，子實(shí)體中得到0.002%蜜環(huán)菌甲素，0.0011%蜜環(huán)菌戊素，菌絲體中蜜環(huán)菌素提取率優(yōu)于子實(shí)體，并對(duì)比本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)超聲波細(xì)胞破碎儀的加入明顯優(yōu)化了蜜環(huán)菌素的提取率。之后蜜環(huán)菌素提取量與超聲波功率呈負(fù)相關(guān)。這種變化情況可能是由于較低超聲波功率時(shí)，子實(shí)體和菌絲體完整細(xì)胞被破碎程度都較低，蜜環(huán)菌素從細(xì)胞內(nèi)透過(guò)細(xì)胞壁滲出到提取溶劑的量較少。隨著超聲波功率的提升，增強(qiáng)了空化效應(yīng)強(qiáng)度，使得完整細(xì)胞的細(xì)胞壁和整個(gè)生物體都能夠破裂，加速提取物及其蜜環(huán)菌素的溶出。但當(dāng)超聲波功率過(guò)大時(shí)，一方面可能空化氣泡產(chǎn)生過(guò)多，阻礙超聲波在液體介質(zhì)的傳播；另一方面可能細(xì)胞破碎程度過(guò)大，多余成分溶出，甚至蜜環(huán)菌素類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)都能遭到破壞。綜合考慮提取效率和成本等因素，確定最佳超聲波功率為300 W。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)蜜環(huán)菌素提取的影響 根據(jù)1.2.6進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察超聲時(shí)間對(duì)蜜環(huán)菌素提取的影響，所得結(jié)果如圖5 所示。

如圖5 所示，隨著超聲時(shí)間的增加，榛蘑菌絲中提取物得率和蜜環(huán)菌素提取量也逐漸增加，當(dāng)超聲時(shí)間為20 min 時(shí)，菌絲體和子實(shí)體提取出的蜜環(huán)菌素都達(dá)到最高值，菌絲體提取物得率為25.9%，蜜環(huán)菌素的含量為0.582±0.0053 mg/g；子實(shí)體提取物得率為21.4%，蜜環(huán)菌素的含量為0.533±0.0078 mg/g，略低于菌絲體。之后隨著超聲波時(shí)間的增加，提取物得率和提取出的蜜環(huán)菌素逐漸降低。這可能是因?yàn)楫?dāng)超聲波時(shí)間較短時(shí)，超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)不夠持久，不利于榛蘑子實(shí)體和菌絲體的細(xì)胞破碎和蜜環(huán)菌素的溶出。隨著超聲波時(shí)間的繼續(xù)增加，細(xì)胞壁和整個(gè)生物體都能夠充分破裂，加速蜜環(huán)菌素的溶出。但當(dāng)超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，造成提取溶劑的揮發(fā)，并增加榛蘑內(nèi)其他成分的溶出，使提取溶劑中含有過(guò)多其他成分，一部分蜜環(huán)菌素結(jié)構(gòu)可能遭到破壞，導(dǎo)致蜜環(huán)菌素得率的降低。因此選取超聲提取時(shí)間20 min 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 超聲波時(shí)間對(duì)榛蘑菌絲提取物得率及其中蜜環(huán)菌素含量的影響Fig.5 Effects of ultrasonic time on yield of Armillaria mellea extract and the content of Melleolides

2.1.4 溶劑回流時(shí)間對(duì)蜜環(huán)菌素提取的影響 根據(jù)1.2.6 進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察溶劑回流時(shí)間對(duì)蜜環(huán)菌素提取的影響，所得結(jié)果如下圖6 所示。

圖6 溶劑回流時(shí)間對(duì)榛蘑菌絲提取物得率及其中蜜環(huán)菌素含量的影響Fig.6 Effect of solvent reflux time on yield of Armillaria mellea extract and the content of Melleolides

如圖6 所示，隨著溶劑回流時(shí)間的增加，榛蘑中蜜環(huán)菌素提取量也逐漸增加，當(dāng)溶劑回流時(shí)間為50 min 時(shí)，菌絲體提取物得率為26.8%，蜜環(huán)菌素的含量為0.741±0.0054 mg/g；子實(shí)體提取物得率為22.7%，蜜環(huán)菌素的含量為0.689±0.008 mg/g。之后隨著溶劑回流時(shí)間的增加，提取物得率和提取出的蜜環(huán)菌素變化幅度較小。這種現(xiàn)象的發(fā)生可能是由于當(dāng)溶劑回流時(shí)間較短時(shí)，榛蘑子實(shí)體和菌絲體粉末與提取溶劑接觸不夠充分，不利于蜜環(huán)菌素的溶出。隨著溶劑回流時(shí)間的繼續(xù)增加，子實(shí)體與菌絲體的粉末能達(dá)到與提取溶劑多次充分接觸的效果，蜜環(huán)菌素溶出較充分。但當(dāng)溶劑回流時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，一方面會(huì)導(dǎo)致提取溶劑的揮發(fā)過(guò)多，提取溶劑的減少導(dǎo)致溶劑的溶解度達(dá)到上限，因此限制了蜜環(huán)菌素的滲出；另一方面可能是由于物料本身的蜜環(huán)菌素剩余含量低，溶解速度減慢，導(dǎo)致蜜環(huán)菌素提取速率下降。綜合經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境保護(hù)等因素，溶劑回流時(shí)間50 min 時(shí)提取率最優(yōu)，但綜合考慮各種因素和效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)溶劑回流時(shí)間對(duì)蜜環(huán)菌素提取的得率影響不是很大，后期投入工業(yè)生產(chǎn)時(shí)可舍去該因素。

2.1.5 蜜環(huán)菌素提取正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝方案，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。

表2 結(jié)果所示，以蜜環(huán)菌素的含量為考察指標(biāo)，可知上述四個(gè)單因素影響蜜環(huán)菌素提取程度的緊要順序?yàn)镃＞B＞D＞A，即超聲波時(shí)間＞超聲波功率＞溶劑回流時(shí)間＞料液比。超聲波輔助萃取對(duì)蜜環(huán)菌素提取最佳優(yōu)化條件為CBDA，即料液比1:20 g/mL，超聲波功率300 W，超聲波時(shí)間20 min，溶劑回流時(shí)間50 min。根據(jù)上述條件，平行測(cè)定3 次，提取物得率為26.0%、26.8%、27.6%，提取物中蜜環(huán)菌素的含量分別為0.733、0.74、0.747 mg/g，實(shí)驗(yàn)證明此條件下提取物得率為26.8%，蜜環(huán)菌素含量為0.74 mg/g。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

2.2 野生榛蘑子實(shí)體和液態(tài)菌絲體提取物中化合物的分析

經(jīng)過(guò)UHPLC-MS/MS 技術(shù)對(duì)野生榛蘑子實(shí)體、液態(tài)菌絲體提取物在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行鑒定和定性分析，所得離子流（TIC）圖如圖7 所示。菌絲體、子實(shí)體提取物分別共檢測(cè)到482、1147 個(gè)化合物，經(jīng)化源網(wǎng)（https://www.chemsrc.com/）、Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Chemspider（http://www.chemspider.com/）數(shù)據(jù)庫(kù)中化學(xué)式、分子量、結(jié)構(gòu)、色譜行為等相關(guān)信息比對(duì)，分析出液態(tài)菌絲體提取物中305 個(gè)化合物，總含量為40.18 μg/mL，野生榛蘑子實(shí)體提取物中592 個(gè)化合物，總含量為129.588 μg/mL?；衔锓N類(lèi)的鑒定結(jié)果：除蜜環(huán)菌素類(lèi)物質(zhì)外，檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)了萜類(lèi)、酚類(lèi)、黃酮類(lèi)、香豆素類(lèi)、酯類(lèi)、固醇類(lèi)、鞘脂類(lèi)、氨基酸類(lèi)、多肽類(lèi)、蛋白類(lèi)、酸、醛、醇、嘌呤、嘧啶、核苷類(lèi)、酰胺類(lèi)、生物堿、胺類(lèi)、巴比妥類(lèi)、酮類(lèi)、醌類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)以及其它等多類(lèi)物質(zhì)。本研究榛蘑菌絲體提取物與已報(bào)道的榛蘑活性物質(zhì)研究相比，新檢出了石竹素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、去氫木香內(nèi)酯、圓柚酮、咖啡油醇、小白菊內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、七葉膽皂甙、梓苷、甲基柏木酮、豨薟精醇、木香烴內(nèi)酯、黑麥草內(nèi)酯、丙泊酚、異草甘素、含羞草素化合物。

圖7 UHPLC-MS/MS 分析榛蘑菌絲體、子實(shí)體提取物得到的一級(jí)總離子流圖Fig.7 First-order total ion chromatograms obtained from UHPLC-MS/MS analysis of Armillaria mycelium and fruit body extracts

2.3 提取物中蜜環(huán)菌素類(lèi)成分解析

如表3 所示，本實(shí)驗(yàn)從榛蘑中分離鑒定出16 種蜜環(huán)菌素和5 種疑似蜜環(huán)菌素碎片，其中液態(tài)菌絲體和野生榛蘑子實(shí)體同有成分有8 種：化合物1、3～5、7、12，碎片A、B，菌絲體獨(dú)有成分有10 種：化合物6、9、10、13～18，碎片C，子實(shí)體獨(dú)有成分有3 種：化合物19、碎片D 和E。楊峻山等對(duì)液態(tài)絲體中蜜環(huán)菌素的質(zhì)譜進(jìn)行研究，解析其化學(xué)結(jié)構(gòu)與質(zhì)譜裂解方式關(guān)系，將本實(shí)驗(yàn)所呈現(xiàn)的結(jié)果與其進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)碎片A、B、C、D、E 均有出現(xiàn)，對(duì)其進(jìn)行部分裂解方式還原推導(dǎo)?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式如圖8 所示。

圖8 蜜環(huán)菌素及其碎片結(jié)構(gòu)式Fig.8 Melleolides and its fragment structure注：化合物信息詳見(jiàn)表3。

表3 蜜環(huán)菌素類(lèi)化合物分析結(jié)果Table 3 Results of Melleolide compounds analysis

液態(tài)菌絲體提取物中蜜環(huán)菌素類(lèi)總量約為2.551 μg/mL，碎片總含量約為0.588 μg/mL，其中蜜環(huán)菌甲素含量最高，約為1.319 μg/mL，碎片A 次之，約為0.439 μg/mL；子實(shí)體提取物中蜜環(huán)菌素類(lèi)總量約為2.413 μg/mL，碎片總含量約為 2.124 μg/mL，其中碎片D 的含量最高，約為1.902 μg/mL，蜜環(huán)菌甲素次之，約為1.584 μg/mL。從表中數(shù)據(jù)可以分析出液態(tài)菌絲體提取物種類(lèi)和蜜環(huán)菌素含量都優(yōu)于野生子實(shí)體提取物，且10-dehydroxymelleoloede、蜜環(huán)菌辛素、Arnamiol、蜜環(huán)菌壬素、A52a、4-dehydroxyarmillarin、蜜環(huán)菌丙素、（4R,5S,7R,9S,13R）-2’,5-epoxy-4-dehydroxyarmillarin、4’-demethoxyarmillaribin都只在菌絲體中有檢測(cè)出。程顯好等對(duì)榛蘑菌絲體和子實(shí)體進(jìn)行蜜環(huán)菌素類(lèi)的HPLC-DAD 檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)只有菌絲體檢測(cè)圖譜上存在蜜環(huán)菌素類(lèi)吸收峰，并猜測(cè)可能是由于蜜環(huán)菌素在子實(shí)體中含量低于可檢測(cè)水平而未檢測(cè)出，也證明了榛蘑菌絲體中的蜜環(huán)菌素類(lèi)成分高于子實(shí)體的，且差異明顯。

與張珊珊等對(duì)榛蘑菌絲體進(jìn)行超聲波提取相比，本實(shí)驗(yàn)利用超聲波細(xì)胞破碎輔助石油醚萃取榛蘑菌絲體中蜜環(huán)菌素成分新增了0.086 μg/mL 4-Methyoxymelleolide、0.072 μg/mL Arnamiol、0.063 μg/mL 6’-Dechloroarnamial。其中Arnamiol 能起到抑制人白血病T 細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞、人急性淋巴白血病細(xì)胞、人結(jié)腸癌HCT-116 細(xì)胞作用，對(duì)癌細(xì)胞存在毒性。蜜環(huán)菌素具有抗菌活性和對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性，能作為癌癥治療或輔助治療的潛在候選藥物。

3 結(jié)論

本研究利用超聲波細(xì)胞破碎儀，以東北榛蘑子實(shí)體及其分離所得母體菌株在液態(tài)培養(yǎng)下的菌絲體為研究對(duì)象，獲得了優(yōu)化的提取工藝為料液比1:20 g/mL，超聲波功率300 W，超聲時(shí)間20 min，溶劑回流時(shí)間50 min，該條件下液態(tài)菌絲體提取物得率為26.8%，蜜環(huán)菌素含量0.74 mg/g；采用UHPLCMS/MS 技術(shù)對(duì)榛蘑菌絲體提取物和子實(shí)體提取物的組分進(jìn)行檢測(cè)分析，得出榛蘑菌絲體提取物種類(lèi)及含量都優(yōu)于子實(shí)體提取物，且10-dehydroxymelleoloede、蜜環(huán)菌辛素、Arnamiol、蜜環(huán)菌壬素、A52a、4-dehydroxyarmillarin、蜜環(huán)菌丙素、(4R,5S,7R,9S,13R)-2’,5-epoxy-4-dehydroxyarmillarin、4’-demethoxyarmillaribin 都只在菌絲體中有檢測(cè)出。對(duì)液態(tài)菌絲體提取物成分的深入研究，為尋找新化合物，輔助抗癌新型藥物的開(kāi)發(fā)或降低化療藥物對(duì)機(jī)體的損傷，開(kāi)發(fā)輔助功能食品提供了新資源。