何紫凝 袁中文 馮森玲

(廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院藥學部/廣東省產(chǎn)科重大疾病重點實驗室，廣州，510150)

據(jù)美國疾病預防控制中心預測報告，自2019年10月至2020年4月有3 900～5 600萬人感染流感，導致24 000～62 000人死亡[1]。流行性感冒(流感)是一種由流感病毒感染導致的急性呼吸道傳染病，嚴重時可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征或多臟器衰竭，甚至引起死亡。目前主流的防治流感藥物有生物疫苗、奧司他韋和扎那米韋等神經(jīng)氨酸酶抑制劑、金剛烷胺類的M2離子通道抑制劑。但現(xiàn)有的抗流感藥物容易產(chǎn)生耐藥性，而且僅針對單一靶點，開發(fā)滯后，完全跟不上流感病毒高抗原漂移的速度，給抗流感藥物的開發(fā)帶來很大挑戰(zhàn)[2]。近年來，我國中藥及其復方發(fā)展迅速，研究表明中藥不僅可以通過抑制病毒復制、抵抗病毒導致的細胞病變來治療流感，還能通過調(diào)節(jié)機體免疫功能、改善肺循環(huán)、鎮(zhèn)痛抗炎來治療流感并發(fā)癥[3]。因此，運用中藥防治流感，開發(fā)抗流感藥物，有其獨特的優(yōu)勢。

丁香為桃金娘科植物丁香EugeniacaryophyllataThunb.的干燥花蕾。具有溫中降逆，補腎助陽的功效。主治脾胃虛寒，呃逆嘔吐，食少吐瀉，心腹冷痛，腎虛陽痿[4]?，F(xiàn)代研究表明，丁香主要含有揮發(fā)油類、酚酸類、黃酮類、三萜類等成分，具有調(diào)節(jié)胃腸運動、抗胃潰瘍、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗癌等藥理作用[5]。有研究證明，丁香具有抗流感病毒活性，但其抗流感病毒作用機制的報道較少，目前只知其能抑制神經(jīng)氨酸酶而發(fā)揮抗流感病毒作用，但是否還存在其他機制仍不清楚[6]。網(wǎng)絡藥理學是基于生物信息學和系統(tǒng)生物學方法，通過構建“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡，分析網(wǎng)絡特征協(xié)同關系的新學科，近年來被廣泛用于預測中藥活性成分群和潛在靶點群，以闡述中藥作用機制。

本研究擬采用網(wǎng)絡藥理學對丁香抗流感活性成分的相關靶點及信號通路進行分析，并運用分子對接實驗研究丁香活性成分與流感病毒蛋白的結合作用，從分子水平、細胞水平和基因水平探討丁香抗流感分子機制，為丁香的深入研究及開發(fā)利用，為抗流感藥物的研發(fā)提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件 數(shù)據(jù)庫：中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)、人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards)(https://www.genecards.org/)、String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)、Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫(PDB，https://www.rcsb.org/)、Metascape網(wǎng)站(http://metascape.org/gp/index.html)；軟件：Cytoscape 3.7.2、Autodock Vina 1.1.2、Ligplus等[7-13]。

1.2 丁香活性成分的收集和篩選 從TCMSP中以及文獻補充檢索丁香所有化學成分，然后篩選出其中生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%，類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18的丁香活性成分。

1.3 丁香活性成分靶點的預測 將篩選得到的活性成分輸進數(shù)據(jù)庫SwissTarget Prediction，研究物種為“Homo sapiens”，得到結果后，整合、去重，最后得到丁香活性成分對應的作用靶點。

1.4 流感疾病靶點的獲取及丁香治療流感的靶點預測 以“influenza”為關鍵詞，物種為“Homo sapiens”，檢索GeneCards，獲得流感疾病相關靶點。利用Microsoft Excel將流感疾病靶點與丁香活性成分作用靶點進行映射，獲得二者的共同靶點，即為丁香治療流感的靶點。

1.5 構建丁香-活性成分-流感靶點-流感網(wǎng)絡 運用Cytoscape 3.7.2軟件，導入丁香活性成分和丁香治療流感的靶點，構建網(wǎng)絡“丁香-活性成分-流感靶點-流感”，通過Network Analyzer功能分析網(wǎng)絡節(jié)點，度值的大小以節(jié)點的大小來代表。

1.6 構建和分析丁香治療流感靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡 運用String數(shù)據(jù)庫檢索獲得的丁香治療流感的靶點，物種來源設為“Homo sapiens”，最小相互作用分值設為0.4，得到PPI信息，將其導入Cytoscape 3.7.2軟件，繪制出PPI網(wǎng)絡。利用Network Analyzer對其進行分析，計算網(wǎng)絡中每個節(jié)點度值，篩選出度值高于2倍中位數(shù)的節(jié)點。然后運用插件CytoNCA對PPI進行網(wǎng)絡拓撲分析，包括連接度、介度和緊密度等，篩選出連接度、介度和緊密度均高于中位數(shù)的節(jié)點作為核心節(jié)點。

1.7 基因本體(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 將所得的丁香治療流感靶點錄入Metascape平臺，設置P<0.05，進行GO生物功能與KEGG富集分析，通過平臺對數(shù)據(jù)進行可視化，以高級氣泡圖呈現(xiàn)。

1.8 分子對接及其作用網(wǎng)絡的構建 將丁香-活性成分-流感靶點-流感網(wǎng)絡中的28個化合物和奧司他韋作為對接柔性配體，利用Chem Bio 3D Ultra 12.0構建化合物的3D結構，進行能量最小化，并保存為PDB格式。然后用Mgltools 1.5.6對化合物進行預處理，并轉(zhuǎn)化為PDBQT格式。選取“丁香-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡度值前15位與PPI核心網(wǎng)絡的2個交集靶點和6個關鍵流感病毒蛋白作為對接剛性受體。從PDB數(shù)據(jù)庫中下載受體靶蛋白的晶體結構(含原配體)。利用Pymol軟件對各靶點晶體結構去水及自身配體，通過Mgltools1.5.6進行加氫，計算電荷，合并非極性氫等預處理，然后保存為PDBQT格式。以受體靶蛋白中原配體的中心點坐標設置對接的活性口袋區(qū)域，采用AutoDock Vina 1.1.2進行半柔性分子對接。取能量最低的構象為最優(yōu)構象，用Pymol軟件可視化分析作圖。根據(jù)分子對接結果，以奧司他韋作為對照篩選出活性化合物，然后將其與流感相關關鍵蛋白導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建丁香化合物與流感相關關鍵蛋白作用網(wǎng)絡。

2 結果

2.1 丁香活性成分的篩選收集 通過TCMSP平臺檢索到丁香117個化學成分，以OB≥30%，DL≥0.18為條件篩選到6個活性成分(Clove1-6)。結合文獻補充TCMSP中并未收集的化學成分，同樣將OB≥30%及DL≥0.18作為標準，篩選得到3個活性成分(W1-3)。另外，有19個化學成分(NA1-19)因其有抗流感病毒活性報道，雖不符合篩選條件，同樣納入研究。共獲得28個丁香活性成分。見表1。

表1 丁香活性成分

2.2 丁香治療流感的靶點 共得到589個丁香活性成分作用靶點。獲得2 506個流感疾病靶點。映射后得到209個共同靶點。

2.3 丁香-活性成分-靶點-流感網(wǎng)絡 圖1包括1個丁香，28個丁香活性成分，209個流感靶點，1個流感，共239節(jié)點和1 281條邊。圓形代表丁香活性成分，正方形代表流感靶點。28個活性成分均能與25個以上的流感靶點相連接，度值排前5的活性成分分別為：Rhamnazin-3-O-β-D-glucopyranoside、Isoquercitrin、Quercetin-3-O-β-D-glucuronide、Rhamnetin-3-O-β-D-glucuronide-6″-methyl、1,2,3,6-tetra-O-galloylglucose。

圖1 丁香-活性成分-靶點-流感網(wǎng)絡

2.4 丁香治療流感靶點的PPI 利用String數(shù)據(jù)庫，檢索得到的209個丁香治療流感的靶點，獲得了包含207個節(jié)點，3 076條邊的PPI網(wǎng)絡，然后通過Cytoscape 3.7.2將網(wǎng)絡可視化，并使用Network Analyzer功能分析，篩選出度值高于2倍中位數(shù)的節(jié)點，所得PPI網(wǎng)絡有39個節(jié)點，610條邊；再做進一步拓撲分析，篩選出連接度、介度和緊密度均高于中位數(shù)的18個節(jié)點，共150條邊，構成PPI核心網(wǎng)絡，網(wǎng)絡中節(jié)點面積大小和顏色暖冷代表節(jié)點的重要性強弱。PPI核心網(wǎng)絡靶點包括AKT1、GAPDH、TP53、MAPK3、TNF、EGFR、VEGFA、SRC、MAPK1、CASP3、HSP90AA1、HRAS、MAPK8、IL2、MAPK14等。而在丁香-活性成分-靶點-流感網(wǎng)絡中，TERT、XDH、PRKCA、PTGS2、ADORA2A、PRKCD、PRKCB、SRC、ADRA2A、ADRA2C、HSP90AA1、PRKCE、NOX4、RPS6KA3、CD38均可與15個以上的活性成分相互作用，二者相互映射得到SRC、HSP90AA1 2個靶點。見圖2。

圖2 丁香治療流感靶點的PPI網(wǎng)絡

2.5 GO生物功能和KEGG富集分析 得到2 366個GO生物過程(Biological Processes，BP)富集分析條目、117個GO細胞組分(Cell Components，CC)富集分析條目和214個GO分子功能(Molecular Functions，MF)富集分析條目。以前20個條目為主要分析對象。BP主要涉及對酶活性的調(diào)控、細胞因子介導的信號通路、MAPK級聯(lián)的調(diào)控、細胞對化合物的反應，細胞遷移的調(diào)控、細胞對應激的反應、細胞死亡的調(diào)控、激活免疫反應等。CC主要涉及膜區(qū)、小窩、膜側(cè)、囊泡腔、分泌顆粒內(nèi)腔、溶解液泡、溶酶體等。MF主要涉及激酶和蛋白激酶結合與活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶和蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結合、細胞黏附分子結合、輔助因子結合、氧化還原酶活性、細胞因子受體。KEGG通路富集分析共得到173個條目，主要涉及癌癥途徑、PI3K-AKT信號通路、促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogenactivated Protein Kinase，MAPK)、乙型肝炎、Ras蛋白、細胞凋亡和趨化因子信號通路、T細胞受體信號轉(zhuǎn)導通路、甲型流感、環(huán)磷酸腺苷信號通路、EB病毒感染等。見圖3。圖中橫坐標表示富集因子，縱坐標表示通路，圓點大小表示基因數(shù)，圓點越大則基因的富集數(shù)越多；圓點顏色代表-log10(P值)，值越大，顏色越明亮，此通路上富集的基因越多。

圖3 GO生物過程和KEGG信號通路富集分析

2.6 丁香活性成分與流感相關蛋白分子對接作用網(wǎng)絡與分子對接模式 將“丁香-活性成分-流感靶點-流感網(wǎng)絡”網(wǎng)絡中的28個活性成分和奧司他韋與8個流感相關蛋白進行半柔性分子對接。見表2。以奧司他韋作為對照篩選，構建丁香活性成分與流感相關蛋白作用網(wǎng)絡。結果顯示，丁香活性成分對流感關鍵靶蛋白和流感病毒蛋白均有較好的結合作用。丁香中28個活性成分均能與流感病毒蛋白NA、HA、PB2對接，且大多還能與PA、NP、M2對接，還有11個成分能與M2對接，21個成分與NP對接，都優(yōu)于奧司他韋。除NA3、NA4、CLOVE2外，其他成分均可與SRC結合，除NA6外，其他成分均可與熱激蛋白90AA1結合，且都優(yōu)于奧司他韋。其中NA6與NA，NA8與HA，CLOVE6與M2，NA12與PB2，NA7與NP，NA9與PA、熱激蛋白90AA1、SRC的結合度最高。見圖4。從分子對接模式圖可以看出，大多化合物主要以氫鍵和疏水作用和受體位點結合，而且這些化合物大部分屬于黃酮類和鞣質(zhì)類。如NA6與NA中的Glu119、Glu227、Arg371等形成氫鍵，與Arg118、Glu277等形成疏水作用，加強了NA6與NA的相互作用。NA12與PB2中的Glu361、Lys376等形成氫鍵，與His357、Ser321等形成疏水作用，形成了穩(wěn)定的結合構象。見圖5。

表2 流感相關蛋白

圖4 丁香活性成分與流感相關蛋白分子對接作用網(wǎng)絡

圖5 丁香活性成分與8個流感相關蛋白結合度最高的分子對接模式

3 討論

本研究構建了丁香-活性成分-流感靶點-流感網(wǎng)絡，共篩選出丁香防治流感疾病的28個活性成分、209個靶點。網(wǎng)絡中度值前5位的化合物是rhamnazin-3-O-β-D-glucopyranoside、isoquercitrin、quercetin-3-O-β-D-glucuronide、rhamnetin-3-O-β-D-glucuronide-6″-methyl、1,2,3,6-tetra-O-galloylglucose。Isoquercetrin在體外和體內(nèi)均能顯著減少流感病毒的復制，還能通過抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶和下調(diào)γ干擾素水平而發(fā)揮抗流感病毒作用[14-15]。

流感病毒在宿主細胞內(nèi)進行復制增殖，最終通過多條凋亡途徑激活下游胱天蛋白酶3，使細胞凋亡[16]。流感病毒NS1能使凋亡肽酶激活因子1與熱激蛋白90AA1的相互作用減弱，并激活胱天蛋白酶3分解，減少細胞的過早凋亡，促使病毒在細胞內(nèi)的增殖[17]。流感病毒入侵宿主后，經(jīng)宿主能介導系列的天然免疫防御反應，如釋放腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)發(fā)揮抗病毒作用[18]。TNF-α可上調(diào)核因子κB、MAPK等信號通路，引起機體炎癥反應的發(fā)生，最后導致細胞凋亡。但是過度刺激天然免疫系統(tǒng)可能有害機體。研究表明，流感不是通過直接破壞呼吸道上皮細胞來引起病理損傷及死亡的，而是通過“細胞因子風暴”，TNF-α是引起急性肺損傷的核心細胞因子[19]。P53是細胞腫瘤抗原，在細胞感染后期，流感病毒可激發(fā)P53依賴和非P53依賴的細胞凋亡、壞死途徑[20]。流感病毒先激活表皮生長因子受體，進而激活PI3K、MAPK等下游信號通路，促進對宿主的侵襲，增強自身復制[21]。因此，本研究顯示，丁香可能通過AKT1、TP53、MAPK3、TNF、EGFR、CASP3、HSP90AA1等靶點調(diào)節(jié)人機體炎癥反應、細胞凋亡等免疫應答以防治流感。

通過GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)丁香可激活免疫反應、調(diào)控酶活性、細胞因子、細胞應激、細胞凋亡等生物過程。而KEGG通路富集分析表明丁香可能通過PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路、乙型肝炎、細胞凋亡、趨化因子信號通路、T細胞受體信號轉(zhuǎn)導通路、甲型流感等多條復雜的通路防治流感。研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒感染的早期和中期，非結構性蛋白可以結合同時激活磷脂酰肌醇3激酶，或者與AKT1直接結合，磷酸化AKT1，使PI3K-AKT信號通路激活，抑制細胞凋亡，促使流感病毒的增殖和復制[22]。MAPK信號通路，包括胞外信號調(diào)節(jié)酶(Extracellular Signal-regulated Kinase，ERK)1/2、c-Jun末端激酶(JNK)、P38和ERK5 4種亞型。研究顯示，流感病毒感染可同時激活4條MAPK通路。而MAPK家族對病毒核糖核蛋白(Viral Ribonucleoprotein，vRNP)的運輸和病毒復制有促進作用。其中，在炎癥反應中，P38 MAPK激活不可或缺，可調(diào)節(jié)流感病毒感染誘導產(chǎn)生的細胞因子。MAPK信號通路的激活還能誘導TNF-α、白細胞介素-2和白細胞介素-6等的表達[23]。

從丁香化學成分與流感相關蛋白分子對接作用網(wǎng)絡圖可知，28個成分均可與3個以上靶點結合，且各個靶點均能結合多個活性成分，這提示丁香抗流感病毒的多靶點作用，丁香除了能抑制NA，還能作用于HA、PB2、PA、NP、M2等多個流感病毒蛋白。由此推測，丁香可能是通過與NA、HA、M2等蛋白相互作用，影響流感病毒的吸附、脫殼、復制以及釋放等過程，從而達到抗流感病毒作用。據(jù)研究報道，除了W3、CLOVE1、CLOVE2、CLOVE3、CLOVE5外，其他活性成分均有抑制NA、抗流感病毒活性的作用[6，24-26]。其中Luteolin(木犀草素)、Quercetin(槲皮素)和Kaempferol(山柰酚)還被實驗證實分別能通過抑制HA、M2的表達從而抑制流感病毒活性[25-27]。

根據(jù)網(wǎng)絡藥理學分析，SRC和熱激蛋白90AA1不僅為丁香多個化合物的靶點并且在PPI網(wǎng)絡中具有重要地位，故用AutoDock Vina對丁香活性成分與SRC和熱激蛋白90AA1進行分子對接。結果表明丁香活性成分與SRC(原癌基因酪氨酸蛋白激酶)、熱激蛋白90AA1有較好的結合活性，推測丁香在人體內(nèi)可能主要干預SRC、熱激蛋白90AA1來治療流感。

綜上所述，本研究運用網(wǎng)絡藥理學和分子對接的方法探索丁香中化學成分、作用靶點以及主要活性成分與流感相關蛋白結合的能力。研究結果提示，丁香發(fā)揮防治流感的作用可能是通過多成分、多靶點、多通路的協(xié)同作用來實現(xiàn)的。本研究初步探索和預測丁香治療流感的藥效物質(zhì)基礎與分子生物學機制，為后續(xù)進一步驗證其作用機制的實驗研究提供了依據(jù)。