可溶性青梅果膠的表征及其對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW246.7 巨噬細(xì)胞炎癥的抑制作用

侯佳麗，朱珍珠，謝旻浩，楊 倩，劉 琴

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210023）

青梅（，薔薇科杏屬植物）是一種在中國(guó)廣泛種植的重要觀賞植物。近年來(lái)，隨著青梅種植面積的逐漸擴(kuò)大，青梅果的產(chǎn)量也不斷增多，青梅果加工業(yè)發(fā)展需求日益增加。青梅果在傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)中可被用來(lái)治療腹瀉、咳嗽等疾病，具有藥食同源的特性。目前對(duì)于青梅果的營(yíng)養(yǎng)功能研究主要集中在對(duì)其多酚、萜類(lèi)、有機(jī)酸等生物活性物質(zhì)上，對(duì)于其主要多糖成分——果膠的研究還未見(jiàn)報(bào)道。果膠主要存在于植物細(xì)胞壁中，通常與纖維素、半纖維素等大分子相結(jié)合，一部分果膠以游離形式存在于果汁中（可溶性果膠），這部分果膠作為可溶性膳食纖維對(duì)腸道健康起著促進(jìn)作用。為深入了解青梅果的功能特性，有必要對(duì)青梅果中的可溶性果膠進(jìn)行研究。

植物多糖一般具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和改善腸道健康等多種生物功能，果膠作為多糖的一種，抗炎活性是其主要生物活性之一。如Li等從豆腐柴葉子中提取果膠，結(jié)果表明堿法提取的果膠具有較強(qiáng)的抗氧化性，并能對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞的炎癥具有顯著的抑制作用。多糖的抗炎機(jī)理與細(xì)胞內(nèi)的多種信號(hào)通路相關(guān)，其中包括重要的炎癥轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Janus 激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）信號(hào)通路。Le 等對(duì)從豆渣中提取的多糖（MESP）的抗炎作用及其機(jī)理進(jìn)行了研究，他們發(fā)現(xiàn)MESP 可抑制細(xì)胞JAK/STAT 信號(hào)通路中JAK2 和STAT3 蛋白的磷酸化水平，從而抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道果膠寡糖對(duì)結(jié)腸炎癥的緩解作用也與JAK/STAT 信號(hào)通路相關(guān)。青梅果膠作為天然植物多糖的一種，可能通過(guò)相似的抗炎機(jī)制發(fā)揮抗炎活性。

本研究從青梅果汁中提取可溶性果膠（WSP），并對(duì)其結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行分析，同時(shí)采用LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥模型，從細(xì)胞水平評(píng)估青梅果中可溶性果膠對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，并探討它對(duì)JAK/STAT 通路的影響，為揭示果膠的抗炎機(jī)制，全面了解青梅果的健康促進(jìn)功能，推動(dòng)青梅果加工業(yè)的發(fā)展，以及進(jìn)一步提高青梅果加工附加值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

RAW264.7 細(xì)胞 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)；青梅果 南京農(nóng)力佳農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供，2020 年5 月收獲于南京溧陽(yáng)；DMEM 培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)牛胚胎血清（FBS）美國(guó)Gibco 公司；青霉素-鏈霉素混合溶液 北京索萊寶科技有限公司；ELISA 試劑盒（IL-6、IL-10、TNF-和IFN-）北京四正柏生物科技有限公司；TRIzol試劑 Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA 試劑盒、-actin、STAT3、p-STAT3、抗體辣根過(guò)氧化物標(biāo)記山羊抗鼠和山羊抗兔IgG（HRP）上海碧云天生物技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒 南京諾唯贊生物科技股份有限公司；JAK1 英國(guó)abcam 公司；p-JAK1 美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；葡聚糖T 系列標(biāo)品（T-300、T-150、T-10、T-5）、脂多糖（LPS）、咔唑等其余化學(xué)試劑 阿拉丁試劑（上海）有限公司；單糖標(biāo)品（≥99%）上海源葉生物有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

SKG 大口徑原汁機(jī) 廣東艾詩(shī)凱奇智能科技有限公司；TM-3000 掃描電子顯微鏡、U-3900 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本日立公司；X 射線衍射儀 德國(guó)Bruker AXS；Freezone 2.5 真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)LABCONCO 公司；Agilent 1260 高效液相色譜儀美國(guó)Agilent 公司；Waters 1525 高效凝膠過(guò)濾色譜儀 美國(guó)Waters 公司；Tensor 27 傅里葉紅外光譜儀 德國(guó)Bruker 公司；Heracell 240i CO培養(yǎng)箱微量、U-3900 紫外分光光度計(jì) 日本日立公司；Axio Vert.A1 倒置式生物顯微鏡 北京Precise 儀器有限公司；SpectraMax? M2/M2e 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices 公司；Archimed-X4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀 北京鯤鵬基因科技有限責(zé)任公司；EPS-300 電泳儀、Tanon-5200 化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀 上海天能科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 可溶性青梅果膠（WSP）的提取 根據(jù)Wellala等的方法提取果汁中的可溶性果膠，具體如下：新鮮的青梅果用榨汁機(jī)榨汁，將果汁過(guò)濾并減壓濃縮。濃縮后的青梅果汁中加入6 倍體積95%的乙醇，攪拌2 h，得到果膠粗提物的沉淀，將沉淀用丙酮洗滌，經(jīng)過(guò)濾、干燥后重新用超純水溶解，并使用透析袋（3.5 kDa）在蒸餾水中透析72 h，得到進(jìn)一步純化后的果膠溶液，經(jīng)濃縮后在3.0 Pa，-80 ℃條件下進(jìn)行真空冷凍干燥，得到WSP 凍干粉。

1.2.2 可溶性青梅果膠（WSP）的表征

1.2.2.1 果膠中半乳糖醛酸（GalA）的測(cè)定 參照Z(yǔ)hou 等的方法并略有修改。將WSP 凍干粉配成1 mg/mL 的溶液。將果膠溶液與濃硫酸按體積比1:6 在冰浴下混勻，隨后在85 ℃水浴中加熱15 min，冷卻至室溫后加入0.5 mL 0.15%咔唑無(wú)水乙醇搖勻，并在暗處放置1.5 h。測(cè)定其在528 nm下的吸光度。以半乳糖醛酸為標(biāo)品，計(jì)算果膠樣品中半乳糖醛酸含量。

1.2.2.2 果膠中單糖的組成測(cè)定 WSP 中的單糖組成按照Z(yǔ)hang 等的方法測(cè)定。

色譜條件：采用ZORBAX Eclipse XDB-C（4.6 mm × 250 mm,5 μm）色譜柱，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，進(jìn)樣體積為10 μL，流速1 mL/min，用流動(dòng)相A 和B（分別為含15%和40%乙腈的pH7.0 的磷酸緩沖溶液）按如下梯度進(jìn)行洗脫：0～10 min，0～15% B；10～30 min，15%～25% B，洗脫時(shí)間為30 min。以果膠中常見(jiàn)的單糖標(biāo)品（甘露糖，鼠李糖，葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖和巖藻糖）為對(duì)照，通過(guò)它們的保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)對(duì)WSP 中的單糖進(jìn)行定性和定量分析。

1.2.2.3 果膠分子量測(cè)定 配制2 mg/mL WSP 水溶液，用高效凝膠過(guò)濾色譜（HPGFC）與示差折光檢測(cè)器（RID）測(cè)定果膠樣品的分子量（Mw）和分布。具體方法如下：采用兩個(gè)色譜柱（Ultrahydrogel TM Linear 300 mm×7.8 mmid）串聯(lián)進(jìn)行分離，設(shè)定柱溫40 °C，流速0.8 mL/min，用含有0.05% NaN的NaNO（0.1 mol/L）溶液為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，進(jìn)樣體積為20 μL，洗脫時(shí)間為30 min。以葡聚糖（Dextran）T-300（Mw=300600）、DextranT-150（Mw=135030）、Dextran T-10（Mw=9750）和Dextran T-5（Mw=2700）為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分子量計(jì)算。

1.2.2.4 傅里葉紅外光譜檢測(cè) 青梅果膠粉末與溴化鉀按1:200 混合壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定樣品在4000～400 cm范圍的吸收光譜。

1.2.2.5 掃描電鏡（SEM）用導(dǎo)電膠帶將果膠粉末固定在樣品架上，并在真空下濺射金粉，然后在兩種放大倍數(shù)下（×0.5 k 和×1.5 k）通過(guò)15 kV 的加速電壓照相，來(lái)獲取果膠形態(tài)的圖片。

1.2.2.6 X 射線衍射（XRD）果膠粉末樣品的結(jié)構(gòu)用X 射線衍射儀進(jìn)行測(cè)定，掃描范圍為0～80 度衍射角，Cu-K輻射，電壓設(shè)置為40 kV，電流為40 mA。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7 細(xì)胞以1×10個(gè)/mL 的密度接種于96 孔板中，用含有10%胎牛血清（FBS）、1%抗生素（100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 硫酸鏈霉素和0.25 μg/mL 兩性霉素B）的DMEM 全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)?？刂茰囟葹?7 ℃，CO濃度為5%。24 h 后給藥預(yù)處理4 h，然后加入5 μL LPS 的磷酸緩沖溶液（PBS），使其在1 μg/mL的LPS 刺激下培養(yǎng)24 h，具體分組如下：

樣品組：分別用含50、100、200 μg/mL WSP 的DMEM 溶液預(yù)處理4 h，然后加入LPS 繼續(xù)培養(yǎng)24 h；模型組（LPS 組）：用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h 后加入LPS 繼續(xù)培養(yǎng)24 h；正常組（Control 組）：用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h 后加入5 μL PBS 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 果膠的毒性評(píng)價(jià)（MTT 法）按照1.2.3 進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和分組實(shí)驗(yàn)，WSP 的濃度設(shè)置為50、100、200、500 μg/mL，經(jīng)4 h 給藥處理和24 h LPS 刺激培養(yǎng)后，將培養(yǎng)液換成5 mg/mL 的噻唑藍(lán)（MTT）溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后去掉上清液，加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），在37 ℃下振蕩15～20 min，用酶標(biāo)儀在490 nm 處讀取各孔的OD 值。

1.2.5 LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞分泌的細(xì)胞炎癥因子含量測(cè)定 收集按1.2.3 中方法處理的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清液，按照ELISA 試劑盒的操作說(shuō)明，分別測(cè)定上清液中TNF-、IL-6、IL-10 和IFN-的含量。

1.2.6 RAW264.7 細(xì)胞中JAK/STAT 通路相關(guān)基因mRNA 表達(dá)測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以2×10～4×10個(gè)/mL 的密度接種至12 孔板，分組同1.2.3，24 h 后用Trizol 試劑提取細(xì)胞中的RNA，微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的說(shuō)明操作，置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀中，進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)，反應(yīng)完畢后采用差異倍數(shù)2計(jì)算mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平，至少進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)。相關(guān)引物序列如表1 所示。

表1 內(nèi)參β-actin 和JAK/STAT 通路相關(guān)基因引物序列Table 1 The sequence of the primer of reference β-actin and relative genes in JAK/STAT pathway

1.2.7 RAW264.7 細(xì)胞中JAK/STAT 通路相關(guān)蛋白表達(dá)測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1×10個(gè)/mL 的密度接種至6 孔板中，按1.2.3 中的方法分組培養(yǎng)，孵育24 h 后移除上清，用PBS 清洗后加入200 μL的裂解液進(jìn)行裂解，然后在4 ℃和12000 r/min 下離心15 min，用BCA 試劑盒測(cè)定上清的蛋白含量，在95 ℃下加熱5 min 使蛋白質(zhì)變性。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳儀（SDS-PAGE）進(jìn)行電泳，先在80 V 恒電壓下電泳30 min，然后在120 V 恒電壓下電泳60 min，電泳結(jié)束后將膠片轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜（Millipore，美國(guó)）上，用5%脫脂牛奶4 ℃封閉40 min；PBST 中沖洗后，分別加入JAK1、STAT3、p-JAK1、p-STAT3 和-actin 抗體，4 ℃下孵育過(guò)夜，回收一抗。PBST 沖洗后4 ℃孵育二抗1 h，回收二抗，用PBST 清洗PVDF 膜洗4 次后將用化學(xué)發(fā)光顯影液滴加在PVDF 膜上，反應(yīng)1 min后用化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀進(jìn)行顯影。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS、GraphPad Prism 7.0 和Origin 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖，以ANOVA 進(jìn)行顯著性分析，＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性青梅果膠（WSP）的純度、單糖組成及分子量

半乳糖醛酸含量是果膠純度指標(biāo)，按照果膠標(biāo)準(zhǔn)（GB 25533-2010），用作食品添加劑的果膠中半乳糖醛酸含量不低于65%。根據(jù)紫外可見(jiàn)分光光度法得到WSP 的半乳糖醛酸含量為78.93%，說(shuō)明所提取的WSP 具有較高的純度。

果膠的單糖及其結(jié)構(gòu)域組成是其表征中的重要指標(biāo)，有研究表明，果膠的結(jié)構(gòu)與它的功能特性之間有著密切的聯(lián)系。圖1 是WSP 酸解后的單糖PMP衍生物的HPLC 色譜圖，可以看到WSP 中共檢測(cè)出七種單糖，定量分析結(jié)果見(jiàn)表2，果膠中的主要單糖是半乳糖醛酸（GalA）占總單糖含量的69.72%。而半乳糖（Gal）為主要的中性單糖，占單糖含量的18.36%，其次是阿拉伯糖（Ara）和鼠李糖（Rha），分別占6.31%和4.63%。有研究從蘋(píng)果、胡蘿卜和秋葵中提取水溶性果膠，發(fā)現(xiàn)其主要中性單糖也是半乳糖，與本研究結(jié)果一致，而Marcclin 等從番石榴中提取的水溶性果膠的主要中性單糖是阿拉伯糖。不同來(lái)源的果膠其中性糖組成有明顯差異。果膠主要是由同型半乳糖醛酸聚糖（HG）、鼠李半乳糖醛酸聚糖I 和II（RG-I 和RG-II）三個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域組成。根據(jù)單糖的組成，計(jì)算得到WSP 主要含HG 和RG-I 結(jié)構(gòu)域，占比分別為65.09%和33.93%。在抑制炎癥方面，果膠的HG 結(jié)構(gòu)域是緩解急性炎癥的優(yōu)先區(qū)域，而RG-I 區(qū)域的側(cè)鏈與半乳糖凝集素-3（Gal-3）可以緊密結(jié)合，對(duì)其抗炎作用也具有重要貢獻(xiàn)。

表2 WSP 的單糖和結(jié)構(gòu)域組成Table 2 Monosaccharide and region constitution of WSP

圖1 WSP 中單糖PMP 衍生物的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram of monosaccharide PMP derivate of WSP

果膠的分子量不僅與其乳化和凝膠特性等物理性質(zhì)有關(guān)，還與其生物功能，如抗氧化活性和對(duì)腸道健康的影響有關(guān)。通過(guò)高效凝膠過(guò)濾色譜與示差折光檢測(cè)器聯(lián)用（HPGFC-RID），以不同分子量的葡聚糖（Dextran）為標(biāo)品，對(duì)WSP 的分子量進(jìn)行了測(cè)定。圖2 為WSP 的高效凝膠過(guò)濾色譜，表3 為測(cè)定結(jié)果。由圖2 可以看到，WSP 高效凝膠過(guò)濾色譜分離出現(xiàn)兩個(gè)色譜峰，第一個(gè)峰的保留時(shí)間為15.60 min，其對(duì)應(yīng)的重均分子量（Mw）和數(shù)均分子量（Mn）分別為370.27 和45.91 kDa；而在19.60 min時(shí)出現(xiàn)第二個(gè)峰，其對(duì)應(yīng)的Mw 和Mn 分別是1.17和0.88 kDa；按照峰面積比和儀器自帶軟件ASTRA 7.3.2 計(jì)算得到WSP 的平均Mw 為353.73 kDa，平均Mn 為31.16 kDa，分散指數(shù)（PDI=Mw/Mn）為11.35。Zhou 等從山楂、蘋(píng)果、桃子和胡蘿卜中分別提取水溶性果膠，發(fā)現(xiàn)這四者的Mw 分別是80.6、128、396 和198 kDa，Li 等從秋葵莖中提取的水溶果膠其Mw 為178.4 kDa，本研究中WSP 的分子量與桃子中可溶性果膠的分子量接近。

圖2 WSP 的高效凝膠過(guò)濾色譜Fig.2 High performance gel filtration chromatogram of WSP

表3 WSP 的分子量分布Table 3 The molecular weight distribution of WSP

2.2 可溶性青梅果膠（WSP）紅外光譜特征及酯化度

WSP 的FTIR 光譜見(jiàn)圖3A。由圖3A 可以觀察到在3500～2900 cm處有一個(gè)大的包峰，該峰對(duì)應(yīng)的是羥基和羧基的O-H 伸縮振動(dòng)峰，由于氫鍵作用而形成了寬峰。在1736.89 cm處的吸收是由甲基酯化羧基的CO 伸縮振動(dòng)引起的，而1637.45 cm處的吸收峰是由游離羧基的CO 伸縮振動(dòng)引起的，在1529.17 cm處存在芳香環(huán)振動(dòng)峰。在950～1200 cm之間的吸收區(qū)中存在強(qiáng)烈的峰，可能是由于與糖苷鍵和吡喃環(huán)相關(guān)的振動(dòng)所致。通過(guò)計(jì)算1736.89 cm（COO-R）的峰面積與1637.45 cm（COO-）的峰面積之和的比值，可以得到WSP 的酯化度為18.89%，屬于低酯果膠。

2.3 可溶性青梅果膠（WSP）的形貌特征

為了分析WSP 的形貌特征，本研究采用X-射線衍射（XRD）和掃描電鏡（SEM）對(duì)其進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果分別見(jiàn)圖3B 和圖4。XRD（圖3B）結(jié)果顯示，WSP在21.78°處顯示出非常細(xì)小的尖峰，其余地方無(wú)明顯的峰，因此可以判斷它是含有少量微晶的無(wú)定型結(jié)構(gòu)。

圖3 WSP 的傅里葉紅外光譜（A）和X-射線衍射（B）Fig.3 Fourier transforms infrared spectrum (FTIR) (A) and Xray diffraction (XRD) (B) of WSP

圖4A 和4B 是用掃描電鏡在不同放大倍數(shù)下測(cè)得的WSP 的表面形態(tài)，由圖4A 可以看到，WSP表面是絲狀和片狀交聯(lián)的結(jié)構(gòu)，為非晶型結(jié)構(gòu)，與Pan 等從甜瓜中提取的水溶性果膠形態(tài)相似。放大后可以觀察到表面有少量凹凸的顆粒（圖4B），與XRD 測(cè)得有少量微晶結(jié)構(gòu)的結(jié)果一致。

圖4 WSP 的掃描電鏡Fig.4 Scanning electron microscope (SEM) of WSP

2.4 可溶性青梅果膠（WSP）對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞活性的影響

MTT 法對(duì)細(xì)胞存活率的測(cè)定結(jié)果如圖5 所示，WSP 在50～200 μg/mL 范圍內(nèi)不會(huì)對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率產(chǎn)生影響，而當(dāng)果膠濃度為500 μg/mL時(shí)，RAW264.7 細(xì)胞的存活率顯著降低（＜0.05）。因此選取50、100 和200 μg/mL 作為WSP 的低中高三個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 WSP 對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響Fig.5 Effect of WSP on viability of LPS-induced RAW264.7 cells

2.5 可溶性青梅果膠（WSP）對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥的影響

脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）作用于細(xì)胞表面會(huì)促進(jìn)大量的細(xì)胞因子如TNF-、IFN-、IL-6和IL-1等的釋放，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而IL-10 是一種重要的抗炎因子，它可以拮抗其他細(xì)胞因子（如TNF-、IL-6）的促炎作用，從而控制炎癥。本研究采用ELISA 法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子水平，探究WSP 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥的緩解作用，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6 可以看到，LPS 刺激下RAW 264.7 細(xì)胞的TNF-、IFN-、IL-6 和IL-10 的釋放量分別由正常組的5.62±0.06 ng/mL，69.01±4.43 pg/mL，15.75±9.17 pg/mL和 116.99±1.74 pg/mL 增加至39.02±2.55 ng/mL，274.22±1.77 pg/mL，386.79±31.97 pg/mL 和521.24±12.57 pg/mL，即RAW264.7細(xì)胞在LPS 誘導(dǎo)作用下產(chǎn)生了較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)。而用WSP 預(yù)處理顯著抑制了促炎因子TNF-（＜0.05）、IFN-＜0.05）和IL-6（＜0.001）的產(chǎn)生，促進(jìn)抗炎因子IL-10 的分泌（＜0.01），并具有劑量依賴(lài)關(guān)系，說(shuō)明WSP 可顯著緩解LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的炎癥。研究表明果膠的抗炎活性與其酯化度相關(guān)，與高酯果膠相比，低酯果膠具有更好的抗炎活性。前面的分析表明，WSP 屬于低酯果膠，其酯化度僅為18.89%，因此WSP 的結(jié)構(gòu)有利于其發(fā)揮抗炎活性。

圖6 WSP 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥因子表達(dá)水平的影響Fig.6 The effect of WSP on the expression of inflammatory factors in LPS-induced RAW264.7 cells

2.6 可溶性青梅果膠（WSP）對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞JAK/STAT 通路的影響

JAK/STAT 信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)多種生物功能。JAK 家族中JAK1、JAK2、JAK3 和STAT 家族成員中的STAT1，STAT2 和STAT3 與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。在本研究中，首先考察了WSP 對(duì)JAK1、JAK2、JAK3 及STAT1，STAT2 和STAT3 的mRNA 表達(dá)的影響。從圖7 可以看到，LPS 處理后上述mRNA的表達(dá)量明顯下調(diào)。與LPS 組相比，高濃度組（200 μg/mL）WSP 預(yù)處理可顯著上調(diào)RAW264.7細(xì)胞上述所有JAK 及STAT 的mRNA 表達(dá)（＜0.01）。在低濃度WSP（50 μg/mL）的處理?xiàng)l件下，僅JAK1（＜0.001）和STAT3（＜0.05）的mRNA 的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，而JAK2、3 和STAT1、2 的mRNA表達(dá)與LPS 組相比無(wú)顯著性差異（＞0.05）。該結(jié)果表明，WSP 可調(diào)控JAK/STAT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中對(duì)JAK1 和STAT3 的影響最為顯著。

圖7 WSP 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞JAK/STAT 通路相關(guān)基因mRNA 含量表達(dá)的影響Fig.7 Effect of WSP on the mRNA expression of the genes related to JAK/STAT pathway in LPS-induced RAW264.7 cells

2.7 可溶性青梅果膠（WSP）對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞JAK1/STAT3 蛋白磷酸化的影響

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞因子IL-6、IL-10 及IFN-會(huì)激活JAK/STAT 信號(hào)通路，誘導(dǎo)JAK 的磷酸化以及JAK 介導(dǎo)的受體磷酸化，促進(jìn)非活化狀態(tài)的STAT單體變?yōu)榱姿峄腟TAT 二聚體，加劇炎癥反應(yīng)，抑制JAK 和STAT 磷酸化水平可緩解炎癥。磷酸化JAK 與JAK 表達(dá)量的比值（p-JAK1/JAK1）及磷酸化STAT 與STAT 表達(dá)量的比值（p-STAT/STAT）分別反映了細(xì)胞內(nèi)JAK 和STAT 由非活化狀態(tài)向磷酸化狀態(tài)轉(zhuǎn)化的程度，即磷酸化水平。結(jié)合JAK 家族和STAT 家族成員的mRNA 表達(dá)量結(jié)果，重點(diǎn)考察了WSP 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)JAK1和STAT3 磷酸化水平的影響。蛋白印跡法結(jié)果如圖8 所示，以-actin 作為內(nèi)參蛋白，與正常對(duì)照組相比，LPS 刺激后細(xì)胞內(nèi)P-JAK1/JAK1 比值顯著升高（＜0.001）（圖8A）；與此同時(shí)，P-STAT3/STAT3 比值也顯著升高（＜0.01）（圖8B）。這是因?yàn)楫?dāng)LPS作用于細(xì)胞膜后，會(huì)導(dǎo)致膜上受體傳遞相應(yīng)的信號(hào)給JAK 蛋白，從而活化JAK，使JAK 蛋白磷酸化，導(dǎo)致STAT 蛋白的磷酸化。當(dāng)WSP 預(yù)處理濃度為100 和200 μg/mL 時(shí)，與LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)p-JAK1/JAK1 和p-STAT3/STAT3 相比均顯著降低（＜0.05）。該結(jié)果進(jìn)一步表明，WSP 可通過(guò)下調(diào)巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥信號(hào)的JAK1 和STAT3 磷酸化水平而抑制LPS 誘導(dǎo)的炎癥。

圖8 WSP 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中p-JAK1、JAK1、p-STAT3 和STAT3 蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effect of WSP on the expression of p-JAK1,JAK1,p-STAT3 and STAT3 protein in LPS-induced RAW264.7 cells

3 結(jié)論

本研究從青梅果汁中提取了可溶性青梅果膠（WSP），確定了WSP 是酯化度為18.89%的低酯果膠，其中性糖以半乳糖含量最高（18.36%±0.42%），其次是阿拉伯糖（6.31%±0.17%）和鼠李糖（4.63%±0.01%），結(jié)構(gòu)域HG 和RG-I 的組成分別為65.09%和33.93%。通過(guò)構(gòu)建LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)WSP 可顯著抑制促炎因子TNF-（＜0.05）、IFN-（＜0.05）和IL-6（＜0.001）的釋放，促進(jìn)抗炎因子IL-10（＜0.01）的分泌，對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7 巨噬細(xì)胞炎癥起到有效的緩解作用。機(jī)理研究表明，WSP 是通過(guò)上調(diào)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)炎癥相關(guān)的JAK/STAT 信號(hào)通路中JAK 和STAT 家族mRNA 的表達(dá)，降低JAK 和STAT 家族相關(guān)蛋白的磷酸化水平而發(fā)揮抗炎作用。本研究可為全面評(píng)價(jià)青梅的健康促進(jìn)作用和提高青梅加工產(chǎn)品附加值提供參考。要深入了解WSP的抗炎機(jī)制，還需要進(jìn)一步研究比較WSP 對(duì)其它信號(hào)通路如NF-B 和MAPK 信號(hào)通路的影響。