劉方舟 楊 陽(yáng) 李 萌 杜 昱 張一穎 李逸豪 王 靜 李園白

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所，北京，100700)

當(dāng)歸來(lái)源于傘形科當(dāng)歸屬植物Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根[1]，又名干歸、馬尾歸、秦哪、秦歸、云歸、馬尾當(dāng)歸、岷歸等，是中醫(yī)臨床最常用的中藥之一，素有“十方九歸”的說(shuō)法，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被譽(yù)為“血家之圣藥”[2]。當(dāng)歸廣泛分布于甘肅、四川、陜西、湖北等地[3]。當(dāng)歸藥材主要有效成分包括揮發(fā)油類、有機(jī)酸類、多糖、核苷類、腦苷類、氨基酸等多種類型的化合物，由復(fù)雜成分體系構(gòu)成[4]。不同產(chǎn)地當(dāng)歸藥材所含化合物含量高低各異，而不同化合物可通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑對(duì)機(jī)體綜合調(diào)控，進(jìn)而發(fā)揮不同的藥理作用。

課題組前期相關(guān)研究成果表明，甘肅產(chǎn)區(qū)當(dāng)歸(以下稱：隴產(chǎn)當(dāng)歸)中含有高含量揮發(fā)油類成分，即該類成分的含量與其他產(chǎn)區(qū)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)[5]。當(dāng)歸揮發(fā)油作為當(dāng)歸的主要藥效成分之一，其組分十分復(fù)雜，主要含有藁本內(nèi)酯、正丁烯內(nèi)酯、當(dāng)歸酮等多種成分，具有廣泛的藥理活性[6]。近年來(lái)，當(dāng)歸揮發(fā)油在心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、腦神經(jīng)系統(tǒng)和抗腫瘤方面的相關(guān)研究成果不斷涌現(xiàn)[7]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探尋隴產(chǎn)當(dāng)歸的特征性高含量化學(xué)成分群-揮發(fā)油類成分作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路，預(yù)測(cè)相關(guān)疾病并構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，為隴產(chǎn)當(dāng)歸揮發(fā)油類成分的藥理作用機(jī)制研究提供依據(jù)[8-9]。

1 資料與方法

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫(kù) 應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)、UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org/)、Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、STITCH數(shù)據(jù)庫(kù)(http://stitch.embl.de/)、Swiss數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/index.php)、Omicshare數(shù)據(jù)平臺(tái)(https://www.omicshare.com/tools/)、ctd數(shù)據(jù)庫(kù)(Comparative Toxicogenomics Database，http://ctdbase.org/)、Cytoscape 3.7.0軟件。

1.2 獲取化學(xué)成分與ADME參數(shù) 本研究基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，針對(duì)隴產(chǎn)當(dāng)歸開(kāi)展研究，選取其特征性高含量化學(xué)成分群藁本內(nèi)酯(Ligustilide)、正丁基苯酞(3-n-Butylphthalide)、正丁烯基苯酞(3-Butylidenephthalide)作為目標(biāo)成分，并借助TCMSP獲取目標(biāo)成分的吸收、分布、代謝、排泄(ADME)參數(shù)[10]。

1.3 化學(xué)成分潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與篩選 Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取化合物L(fēng)igustilide、3-n-Butylphthalide和3-Butylidenephthalide的SMILES格式文件[11]，并將其上傳至STITCH數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss數(shù)據(jù)庫(kù)，靶點(diǎn)種類設(shè)置為Homo sapiens，獲取靶點(diǎn)后利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)的UniProtKB功能，設(shè)置限定物種Human，輸入靶點(diǎn)名稱以獲取對(duì)應(yīng)基因名稱并進(jìn)行蛋白名稱矯正，最終得到各化合物相關(guān)靶點(diǎn)(Target)、基因(Gene)名稱、UniProt ID、匹配概率(Probability)等結(jié)果。

1.4 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建隴產(chǎn)當(dāng)歸特征性高含量化學(xué)成分群Ligustilide、3-n-Butylphthalide和3-Butylidenephthalide的相關(guān)“目標(biāo)成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)；將目標(biāo)成分相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入CTD數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)相關(guān)疾病，選取基因頻數(shù)(Annotated Genes Quantity)≥10的疾病，構(gòu)建“靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用Cytoscape-Merge功能合并“目標(biāo)成分-靶點(diǎn)”與“靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建“目標(biāo)成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，以目標(biāo)成分、靶點(diǎn)蛋白和疾病為3類節(jié)點(diǎn)(Node)，節(jié)點(diǎn)間相互關(guān)系用邊(Edge)表示。再運(yùn)用Cytoscape-Network Analyzer功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?以度(Degree)值反映節(jié)點(diǎn)大小,以邊介數(shù)(Betweenness)反映邊的粗細(xì)。

1.5 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中Retrieve/ID mapping功能，將所得靶點(diǎn)名稱UniProt ID轉(zhuǎn)換為Ensembl格式，并以Ensembl基因名形式將活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)基因列表導(dǎo)入Omicshare數(shù)據(jù)平臺(tái)，進(jìn)行GO富集分析以預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的功能分布，物種勾選“Homo sapiens genes”,對(duì)生物過(guò)程(Biological Process)、分子功能(Molecular Function)、細(xì)胞組分(Cellular Component)進(jìn)行全面富集分析，設(shè)置P值<0.01；以標(biāo)準(zhǔn)基因名形式將靶點(diǎn)基因?qū)隒TD數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行通路富集分析，設(shè)置P值<0.01，分析結(jié)果用以挖掘隴產(chǎn)當(dāng)歸特征性高含量成分群多維藥理作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)測(cè)目標(biāo)成分靶點(diǎn) 本研究選取藁本內(nèi)酯、正丁基苯酞、正丁烯基苯酞為目標(biāo)成分。在STITCH數(shù)據(jù)庫(kù)和SWISS數(shù)據(jù)庫(kù)共得到ALOX5、P18054、SLC6A2、HRH3、MAPT、MBNL1等36個(gè)靶點(diǎn)。見(jiàn)表1。

表1 隴產(chǎn)當(dāng)歸特征性高含量成分群潛在靶點(diǎn)

2.2 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 按相關(guān)靶點(diǎn)基因頻數(shù)(Annotated Genes Quantity)由高到低排序，選取基因頻數(shù)不小于10的16種疾病，構(gòu)建目標(biāo)成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)模型，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)按網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度(Degree)排序，共包含55個(gè)節(jié)點(diǎn)(3個(gè)目標(biāo)成分、36個(gè)靶點(diǎn)、16種疾病)。見(jiàn)圖1。

圖1 成分-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.3 生物功能與通路分析

2.3.1 GO富集分析 結(jié)果顯示，靶點(diǎn)在生物過(guò)程中，細(xì)胞過(guò)程、生物調(diào)控和應(yīng)激反應(yīng)占比例較大；在分子功能中，分子結(jié)合、催化活性和轉(zhuǎn)運(yùn)活性作用突出；在細(xì)胞組分中，細(xì)胞部件、細(xì)胞膜、細(xì)胞器和膜部件較重要。見(jiàn)圖2。

圖2 目標(biāo)成分GO富集分析結(jié)果

2.3.2 信號(hào)通路富集分析 結(jié)果顯示，目標(biāo)成分預(yù)測(cè)出的36個(gè)靶點(diǎn)中有24個(gè)靶點(diǎn)(67%)富集得到26條相關(guān)信號(hào)通路，涉及5種類別：其中與小分子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的通路有4條，與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的通路有7條，與機(jī)體系統(tǒng)相關(guān)的通路有6條，與新陳代謝相關(guān)的通路有7條，與疾病相關(guān)的通路有2條。見(jiàn)表2，圖3～4。

圖3 目標(biāo)成分相關(guān)靶點(diǎn)通路富集分析結(jié)果

圖4 成分-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)

表2 目標(biāo)成分相關(guān)通路的分類及信息

3 討論

中藥材的物質(zhì)基礎(chǔ)即其所含有效活性成分，從生物學(xué)角度來(lái)看，藥材原植物品種的形成是基因型與產(chǎn)地環(huán)境相互作用的結(jié)果。藥材藥效與其產(chǎn)地密切相關(guān)，唐代《新修本草》曰：“離其本土，則質(zhì)同而效異?！盵12]不同地域生態(tài)系統(tǒng)各異，不同生態(tài)系統(tǒng)所孕育藥材在有效成分含量及藥效方面也存在差異[13]。關(guān)于藥材所含化合物與其產(chǎn)地的相關(guān)性研究，長(zhǎng)期以來(lái)被中藥資源學(xué)領(lǐng)域視為研究熱點(diǎn)，然而針對(duì)不同產(chǎn)地藥材藥理學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究很少，究其緣由是中藥化學(xué)成分組成十分復(fù)雜[14]。不同產(chǎn)地的藥材含有活性成分的含量高低各異，而不同活性成分通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑綜合調(diào)控，進(jìn)而發(fā)揮不同的藥理作用，因此，開(kāi)展不同產(chǎn)區(qū)藥材藥理學(xué)相關(guān)研究非常困難，需從不同產(chǎn)區(qū)、不同藥理作用多維角度開(kāi)展大規(guī)模的篩選實(shí)驗(yàn)。本課題組前期研究中完成了科研文獻(xiàn)中不同產(chǎn)區(qū)當(dāng)歸藥材成分含量數(shù)據(jù)的整合，運(yùn)用主成分分析、聚類分析和單因素方差分析方法進(jìn)行多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，獲取了隴產(chǎn)當(dāng)歸的特征性高含量化學(xué)成分群。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法尋找不同產(chǎn)區(qū)藥材的特征性高含量成分群所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)、信號(hào)通路和疾病，將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法應(yīng)用到中藥資源學(xué)領(lǐng)域，可解決當(dāng)前中藥資源學(xué)與藥理學(xué)領(lǐng)域交叉相關(guān)研究面臨的難題，為我國(guó)不同產(chǎn)地中藥資源藥理作用機(jī)制的相關(guān)研究提供有力支撐。

課題組前期研究針對(duì)甘肅、四川、湖北、陜西、云南、河北6個(gè)產(chǎn)區(qū)梔子藥材中的10種化學(xué)成分含量數(shù)據(jù)，綜合運(yùn)用主成分分析、聚類分析和單因素方差分析方法進(jìn)行多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示：1)甘肅產(chǎn)區(qū)當(dāng)歸中總揮發(fā)油含量與其他產(chǎn)區(qū)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2)甘肅產(chǎn)區(qū)當(dāng)歸中揮發(fā)油類成分藁本內(nèi)酯、正丁基苯酞、正丁烯基苯酞含量與其他產(chǎn)區(qū)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，構(gòu)成甘肅當(dāng)歸的特征性高含量化學(xué)成分群。

本研究基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，針對(duì)隴產(chǎn)當(dāng)歸藥材進(jìn)行研究，選取其特征性高含量化學(xué)成分群藁本內(nèi)酯、正丁基苯酞、正丁烯基苯酞作為目標(biāo)成分，利用STITCH和SWISS數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)目標(biāo)成分相關(guān)靶點(diǎn)，并將得到的36個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入CTD數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)相關(guān)疾病[15]。結(jié)果靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)中PLAU、ALOX5、ESR1、AR、CYR19A1、STAT3這6個(gè)靶點(diǎn)排次靠前，是網(wǎng)絡(luò)中樞紐節(jié)點(diǎn)，表明其可能為目標(biāo)成分作用的核心靶點(diǎn)；疾病節(jié)點(diǎn)中，神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病以及消化系統(tǒng)疾病的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度(Degree)值排次靠前，表明隴產(chǎn)當(dāng)歸藥材特征性高含量成分群藁本內(nèi)酯、正丁基苯酞、正丁烯基苯酞可能通過(guò)LAU、ALOX5、ESR1、AR、CYR19A1、STAT3等36個(gè)潛在靶點(diǎn)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病以及消化系統(tǒng)疾病發(fā)揮相關(guān)藥理作用。即：在中藥資源學(xué)領(lǐng)域，針對(duì)隴產(chǎn)當(dāng)歸梔子藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，應(yīng)先從抗神經(jīng)系統(tǒng)疾病、抗心血管疾病、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)疾病以及抗消化系統(tǒng)疾病幾方面入手；相關(guān)藥理作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究，可從LAU、ALOX5、ESR1、AR、CYR19A1、STAT3等36個(gè)潛在靶點(diǎn)入手。

為進(jìn)一步深入挖掘隴產(chǎn)當(dāng)歸特征性高含量化學(xué)成分群的多維藥理作用機(jī)制，進(jìn)而為靶點(diǎn)生物功能及信號(hào)通路相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供科研依據(jù)，本研究還進(jìn)行了GO富集分析和通路富集分析，結(jié)果顯示，靶點(diǎn)基因數(shù)目較高的信號(hào)通路主要包括：Na+/Cl-神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na+/Cl-Dependent Neurotransmitter Transporters)、SLC介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)(SLC-Mediated Transmembrane Transport)、5-羥色胺能突觸(Serotonergic Synapse)、花生四烯酸代謝(Arachidonic Acid Metabolism)、白介素信號(hào)(Signaling by Interleukins)、催乳素信號(hào)通路(Prolactin Signaling Pathway)；雌激素信號(hào)途徑(Estrogen Signaling Pathway)等。這些信號(hào)通路中，Na+/Cl-神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可通過(guò)電化學(xué)梯度來(lái)驅(qū)動(dòng)神經(jīng)遞質(zhì)從突觸攝取到神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，從而終止突觸傳遞。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是治療性和非法化合物的靶點(diǎn)，它們的功能障礙與神經(jīng)系統(tǒng)的多種疾病有關(guān)[16]。SLC介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞外溶質(zhì)濃度的水平。在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中一些蛋白質(zhì)的自然突變與各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)[17]。5-羥色胺能突觸在學(xué)習(xí)記憶、情緒、睡眠、疼痛、運(yùn)動(dòng)功能和內(nèi)分泌等生理功能以及異常情緒、認(rèn)知等病理狀態(tài)中發(fā)揮重要作用；花生四烯酸代謝可通過(guò)多種途徑影響腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[18]。白細(xì)胞介素信號(hào)及催乳素信號(hào)通路與免疫系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[19]。雌激素信號(hào)途徑與腫瘤疾病及靶向藥物研究密切相關(guān)[20]。

研究結(jié)果從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度揭示了隴產(chǎn)當(dāng)歸藥材特征性高含量成分群相關(guān)靶點(diǎn)、關(guān)鍵生物通路以及主要相關(guān)疾病，將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)技術(shù)應(yīng)用到中藥資源學(xué)領(lǐng)域的研究中，為我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)中藥材多維藥理機(jī)制的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。