徐玉兵，劉興暉，張蜀豫，肖 玲，程雅婷，孟曉偉，陳 禹*

(1 上海金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司實(shí)驗(yàn)診斷部，上海 201301；2 上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院檢驗(yàn)科；3 海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院肝外四科；4 廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司實(shí)驗(yàn)診斷部；* 通訊作者,E-mail:sh-chenyu@kingmed.com.cn)

《精神疾病診斷及統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第五版》將孤獨(dú)癥譜系障礙(autism spectrum disorder, ASD)定義為以社交損傷、行為方式刻板和興趣狹窄為核心癥狀的一組精神發(fā)育障礙[1]。ASD兒童成年后缺乏獨(dú)立生活能力，需要被照顧終生，成為巨大的家庭精神負(fù)擔(dān)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2,3]。基于全球的數(shù)據(jù)顯示ASD的發(fā)病率在3～17歲兒童中逐年升高[4]。雖然目前還不明確ASD的確切病因，但是大量研究發(fā)現(xiàn)ASD的發(fā)生和發(fā)展可能由遺傳因素和環(huán)境因素共同影響[5]。而腸道菌群組成作為重要的環(huán)境因素之一可能與ASD的發(fā)生發(fā)展具有因果關(guān)系[6,7]。

來(lái)自產(chǎn)道、乳腺、皮膚、腸道等部位的母源共生細(xì)菌可以通過(guò)相應(yīng)的途徑傳遞給新生兒，這種現(xiàn)象稱做母源細(xì)菌的垂直傳遞。腸道菌群可以通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)遷移到產(chǎn)道、乳腺等部分，影響產(chǎn)道菌群、母乳菌群的組成。母源腸道菌群以及其他部位菌群對(duì)子代構(gòu)建腸道菌群具有重要意義。相應(yīng)的，母源腸道菌群垂直傳遞失調(diào)引起子代腸道菌群的紊亂，與子代的精神類疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[8,9]。通過(guò)皮膚接觸等途徑，父親的腸道菌群結(jié)構(gòu)也對(duì)子代的腸道菌群組成具有影響[10]。不僅如此，有研究顯示即使年齡、地域、種族具有差異，人類腸道菌群也存在共有的組成部分，被稱為“核心細(xì)菌”。這些“核心細(xì)菌”可能承擔(dān)著重要的生理功能[9,11]。因此，有必要明確家庭共有的腸道細(xì)菌組成與ASD的關(guān)系，及其對(duì)臨床的意義。

本研究對(duì)已公開的來(lái)自一項(xiàng)臨床研究(ChiCTR-RPC-16008139)的ASD兒童及其父母和正常發(fā)育兒童及其父母的腸道菌群數(shù)據(jù)[9]進(jìn)行再分析，發(fā)現(xiàn)ASD兒童相對(duì)于正常發(fā)育兒童家庭共有的腸道細(xì)菌組成具有差異，并且利用這些差異建立具有診斷意義的腸道細(xì)菌紊亂指數(shù)(gut bacteria dysbiosis index, GBDI)指數(shù)[12]。

1 材料和方法

1.1 病例

本研究回顧性分析了Chen等[9]研究中的ASD兒童及其父母和正常發(fā)育兒童及其父母的糞便中的腸道菌群(細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū))數(shù)據(jù)，其中ASD兒童為71例(其父母均為71例)，正常發(fā)育兒童為39例(其父母均為39例)，合計(jì)330例樣本。人群基礎(chǔ)信息和分組信息見于Chen等[9]的研究，此研究(ChiCTR-RPC-16008139)在中國(guó)臨床試驗(yàn)注冊(cè)中心注冊(cè)。

1.2 生成擴(kuò)增序列變異

腸道菌群測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)自NCBI的序列讀取存檔(short read archive, SRA)數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索號(hào)為PRJNA644763和PRJNA715668。利用2022.02版微生物生態(tài)學(xué)的定量研究(quantitative insights into microbial ecology, QIIME2)軟件進(jìn)行生物信息學(xué)處理，流程如下：①在QIIME2中導(dǎo)入測(cè)序原始文件；②依據(jù)文獻(xiàn)中的描述切除PCR引物的序列信息[9]；③對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)量控制；④利用QIIME2中的DADA2指令降噪；⑤基于重疊的長(zhǎng)度不小于20的原則拼接序列，獲得各個(gè)樣本的擴(kuò)增序列變異(amplicon sequence variants, ASVs)豐度文件和代表序列文件；⑥將所有的樣本的序列數(shù)均一化到10 000，獲得各個(gè)樣本細(xì)菌的相對(duì)豐度；⑦在席爾瓦(SILVA)參考數(shù)據(jù)庫(kù)(136版)中注釋ASVs的分類地位(80%相似度)。

1.3 關(guān)鍵家庭共有ASVs的挑選

利用R語(yǔ)言(3.3.3版)中的“mixOmics數(shù)據(jù)包”實(shí)現(xiàn)偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)，并且進(jìn)行后續(xù)“l(fā)eave-one-out”交叉驗(yàn)證，挑選對(duì)PLS-DA分類模型器貢獻(xiàn)最高的家庭共有ASVs作為關(guān)鍵家庭共有ASVs。

1.4 GBDI的計(jì)算

引用Wang等[12]的研究計(jì)算GBDI：

其中∑ASVsa代表在ASD兒童中升高并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)鍵家庭共有ASVs相對(duì)豐度之和，∑ASVst代表在正常發(fā)育中升高并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)鍵家庭共有ASVs相對(duì)豐度之和，A代表在ASD兒童中升高并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)鍵家庭共有ASVs的個(gè)數(shù)，T代表正常發(fā)育兒童中升高并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)鍵家庭共有ASVs的數(shù)目。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均使用SPSS軟件(IBM公司，26.0版)完成。利用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析ASD兒童和正常發(fā)育兒童之間ASVs相對(duì)豐度的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用“l(fā)eave-one-out”交叉驗(yàn)證檢驗(yàn)GBDI的受試者操作特征曲線(receiver operating characteristic curve, ROC)模型，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且利用尤登系數(shù)計(jì)算GBDI閾值，以及該閾值下對(duì)應(yīng)的診斷ASD的敏感度和特異性。

2 結(jié)果

2.1 獲得家庭共有腸道細(xì)菌

對(duì)臨床試驗(yàn)ChiCTR-RPC-16008139中的ASD兒童(71例)及其父母和正常發(fā)育兒童(39例)及其父母共330例糞便腸道菌群測(cè)序數(shù)據(jù)(細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū))進(jìn)行分析，得到7 552 303條高質(zhì)量序列，樣本平均(22 885.8 ±4 677.9)條。序列剪切、拼接和降噪后，得到4 325個(gè)ASVs。

本研究中某個(gè)ASV同時(shí)在兒童和其父母糞便中檢測(cè)到，則認(rèn)為此ASV被這個(gè)家庭共有。一個(gè)ASV被任意一個(gè)家庭共有，定義此ASV 為家庭共有ASV(shared-ASV)。本研究中，330 個(gè)樣本共獲得264個(gè)家庭共有ASVs。

2.2 挑選關(guān)鍵家庭共有腸道細(xì)菌

基于家庭共有ASVs的相對(duì)豐度矩陣建立PLS-DA模型，發(fā)現(xiàn)ASD兒童和正常發(fā)育兒童在空間上分為2個(gè)簇(見圖1)，提示家庭共有ASVs的結(jié)構(gòu)明顯不同。而后挑選對(duì)模型判別能力貢獻(xiàn)較大的成員，經(jīng)過(guò)“l(fā)eave-one-out”交叉驗(yàn)證，當(dāng)PLS-DA模型選擇前4個(gè)成分(分別為成分1，2，3，4)時(shí)，模型的整體錯(cuò)誤率最低(數(shù)值為0.261)。當(dāng)各個(gè)成分錯(cuò)誤率最低時(shí)，4個(gè)成分分別挑選了貢獻(xiàn)度排名前3、前2、第1和前4個(gè)的家庭共有ASVs，定義這些ASVs為關(guān)鍵家庭共有ASVs(見表1)。

表1 關(guān)鍵家庭共有腸道細(xì)菌

對(duì)ASD兒童和正常發(fā)育兒童中關(guān)鍵家庭共有ASVs進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)家庭共有ASV2090(Bacteroides)和家庭共有ASV2223(LachnospiraceaeND3007group)的相對(duì)豐度在ASD兒童中升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而家庭共有ASV493(Erysipelatoclostridium)，家庭共有ASV3419(Lachnospiraceae)和家庭共有ASV3051(Blautia)的相對(duì)豐度在ASD兒童中降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

藍(lán)色圓圈代表ASD兒童(71例)，而紅色三角形代表正常發(fā)育兒童(39例)

表2 ASD和正常發(fā)育兒童之間關(guān)鍵家庭共有ASVs差異

2.3 利用家庭共有ASVs計(jì)算具有診斷ASD能力的生物標(biāo)志物

基于ASD兒童相對(duì)于正常發(fā)育兒童具有顯著差異的關(guān)鍵家庭共有ASVs，依據(jù)Wang等[12]研究中GBDI的計(jì)算方法分別計(jì)算ASD兒童和正常發(fā)育兒童的GBDI，分別為-0.060 ±0.034和-0.381 ±0.072。

建立ROC模型檢驗(yàn)GBDI診斷ASD的效力，經(jīng)過(guò)“l(fā)eave-one-out”交叉驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)ROC模型的曲線下面積為0.810(95%CI為0.721～0.900，P<0.01)，表明模型具有診斷ASD的潛能。基于尤登指數(shù)，計(jì)算最佳閾值，發(fā)現(xiàn)GBDI為-0.182時(shí)，敏感度為74.6%，特異性為79.5%(見圖2)。

圖中的點(diǎn)表示GBDI的閾值

3 討論

人類不僅有“血脈”，還有“菌脈”，或者稱之為人類共生微生物的垂直傳遞，其途徑主要包括胎盤、產(chǎn)道、母乳、皮膚接觸、共同生活環(huán)境等[10]。這種垂直傳遞對(duì)子代腸道菌群的早期建立至關(guān)重要，持續(xù)影響著子代腸道菌群的功能，而腸道菌群的功能對(duì)子代神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能具有調(diào)控作用[13]。腸道菌群的垂直傳遞分為母源和父源。大量研究顯示，母源腸道菌群垂直傳遞通過(guò)影響子代的腸道菌群結(jié)構(gòu)間接調(diào)控子代能量代謝、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等多項(xiàng)生理過(guò)程。母源垂直傳遞與諸如精神發(fā)育障礙在內(nèi)的多種人類常見疾病密切有關(guān)。Chen等[9]發(fā)現(xiàn)雖然ASD兒童母親的腸道菌群結(jié)構(gòu)、多樣性和豐富度相較正常發(fā)育兒童母親無(wú)明顯變化，然而兒童和母親共有腸道細(xì)菌變化與ASD特定的臨床癥狀密切相關(guān)，這表明ASD兒童母源腸道菌群垂直傳遞可能發(fā)生了改變。父源菌群垂直傳遞一般被認(rèn)為是父親通過(guò)皮膚接觸、共同的生活環(huán)境、基因?qū)δc道細(xì)菌定植的偏好性將自身腸道菌群傳遞給子代的過(guò)程，同樣對(duì)子代健康具有重要意義[14]。不僅如此，兒童和父母具有一些共有的腸道細(xì)菌，這些家庭共有腸道細(xì)菌相對(duì)于其他細(xì)菌可能在基礎(chǔ)的生命活動(dòng)中扮演著更重要的角色，如神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能。這些細(xì)菌也被認(rèn)為是腸道菌群中的“核心”部分[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)屬于Bacteroides的家庭共有腸道細(xì)菌在ASD兒童中升高，屬于Lachnospiraceae和Blautia的家庭共有腸道細(xì)菌在ASD兒童中降低。這些腸道細(xì)菌在兒童中的特征性變化可能與ASD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Liu等[15]的研究薈萃分析了2018年3月后收錄于Medline，EMBASE，Web of Science和Scopus數(shù)據(jù)庫(kù)上的16篇研究性論文的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)ASD兒童相對(duì)于正常發(fā)育兒童，Bacteroides升高，而Blautia顯著降低。Bacteroides中的很多成員具有引起機(jī)體慢性炎癥的功能，而長(zhǎng)期的慢性炎癥會(huì)影響兒童的神經(jīng)發(fā)育，是誘發(fā)精神發(fā)育障礙的危險(xiǎn)因素[16]。屬于Blautia和Lachnospiraceae的很多腸道細(xì)菌成員可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，如丁酸。Yan等[17]發(fā)現(xiàn)丁酸有效緩解小鼠胚胎、成纖維細(xì)胞和人胚腎293細(xì)胞中賴氨酸23中組蛋白H3的?；毕?，而這種缺陷是發(fā)育遲緩兒童的重要特征之一。因此，丁酸產(chǎn)生菌可能緩解兒童的發(fā)育遲緩。這些研究表明本研究發(fā)現(xiàn)的特征性變化的家庭共有腸道細(xì)菌可能與ASD的發(fā)生發(fā)展具有因果關(guān)系。

診斷ASD的金標(biāo)準(zhǔn)為心理學(xué)評(píng)估，而評(píng)估需要至少2名具有資質(zhì)的專業(yè)醫(yī)生連續(xù)開展至少4 h，不利于在大規(guī)模人群中開展ASD的篩查。本研究檢測(cè)人群的糞便樣本，樣本便于采集、保存和運(yùn)輸，并且為非侵入性檢測(cè)項(xiàng)目，無(wú)安全隱患，具有開展大規(guī)模人群篩查的優(yōu)勢(shì)。但本研究也存在一定的不足，首先，本研究并非多中心研究，生活習(xí)慣、飲食習(xí)慣等環(huán)境因素可能系統(tǒng)性干擾研究結(jié)果；其次，樣本量較??；再次，本研究為回顧性研究。所以，未來(lái)可以開展多中心、更大人群的前瞻性研究，檢驗(yàn)此生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)兒童罹患ASD風(fēng)險(xiǎn)的能力，為ASD的早期診斷提供臨床指導(dǎo)。 綜上所述，本研究揭示了ASD兒童與父母共有的腸道細(xì)菌組成特征，基于此特征發(fā)掘了具有診斷ASD潛能的生物標(biāo)志物，這為未來(lái)腸道菌群運(yùn)用于ASD臨床診療提供了新的方向。