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      天麻素調(diào)控SIRT3 改善BV2 細(xì)胞衰老和炎癥的作用

      2022-09-27 15:09:04高麗莎隋得志王斌勝
      食品工業(yè)科技 2022年19期
      關(guān)鍵詞:素組半乳糖天麻

      管 桐,高麗莎,隋得志,米 佳,王斌勝,

      (1.濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,山東煙臺(tái) 264003;2.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,山東煙臺(tái) 264003)

      隨著世界人口老齡化,與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的流行已成為一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題,給社會(huì)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,研究大腦和神經(jīng)細(xì)胞的衰老機(jī)制,將有助于制定有效的預(yù)防干預(yù)措施。在衰老的大腦中,衰老的神經(jīng)細(xì)胞也逐漸積累增加,加劇大腦的衰老,而改善腦中神經(jīng)細(xì)胞的衰老則能夠延緩大腦的衰老。在腦老化過程中,衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞逐漸積累,大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞占所有膠質(zhì)細(xì)胞的5%~12%,在生理或病理?xiàng)l件下作為常駐的免疫細(xì)胞或巨噬細(xì)胞,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的第一道防線,在感染、創(chuàng)傷、炎癥、缺血性疾病以及神經(jīng)退行性疾病中起著關(guān)鍵作用。盡管激活的小膠質(zhì)細(xì)胞能夠吞噬細(xì)胞碎片和病原體來調(diào)節(jié)微環(huán)境的穩(wěn)態(tài),并分泌不同的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以維持神經(jīng)元的存活,但小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活則會(huì)引起促炎介質(zhì)以及細(xì)胞毒性物質(zhì)如腫瘤壞死因子-(tumor necrosis factor,TNF-)、白細(xì)胞介素-1(interleukin 1IL-1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin 6,IL-6)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)等的過度釋放,加速神經(jīng)炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)退行性變。

      NAD+依賴性脫乙酰酶蛋白Sirtuin3(silent mating type information regulation 2 homolog 3)屬于Sirtuin 基因家族,主要存在于線粒體中。SIRT3 參與能量代謝、線粒體功能和氧化應(yīng)激以及炎癥的調(diào)節(jié),能夠?qū)古c衰老相關(guān)的疾病。同時(shí),SIRT3 已經(jīng)被確定為幾種炎癥相關(guān)疾病中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn),SIRT3 可能是引發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥的關(guān)鍵上游啟動(dòng)因子,在炎癥條件下,SIRT3 蛋白表達(dá)下降。在之前的研究中,描述了SIRT3 在神經(jīng)炎癥中的保護(hù)作用,但是很少有實(shí)驗(yàn)來研究SIRT3 對(duì)衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞的作用。在本研究中,使用D-半乳糖誘導(dǎo)BV2 細(xì)胞在體外建立一個(gè)衰老細(xì)胞模型,試圖探討SIRT3 在衰老的BV2 細(xì)胞中的具體作用。

      天麻()是蘭科植物天麻的塊莖,傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為,天麻具有平肝息風(fēng)、通絡(luò)止痛的功效,能夠廣泛用于治療頭疼、癲癇、頭暈、神經(jīng)痛以及高血壓等疾病。天麻中有多種有效成分,但天麻素(Gastrodin)是其中最重要的一種天然酚類成分。研究發(fā)現(xiàn),天麻素具有抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗衰老的作用,由于天麻素能夠穿越血腦屏障,通過清除活性氧,減少神經(jīng)毒性促炎物質(zhì)和脂質(zhì)過氧化而在不同的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。同時(shí),天麻作為一種藥食同源的中藥材,有極高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值,其明確指出的保健功能主要包括改善睡眠、增強(qiáng)機(jī)體免疫力,能夠調(diào)節(jié)血壓和血脂等。以天麻為主要原料的保健產(chǎn)品也被廣泛研究和開發(fā),被CFDA批準(zhǔn)的保健食品達(dá)30 多種。2019 年11 月,國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)、國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局聯(lián)合發(fā)布對(duì)天麻等9 種中藥按照食藥物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究,推進(jìn)了中藥材藥食同源產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。然而目前關(guān)于天麻素對(duì)衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)控作用尚未有深入研究。由于神經(jīng)炎癥是神經(jīng)退行性疾病的重要病理反應(yīng),而天麻素具有多種藥理學(xué)作用,因此本項(xiàng)研究以D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞建立衰老細(xì)胞模型,探討天麻素對(duì)衰老的BV2 細(xì)胞中炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用以及可能的機(jī)制,以期為開發(fā)治療神經(jīng)退行性疾病的新藥和保健產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

      1 材料和方法

      1.1 材料與儀器

      天麻素(純度≥98%)(SG8080)、CCK-8 試劑盒(CA1210)、TC 處理細(xì)胞爬片(YA0350)北京索萊寶生物科技有限公司;SIRT3 抑制劑(50 mg)(120241-79-4)MedChemExpress 公司;BV2 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株(CL-0493)、BV2 細(xì)胞專用培養(yǎng)基(CM-0493)武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司;細(xì)胞衰老-半乳糖苷酶(SA--Gal)染色試劑盒(C0602)、活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒(S0033S)、小鼠白細(xì)胞介素1(IL-1)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒(PI301)、小鼠白細(xì)胞介素6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒(PI326)、小鼠腫瘤壞死因子-(TNF-)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒(PT512)、SIRT3 兔抗蛋白(AF5303)、P16 兔抗蛋白(AF1069)、P21 兔抗蛋白(AF5252)、-actin(AF0003)、Alexa Fluor 555 標(biāo)記驢抗兔IgG(H+L)(A0453)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(A0208)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)、抗熒光淬滅封片劑(P0131)上海碧云天生物科技有效公司。

      Multiskan FC 酶標(biāo)儀、BB150-2TCS 二氧化碳培養(yǎng)箱、Sorvall Stratos 低溫冷凍高速離心機(jī) 美國(guó)Thermo Scientific 公司;SDS-PAGE 膠電泳轉(zhuǎn)膜裝置美國(guó)Bio-Rad 公司;Odyssey 熒光成像系統(tǒng) 美國(guó)LI-COR Biosciences 公司;CKX53 倒置熒光顯微鏡日本OLYMPUS 公司。

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、鏈霉素的細(xì)胞培養(yǎng)基液中,在37 ℃,5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天傳代1 次,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

      1.2.2 細(xì)胞分組 將BV2 細(xì)胞分成4 組:正常組,模型組,SIRT3 抑制劑+天麻素組,天麻素組。正常組:給予細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng);模型組:使用D-半乳糖(10、20、30 和40 μg/mL)處理BV2 細(xì)胞24 h;SIRT3 抑制劑+天麻素組:先使用D-半乳糖處理BV2 細(xì)胞24 h,然后同時(shí)使用10 μmol/L 的SIRT3 抑制劑和天麻素處理BV2 細(xì)胞24 h;天麻素組:先使用D-半乳糖處理BV2 細(xì)胞24 h,然后使用天麻素(10、20、30、40和50 μmol/L)處理BV2 細(xì)胞24 h。

      1.2.3 CCK-8 法測(cè)量細(xì)胞活力 將細(xì)胞接種并培養(yǎng)在96 孔板中,各組細(xì)胞用藥干預(yù)結(jié)束后,棄去使用過的細(xì)胞培養(yǎng)基,每孔加入100 μL 新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基,再加入10 μL CCK-8 溶液,在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2 h。培養(yǎng)結(jié)束后,使用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)定各組細(xì)胞吸光度值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用各組吸光度值與正常組吸光度的比值進(jìn)行表示。

      1.2.4 SA--Gal 染色法檢測(cè)細(xì)胞衰老面積 將細(xì)胞接種并培養(yǎng)在TC 處理細(xì)胞爬片上,各組細(xì)胞在用藥干預(yù)結(jié)束后,吸除使用過的細(xì)胞培養(yǎng)液。每孔加入400 μL PBS 進(jìn)行洗滌3 次,每次3 min,洗滌結(jié)束后,每孔加入400 μL-Gal 染色固定液在室溫固定15 min。染色固定結(jié)束后,每孔加入400 μL PBS 洗滌3 次,每次3 min。洗滌結(jié)束后,每孔加入400 μL染色工作液(每1 mL 染色工作液中按照:-Gal 染色液A:B:C:X-Gal=10:10:930:50 的比例配制)。使用保鮮膜封住24 孔板以防止蒸發(fā),放在37 ℃烘箱中孵育過夜。孵育結(jié)束后,在普通光學(xué)顯微鏡下觀察,并拍照保存,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用衰老細(xì)胞面積與總細(xì)胞面積進(jìn)行表示。

      1.2.5 ELISA 法檢測(cè)IL-1、IL-6 和TNF-的含量將細(xì)胞接種并培養(yǎng)在6 孔板中并進(jìn)行用藥干預(yù)。各組用藥干預(yù)結(jié)束后,首先根據(jù)試劑盒說明書配制標(biāo)準(zhǔn)品并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。收集各組細(xì)胞進(jìn)行離心(500 g,5 min),取上清。分別將100 μL 樣品和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加入到相應(yīng)的反應(yīng)孔中,用封板膜封住反應(yīng)孔并室溫孵育120 min。孵育結(jié)束后進(jìn)行洗板,拍干后每孔加入400 μL 辣根過氧化物酶標(biāo)記Streptavidin,用封板膜封住反應(yīng)孔后,室溫下避光孵育20 min。孵育結(jié)束后,進(jìn)行洗板5 次。拍干反應(yīng)板后,每孔加入100 μL 顯色劑TMB 試劑。室溫下避光孵育20 min,每孔加入50 μL 終止液,混勻后立即測(cè)量A值。

      1.2.6 生化法檢測(cè)活性氧(ROS)水平 將細(xì)胞接種并培養(yǎng)在96 孔板中,各組細(xì)胞用藥干預(yù)結(jié)束后,棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液,每孔加入100 μL 2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)(按照1:1000 比例稀釋),37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。孵育結(jié)束后,用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3 次,每次5 min,洗滌結(jié)束后使用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)525 nm處檢測(cè)熒光強(qiáng)度值。

      1.2.7 免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞中SIRT3 蛋白表達(dá)水平將細(xì)胞接種并培養(yǎng)在TC 處理細(xì)胞爬片上并進(jìn)行用藥干預(yù)。各組干預(yù)結(jié)束后,吸盡使用過的細(xì)胞培養(yǎng)液,加入400 μL 固定液室溫下固定30 min。固定結(jié)束后,去除固定液,每孔加入400 μL PBS 放入搖床進(jìn)行搖動(dòng)洗滌,每次5 min,洗滌3 次。洗滌結(jié)束后用封閉液封閉60 min,封閉結(jié)束后加入稀釋的一抗anti-SIRT3(1:500)。在4 ℃條件下孵育過夜,一抗孵育結(jié)束后,每孔加入400 μL PBS 洗滌5 次,每次5 min。洗滌結(jié)束后,每孔加入熒光標(biāo)記的Alexa Fluor 555 標(biāo)記驢抗兔IgG(H+L)(1:1000)室溫下避光孵育60 min,孵育結(jié)束后使用抗熒光淬滅封片劑(含DAPI)進(jìn)行封片,在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

      1.2.8 Western Blot 法檢測(cè)SIRT3、P16、P21 蛋白表達(dá) 將細(xì)胞接種并培養(yǎng)在24 孔板中并進(jìn)行用藥干預(yù)。各組干預(yù)結(jié)束后,每孔加入400 μL PBS 洗滌。洗滌結(jié)束后每孔加入100 μL 裂解液,使用移液槍吹打,使裂解液與細(xì)胞充分接觸。充分裂解后,離心(12000 g,5 min),取上清。使用BCA 法測(cè)量蛋白濃度。使用12%分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜結(jié)束后加入適量的封閉液,室溫下封閉60 min,使用一抗稀釋液稀釋一抗anti-SIRT3(1:1000),anti-P16(1:1000),anti-P21(1:1000)和-actin(1:1000),在4 ℃條件下孵育過夜,用Western 洗滌液洗滌3 次,每次10 min,加入二抗anti-rabbit(1:10000)、antimouse(1:10000),室溫孵育60 min,洗滌3 次,每次10 min。洗滌結(jié)束后將配置好的顯影液滴加在PVDF 膜上進(jìn)行曝光成像。

      1.3 數(shù)據(jù)處理

      使用 GraphPad Prism 8.0 軟件(GraphPad Software,Inc.,An Diego,CA)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組之間的比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)(Independent-Sample t Test),多組間比較采用單因素方差分析(One Way ANOVA),檢驗(yàn)水準(zhǔn)取雙側(cè)=0.05,<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,<0.01 為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 D-半乳糖對(duì)BV2 細(xì)胞活力和衰老的影響

      研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖在半乳糖氧化酶的催化作用下,會(huì)產(chǎn)生過氧化氫和醛糖,該產(chǎn)物又會(huì)刺激細(xì)胞,產(chǎn)生大量的自由基離子,從而進(jìn)一步損傷細(xì)胞的生理功能,因此本實(shí)驗(yàn)使用D-半乳糖誘導(dǎo)BV2 細(xì)胞衰老建立細(xì)胞模型。如圖1 顯示,不同劑量的D-半乳糖(10、20、30 和40 μg/mL)均能夠降低BV2 細(xì)胞活力,并且呈劑量依賴性下降(<0.05)。使用30 μg/mL的D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞存活率在50%~60%,比20 μg/mL 的D-半乳糖誘導(dǎo)更為顯著地降低細(xì)胞活力(<0.05),高于使用40 μg/mL 的D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞存活率(<0.05)。為避免D-半乳糖處理的BV2 細(xì)胞活力過度降低而產(chǎn)生不可逆性的損傷,本實(shí)驗(yàn)選擇濃度30 μg/mL 的D-半乳糖用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)30 μg/mL 的D-半乳糖對(duì)BV2 細(xì)胞衰老的影響,由于-半乳糖苷酶染色陽性是細(xì)胞衰老的重要標(biāo)志物,因此本實(shí)驗(yàn)使用SA-Gal 染色法BV2 細(xì)胞衰老面積。如圖2 顯示:正常組細(xì)胞SA--Gal 衰老染色面積小,30 μg/mL 的D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞SA--Gal 染色面積極顯著增大(<0.01)。這表明使用30 μg/mL 的D-半乳糖處理BV2 細(xì)胞能夠降低BV2 細(xì)胞活力,并且引起B(yǎng)V2 細(xì)胞衰老。因此,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用30 μg/mL的D-半乳糖進(jìn)行造模。

      圖1 不同濃度的D-半乳糖對(duì)BV2 細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of different concentrations of D-galactose on the viability of BV2 cells

      圖2 30 μg/mL 的D-半乳糖對(duì)BV2 細(xì)胞SA-β-Gal 染色面積的影響Fig.2 Effect of 30 μg/mL D-galactose on SA-β-Gal staining area of BV2 cells

      2.2 天麻素對(duì)D-半乳糖處理BV2 細(xì)胞活力和衰老的影響

      先前研究已證實(shí)天麻素具有抗衰老作用。本實(shí)驗(yàn)中,使用不同濃度(10、20、30、40 和50 μmol/L)的天麻素干預(yù)衰老的BV2 細(xì)胞,然后檢測(cè)各組細(xì)胞活力以測(cè)定天麻素的最佳干預(yù)濃度。如圖3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:濃度為20、30、40 和50 μmol/L 的天麻素均能提高D-半乳糖處理的BV2 細(xì)胞活力,且呈劑量依賴性(<0.05)。30 μmol/L 的天麻素比20 μmol/L 的天麻素更有效的提高細(xì)胞活力(<0.05)。而30 μmol/L天麻素較之40 μmol/L 天麻素與50 μmol/L 天麻素的作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(>0.05)。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇濃度為30 μmol/L 的天麻素用做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)一步檢測(cè)各組細(xì)胞的SA--Gal 染色,如圖4 結(jié)果顯示:與模型組相比,天麻素組中BV2 細(xì)胞SA--Gal 染色面積極顯著減少(<0.01)。與天麻素組相比,SIRT3抑制劑+天麻素組中BV2 細(xì)胞的SA--Gal 染色面積增加(<0.05)。這提示天麻素能改善D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞衰老,而抑制SIRT3 表達(dá)則會(huì)減弱天麻素對(duì)D-半乳糖處理的BV2 細(xì)胞的抗衰老作用。

      圖3 不同濃度的天麻素對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effects of gastrodin at different concentrations on the viability of BV2 cells induced by D-galactose

      圖4 天麻素對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞中β-半乳糖苷酶染色面積的影響Fig.4 Effects of gastrodin on β-galactosidase staining area in D-galactose-induced BV2 cells

      2.3 天麻素對(duì)D-半乳糖處理BV2 細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響

      如圖5 顯示,與正常組相比,模型組BV2 細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子IL-1、IL-6 和TNF-水平極顯著增高(<0.01)。與模型組相比,天麻素組BV2 細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子IL-1、IL-6 和TNF-水平極顯著降低(<0.01)。與天麻素組細(xì)胞相比,SIRT3 抑制劑加天麻素組中BV2 細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子IL-1、IL-6 和TNF-水平增加(<0.05)。這提示天麻素能改善D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 炎癥反應(yīng),而抑制SIRT3 表達(dá)則會(huì)減弱天麻素對(duì)D-半乳糖處理的BV2細(xì)胞抗炎作用。

      圖5 天麻素對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞中神經(jīng)炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量的影響Fig.5 Effects of gastrodin on the neuroinflammatory factor IL-1β、IL-6 and TNF-α content in BV2 cells induced by D-galactose

      2.4 天麻素對(duì)D-半乳糖處理BV2 細(xì)胞ROS 水平的影響

      由于線粒體產(chǎn)生的ROS 與炎癥反應(yīng)密切相關(guān),本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了各組BV2 細(xì)胞的ROS 水平。如圖6結(jié)果顯示:與正常組相比,模型組細(xì)胞ROS 水平極顯著增高(<0.01)。與模型組相比,天麻素組中細(xì)胞ROS 水平極降低(<0.01)。此外,與天麻素組相比,SIRT3 抑制劑+天麻素組中細(xì)胞ROS 水平顯著升高(<0.05)。這提示天麻素能降低D-半乳糖處理的BV2 中ROS 水平,而抑制SIRT3 表達(dá)則會(huì)減弱天麻素降低BV2 細(xì)胞中ROS 的保護(hù)作用。

      圖6 天麻素對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞中ROS 水平的影響Fig.6 Effects of gastrodin on ROS level in BV2 cells induced by D-galactose

      2.5 天麻素對(duì)D-半乳糖處理BV2 細(xì)胞中SIRT3、P16 和P21 蛋白表達(dá)的影響

      如圖7 和圖8 結(jié)果顯示:與正常組相比,模型組BV2 細(xì)胞中SIRT3 熒光強(qiáng)度和蛋白表達(dá)水平極顯著下降(<0.01)。與模型組相比,天麻素組中細(xì)胞SIRT3 熒光強(qiáng)度和蛋白表達(dá)水平極顯著增高(<0.01)。此外,與天麻素組相比,SIRT3 抑制劑+天麻素組BV2 細(xì)胞中SIRT3 熒光強(qiáng)度和蛋白表達(dá)水平顯著降低(<0.05)。這提示天麻素能夠增高D-半乳糖處理的BV2 細(xì)胞中SIRT3 蛋白表達(dá)。

      圖7 天麻素對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞中SIRT3 蛋白熒光強(qiáng)度的影響Fig.7 Effects of gastrodin on the fluorescence intensity of SIRT3 protein in BV2 cells induced by D-galactose

      細(xì)胞周期異常是細(xì)胞衰老的一個(gè)關(guān)鍵病理特征,衰老細(xì)胞表現(xiàn)出永久性細(xì)胞周期阻滯,并主要由P16INK4A 蛋白和P53-P21-RB 蛋白調(diào)節(jié)。因此本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了各組細(xì)胞中P16 和P21 蛋白表達(dá)水平。如圖8 結(jié)果顯示:與正常組相比,模型組細(xì)胞P16 和P21 蛋白表達(dá)極顯著增加(<0.01)。與模型組相比,天麻素組細(xì)胞P16 和P21 蛋白表達(dá)極顯著降低(<0.01)。此外,與天麻素組相比,SIRT3 抑制劑+天麻素組中細(xì)胞P16 和P21 蛋白表達(dá)顯著增加(<0.05)。這提示天麻素能夠降低D-半乳糖處理的BV2 細(xì)胞中P16 和P21 蛋白水平,但是抑制SIRT3 表達(dá)后,天麻素降低BV2 細(xì)胞中衰老相關(guān)蛋白P16 和P21蛋白的作用被部分減弱,因此SIRT3 可能是天麻素發(fā)揮抗衰老作用的重要靶點(diǎn)。

      圖8 天麻素對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞中SIRT3、P16 和P21 蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effects of gastrodin on the expression of SIRT3,P16 and P21 proteins in BV2 cells induced by D-galactose

      3 討論與結(jié)論

      隨著預(yù)期壽命的逐漸延長(zhǎng),人體各器官的生理機(jī)能狀態(tài)漸進(jìn)性下降,直至功能喪失。衰老通常不被視為一種疾病,但它卻是心血管疾病、代謝性疾病,尤其是神經(jīng)退行性疾病等慢性疾病的重要危險(xiǎn)因素。在衰老的組織器官中,衰老細(xì)胞大量積累,并以不可逆的方式失去增殖能力,導(dǎo)致組織的再生潛能喪失、導(dǎo)致炎癥和器官功能障礙。在正常的條件下,衰老細(xì)胞通常在一個(gè)稱為免疫監(jiān)視的過程中被免疫細(xì)胞清除,然而隨著年齡的增長(zhǎng),衰老的免疫細(xì)胞也出現(xiàn)漸進(jìn)性的功能失調(diào),引起其他衰老的細(xì)胞清除減少,最終導(dǎo)致整個(gè)器官和系統(tǒng)功能水平障礙。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐巨噬細(xì)胞,以持續(xù)和動(dòng)態(tài)的方式監(jiān)察健康的腦組織環(huán)境,并能夠清除其他受損的神經(jīng)細(xì)胞,在衰老大腦的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性病變中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn),衰老的大腦呈現(xiàn)出低級(jí)炎癥狀態(tài)。在大腦衰老的過程中,小膠質(zhì)細(xì)胞也發(fā)生衰老并逐漸積累,產(chǎn)生大量的促炎細(xì)胞因子,如腫瘤壞死因子TNF-、白細(xì)胞介素IL-1和白細(xì)胞介素IL-6,引起神經(jīng)炎癥反應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中,使用D-半乳糖處理BV2 細(xì)胞以建立衰老細(xì)胞模型,證實(shí)衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)了-半乳糖苷酶染色增加和細(xì)胞周期阻滯的典型衰老病理特征,并且衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞活力下降,釋放的炎癥因子IL-1、IL-6和TNF-水平增加,引起了神經(jīng)炎癥反應(yīng),實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往的研究結(jié)果一致。在對(duì)衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)的實(shí)驗(yàn)中,本實(shí)驗(yàn)使用前期研究已經(jīng)證實(shí)具有抗炎和抗衰老作用的天麻素。本團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn),改善衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞能夠增加細(xì)胞活力,減少神經(jīng)炎癥反應(yīng)。因此,調(diào)節(jié)衰老小膠質(zhì)細(xì)胞的功能以減少炎癥因子的釋放,已經(jīng)成為調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥、改善大腦衰老的一種重要策略。

      NAD+依賴的脫乙酰蛋白SIRT3 是主要的線粒體脫乙酰酶,能夠調(diào)節(jié)線粒體功能和氧化應(yīng)激,并保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。最近的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SIRT3 與炎癥的進(jìn)展有關(guān),研究結(jié)果顯示LPS 和TNF-能夠顯著抑制人單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中SIRT3的表達(dá),引起小鼠心肺組織周細(xì)胞的丟失和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的增加。在小鼠腦中敲低SIRT3 表達(dá)則會(huì)增強(qiáng)IL-1的表達(dá)和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,加劇神經(jīng)炎癥反應(yīng),引起神經(jīng)退行性變。同時(shí),SIRT3 在衰老條件下表達(dá)受到抑制,恢復(fù)SIRT3 表達(dá)能夠通過恢復(fù)線粒體功能增加小膠質(zhì)細(xì)胞的活力,改善神經(jīng)炎癥反應(yīng)。與之一致的是,本研究發(fā)現(xiàn)衰老的BV2 細(xì)胞中SIRT3 蛋白表達(dá)下降,進(jìn)一步使用SIRT3 抑制劑抑制SIRT3 蛋白表達(dá)后,小膠質(zhì)細(xì)胞的衰老細(xì)胞數(shù)量增加、細(xì)胞周期阻滯的程度加重,加劇了小膠質(zhì)細(xì)胞的衰老進(jìn)程,同時(shí)也引起了更多線粒體ROS 水平產(chǎn)生和炎癥因子IL-1、IL-6 和TNF-水平增加,這也驗(yàn)證了SIRT3 與神經(jīng)炎癥反應(yīng)之間具有調(diào)控作用。

      天麻素作為天麻的主要活性成分之一,大量的研究證明天麻素具有抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗衰老的作用,能夠降低脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧合酶-2 和促炎性細(xì)胞因子表達(dá),并且能夠通過調(diào)控TLR4/NFB 信號(hào)通路減少BV2細(xì)胞的過度激活。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究天麻素對(duì)衰老的BV2 細(xì)胞的保護(hù)作用,發(fā)現(xiàn)天麻素能夠劑量依賴性改善衰老的BV2 細(xì)胞活力,并且能夠減少衰老的BV2 細(xì)胞數(shù)量和改善細(xì)胞周期阻滯,進(jìn)而發(fā)揮抗衰老作用。此外,天麻素還能通過降低衰老的BV2細(xì)胞中ROS 水平和炎癥因子IL-1,IL-6 和TNF-水平發(fā)揮抗炎作用。本研究發(fā)現(xiàn)在同時(shí)給予SIRT3抑制劑和天麻素處理后,天麻素對(duì)衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎和抗衰老作用減弱,表明天麻素可能通過增高SIRT3 表達(dá)來發(fā)揮保護(hù)作用。

      總之,本實(shí)驗(yàn)首次研究天麻素對(duì)衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎和抗衰老作用,發(fā)現(xiàn)天麻素能增加衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞活力,減少-半乳糖苷酶染色面積和衰老相關(guān)蛋白P16 和P21 表達(dá)水平。此外,天麻素還能降低衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞中ROS 水平和神經(jīng)炎癥因子IL-1、IL-6 和TNF-水平,提高SIRT3 蛋白表達(dá)水平。由此推測(cè)天麻素對(duì)衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞的抗衰老和抗炎作用可能與上調(diào)SIRT3 蛋白表達(dá)有關(guān),為研究天麻素的神經(jīng)保護(hù)作用提供了新的方向,但有關(guān)天麻素抗衰老和抗炎的具體作用機(jī)制仍然需要進(jìn)一步闡明。

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