譚鳳嬌，肖鵬，左俊，金磊，程晨，雷臘梅，謝麗強(qiáng)，楊軍,*

1.中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所，福建省流域生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，城市環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水生態(tài)健康研究組，廈門 361021

2.中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所，湖泊與環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210008

3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

4.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生態(tài)學(xué)系，廣州 510632

近20多年來，在氣候變化和人類活動(dòng)的多重壓力下，內(nèi)陸水體藍(lán)藻水華發(fā)生頻率和強(qiáng)度呈快速增加趨勢(shì)，特別是產(chǎn)毒水華藍(lán)藻嚴(yán)重威脅水生態(tài)系統(tǒng)健康和飲用水安全[1]。除了在淺水湖泊常見的微囊藻水華之外，新型水華藍(lán)藻拉氏尖頭藻(Raphidiopsisraciborskii)由于其高毒性、暴發(fā)性和入侵性日益受到關(guān)注[2-3]。拉氏尖頭藻曾被稱為拉氏擬柱胞藻(Cylindrospermopsisraciborskii)，由于其細(xì)胞形態(tài)和16S rRNA基因序列與尖頭藻高度相似，因此分類學(xué)者目前在藍(lán)藻分類系統(tǒng)中將擬柱胞藻屬和尖頭藻屬統(tǒng)一合并為尖頭藻屬[4]。

拉氏尖頭藻隸屬藍(lán)藻門、念珠藻目、束絲藻科[5]，包括產(chǎn)毒株和無毒株，兩者在形態(tài)和16S rRNA基因方面難以區(qū)分，但是產(chǎn)擬柱胞藻毒素的藻株含有完整的擬柱胞藻毒素合成基因[6-7]。在同一水體分離到的拉氏尖頭藻細(xì)胞和藻絲體長度和寬度可能具有差異[8]，拉氏尖頭藻產(chǎn)毒藻株和無毒藻株可同時(shí)共存于相同水體中[9-10]。目前，利用分子標(biāo)記和產(chǎn)毒基因可以進(jìn)行拉氏尖頭藻分析，系統(tǒng)發(fā)育分析常用16S rRNA基因、rpoC1基因、16S～23S轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)等序列[11-12]，其中16S rRNA基因測(cè)序能夠有效地區(qū)分藍(lán)藻屬種間和種內(nèi)的變異[13-14]。此外，基于DNA序列的產(chǎn)毒藍(lán)藻PCR檢測(cè)方法已被成功應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)，可以通過擴(kuò)增毒素合成基因來實(shí)現(xiàn)，例如微囊藻毒素和擬柱胞藻毒素(CYNs)合成基因檢測(cè)[15-16]。其中，cyrJ基因是能夠進(jìn)行CYNs生物合成的藍(lán)藻所特有的[6]。CYNs合成基因簇包括編碼氨基轉(zhuǎn)移酶的cyrA、一個(gè)混合聚酮合成酶/非核糖體肽合成酶(PKS/NRPS)模塊(cyrB)、4個(gè)PKS(cyrC、cyrD、cyrE和cyrF)模塊和剪切酶等[6]。擬柱胞藻毒素是一種三環(huán)胍類生物堿，已報(bào)道5種異構(gòu)體，其中擬柱胞藻毒素(CYN)和脫氧擬柱胞藻毒素(deoxy-CYN)最為常見[17]。

拉氏尖頭藻常見于熱帶深水水體，能夠耐受不利環(huán)境條件如低光照強(qiáng)度和低營養(yǎng)水平，目前CYNs是全球第二常見的藍(lán)藻毒素[7,18-20]。有研究者將其廣泛分布?xì)w因于其較高的表型可塑性、產(chǎn)生化感物質(zhì)和氣候變化等[21-24]。從21世紀(jì)初開始，越來越多的證據(jù)顯示拉氏尖頭藻呈現(xiàn)出從熱帶逐漸向亞熱帶和溫帶地區(qū)擴(kuò)散的趨勢(shì)[2-3]。在我國，尤其在亞熱帶地區(qū)深水水庫拉氏尖頭藻水華發(fā)生頻率逐漸增加，近年來已逐漸成為我國東南地區(qū)水庫水華藍(lán)藻優(yōu)勢(shì)種群[25-26]。國內(nèi)學(xué)者雖然已經(jīng)成功分離多株拉氏尖頭藻藻株，但是產(chǎn)毒藻株較為稀缺。目前僅在浙江省杭州市湘湖分離3株產(chǎn)CYN藻株，廣東省千燈湖分離1株產(chǎn)deoxy-CYN藻株[27-29]。

本研究從福建省廈門市石兜水庫分離到4株拉氏尖頭藻，通過形態(tài)特征觀察、16S rRNA基因和cyr產(chǎn)毒基因序列分析，結(jié)合ELISA和LC-MS/MS化學(xué)檢測(cè)確定分離到的藻株均為產(chǎn)毒拉氏尖頭藻，研究結(jié)果有助于深入理解產(chǎn)毒拉氏尖頭藻的地理分布與擴(kuò)散規(guī)律，可為新型有害藍(lán)藻監(jiān)測(cè)預(yù)警和水華防控研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 藻種的分離鑒定和培養(yǎng)(Isolation,identification and culture of Raphidiopsis raciborskii)

石兜水庫位于福建省廈門市苧溪上游(圖1)，1959年10月建成。本研究中所用的拉氏尖頭藻均采集、分離自石兜水庫(24°42' N，118°00'E)，拉氏尖頭藻純化培養(yǎng)后，保種培養(yǎng)于中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所水生態(tài)健康研究組。石兜水庫庫容為6.14×107m3，目前為廈門市主要的飲用水水源之一[30]。廈門市屬于亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候區(qū)，多年平均氣溫和降水量分別為20.7 ℃和1 335.8 mm。水生態(tài)健康研究組于2010年1月在石兜水庫發(fā)現(xiàn)藻類水華，鑒定水華種類為拉氏尖頭藻(亦稱拉氏擬柱胞藻)，隨后對(duì)石兜水庫進(jìn)行長期連續(xù)定位監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)拉氏尖頭藻水華具有年際演替性[31]，特別是在廈門水庫枯水年份(2009—2010年、2014—2015年、2017—2018年和2020年)拉氏尖頭藻均為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)藻類，并形成不同程度的藍(lán)藻水華。

2018年4月，采集石兜水庫表層0.5 m的原水，在培養(yǎng)皿中利用毛細(xì)管挑取單藻絲體進(jìn)行培養(yǎng)(圖1)。首先，在200倍倒置光學(xué)顯微鏡下觀察拉氏尖頭藻形態(tài)，用毛細(xì)管吸取單藻絲體，在預(yù)先準(zhǔn)備的超純水中反復(fù)沖洗，至少?zèng)_洗5～6次，去除藻細(xì)胞表面附帶的雜物異物；其次，將洗滌后的藻絲體轉(zhuǎn)移至含有200 μL BG11培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)板中，放置于光照培養(yǎng)箱(寧波賽福公司，PG250)進(jìn)行培養(yǎng)。設(shè)置培養(yǎng)溫度為(27±1) ℃，光照強(qiáng)度為10 μmol·m-2·s-1，光照周期為12 h∶12 h；最后，每2～3 d觀察一次培養(yǎng)的拉氏尖頭藻，2～3周后再次鏡檢進(jìn)行物種鑒定，將生長良好的藻株轉(zhuǎn)移至50 mL錐形瓶進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。本研究中，共分離培養(yǎng)出4株生長良好的拉氏尖頭藻(圖1)，命名為R.raciborskiiXM1～XM4。

用于實(shí)驗(yàn)研究的藻株均同時(shí)接種于150 mL BG11培養(yǎng)基中，當(dāng)藻株處于對(duì)數(shù)生長后期時(shí)(細(xì)胞密度約為108cell·L-1)，同時(shí)對(duì)4株藻株取樣后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定分析，以確保實(shí)驗(yàn)過程中的一致性。

1.2 擬柱胞藻毒素分析(Cylindrospermopsin analysis)

首先使用Abraxis酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒(美國Abraxis，#522011)測(cè)定CYNs總濃度。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長后期的4株拉氏尖頭藻培養(yǎng)液分別取出2 mL，置于5 mL離心管中利用超聲波破碎儀裂解藻細(xì)胞，將裂解后的藻液離心后收集上清液，4 ℃保存?zhèn)溆?、測(cè)定。按照說明書測(cè)定CYNs濃度，為防止毒素濃度過高，對(duì)上清液10倍稀釋后進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定3次重復(fù)。

使用LC-MS/MS(日本島津，AB SCIEX API 3200TM)對(duì)拉氏尖頭藻藻液中CYNs進(jìn)行測(cè)定分析。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長后期的4株拉氏尖頭藻培養(yǎng)液分別取出5 mL，超聲波細(xì)胞粉碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎，使用0.45 μm濾膜(Acrodisc?Syringe Filter)過濾后-20 ℃保存?zhèn)溆?。隨后，使用AB SCIEX API 3200TMLC-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行毒素測(cè)定，離子源為ESI，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)正離子模式。CYN掃描MRM定量離子對(duì)為416.1/194.3，deoxy-CYN為400/194.3。液相色譜采用梯度模式洗脫，流動(dòng)相為5% (V∶V)乙腈，色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×50 mm,2.7 μm)，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，流速為0.6 mL·min-1。CYN和deoxy-CYN的定量均根據(jù)CYN的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。通過將CYNs濃度(μg·L-1)除以細(xì)胞豐度(cell·L-1)，計(jì)算CYNs細(xì)胞配額，最后將結(jié)果乘以106將μg·cell-1轉(zhuǎn)化為pg·cell-1[32]。

1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序(DNA extraction,PCR amplification and sequencing)

在拉氏尖頭藻的對(duì)數(shù)生長后期分別吸取純培養(yǎng)液15 mL，使用0.22 μm聚碳酸酯濾膜(直徑47 mm)過濾收集藻細(xì)胞，使用超純水進(jìn)行重懸浮和過濾，洗滌5～6次，將濾膜在無菌條件下剪至適當(dāng)大小，按照說明書使用FastDNA提取試劑盒(MP Biomedicals)進(jìn)行DNA提取。通過超微量分光光度計(jì)(Nanodrop 2.0)檢測(cè)DNA的濃度和質(zhì)量。

利用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)[33]，對(duì)4株拉氏尖頭藻基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性95 ℃、2 min；循環(huán)擴(kuò)增35次：95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、60 s；隨后延伸72 ℃、10 min；最后4 ℃保溫。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳，切取純化單一明亮的目標(biāo)條帶，進(jìn)行大腸桿菌連接、轉(zhuǎn)化和涂平板，挑取單克隆進(jìn)行搖菌和DNA測(cè)序。測(cè)序成功的單克隆DNA序列在BioEdit軟件(美國Borland)中進(jìn)行人工質(zhì)量確認(rèn)和16S rDNA序列拼接，在NCBI中進(jìn)行BLAST相似性分析。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析(Phylogenetic analysis)

從4株拉氏尖頭藻中成功獲得14條16S rRNA基因克隆序列(表1)，結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中來自不同國家的166株拉氏尖頭藻和10株外類群藍(lán)藻的基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。將190條16S rRNA基因序列使用MUSCLE軟件進(jìn)行序列比對(duì)[34]，然后利用trimAl軟件[35]進(jìn)行低質(zhì)量以及高變異度序列的過濾和修剪，最終用于構(gòu)建系統(tǒng)樹的DNA序列長度為1 004 bp。使用IQ-TREE最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)樹[36]，所使用的最優(yōu)模型為HKY+F+R2[37]。為進(jìn)一步驗(yàn)證系統(tǒng)進(jìn)化樹的可靠性，同時(shí)使用MEGA X軟件構(gòu)建鄰接關(guān)系(NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹[38]。對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度進(jìn)行1 000次重復(fù)抽樣(Bootstrap)驗(yàn)證。最后在MEGA X中編輯系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 廈門石兜水庫拉氏尖頭藻藻株16S rRNA基因序列GenBank登錄號(hào)Table 1 GenBank accession numbers for 16S rRNA gene sequence of Raphidiopsis raciborskii strains from Shidou Reservoir in Xiamen

1.5 基因組Survey測(cè)序(Genome survey sequencing)

將檢測(cè)質(zhì)量和濃度合格的R.raciborskiiXM2基因組DNA構(gòu)建小片段文庫，通過Illumina HiSeq平臺(tái)進(jìn)行PE150測(cè)序。將序列數(shù)據(jù)使用Trimmomatic軟件進(jìn)行質(zhì)量過濾[39]，去除低質(zhì)量的序列，再使用SOAPdenovo軟件[40]依次選擇21～81的kmer值進(jìn)行基因組拼接，最后基于N50值確定最優(yōu)結(jié)果。選擇GenBank中R.raciborskiiAWT205的CYN合成基因簇為參考序列，使用本地BLAST通過序列比較獲取藻株的CYN合成基因簇。R.raciborskiiXM2基因組序列已經(jīng)提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，BioProject為PRJNA796232，登錄號(hào)為SRR1757-4388。

2 結(jié)果(Results)

2.1 拉氏尖頭藻形態(tài)與產(chǎn)毒特征(Morphological and toxic characteristics of Raphidiopsis raciborskii)

經(jīng)顯微鏡鑒定，在廈門石兜水庫所分離的4株藻株均為拉氏尖頭藻(圖1)，分別將其命名為R.raciborskiiXM1、XM2、XM3和XM4。對(duì)4株拉氏尖頭藻的16S rRNA基因進(jìn)行克隆分析，共獲得14條序列(表1)，同已知的拉氏尖頭藻16S rRNA基因相比，序列相似性為99.8%～100%，表明本研究分離的4株藻株均為拉氏尖頭藻。

形態(tài)上，4株拉氏尖頭藻藻絲體均為直線型、不彎曲(圖1(b))，無鞘、具有氣囊，藻絲體平均長度分別為(199.22±11.57) μm、(168.31±6.57) μm、(191.90±12.83) μm和(122.23±3.50) μm(n=100)。藻細(xì)胞為圓柱形或圓筒形，長大于寬，4個(gè)藻株的細(xì)胞平均長度為(4.26±0.32) μm、(4.25±0.21) μm、(4.10±0.24) μm和(3.79±0.19) μm(n=20)。分離培養(yǎng)初期，藻絲體頂端生有異形胞，異形胞呈卵形或者水滴形，有時(shí)略彎曲，具單孔。在富含氮條件培養(yǎng)過程中隨著藻絲的生長，異形胞消失、頂端變尖細(xì)；缺氮培養(yǎng)處理后，藻絲體頂端異形胞會(huì)重新出現(xiàn)(圖1(b))。藻絲體細(xì)胞橫壁明顯、常收縊，藻絲體末端細(xì)胞呈圓錐形，圓錐體頂部較尖，少數(shù)藻絲體較鈍。此外，在培養(yǎng)過程中可觀察到藻絲體的厚壁孢子，為亞端生。

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，XM1、XM2、XM3和XM4擬柱胞藻毒素均為陽性(表2)。LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果顯示，4株藻株能夠同時(shí)合成CYN和deoxy-CYN(表2)；其中XM1、XM2和XM3主要合成CYN，CYN平均濃度分別為0.87、1.02和0.71 pg·cell-1，deoxy-CYN平均濃度分別為0.15、0.16和0.13 pg·cell-1；XM4主要合成deoxy-CYN，CYN濃度為0.03 pg·cell-1，deoxy-CYN濃度為0.42 pg·cell-1。

表2 ELISA和LC-MS/MS方法測(cè)定拉氏尖頭藻藻株的擬柱胞藻毒素(CYNs)Table 2 The cylindrospermopsins (CYNs) in four Raphidiopsis raciborskii strains determined by ELISA and LC-MS/MS

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析(Phylogenetic tree analysis)

16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，180株拉氏尖頭藻形成四大進(jìn)化枝(圖2)：非洲類群枝(MJ樹Bootstrap值為22%，n=10)、亞洲和歐洲類群枝(MJ樹Bootstrap值為45%，n=106)、大洋洲類群枝(主要為澳大利亞藻株)(MJ樹Bootstrap值為32%，n=28)和美洲類群枝(美國和巴西的藻株)(MJ樹Bootstrap值為18%，n=36)。

有趣的是，廈門分離的4株拉氏尖頭藻分別位于不同的進(jìn)化枝(圖2)。其中，XM2藻株16S rRNA基因序列與非洲藻株遺傳距離最近；另外3個(gè)藻株(XM1、XM3和XM4)位于亞洲/歐洲類群分枝。XM1、XM3和XM4藻株基因序列與已報(bào)道中國杭州藻株、泰國藻株、日本藻株和德國藻株遺傳距離較近。

2.3 拉氏尖頭藻cyr基因簇(cyr gene cluster of Raphidiopsis raciborskii)

選取R.raciborskiiXM2進(jìn)行基因組測(cè)序后，對(duì)cyr基因簇進(jìn)行組裝、分析和注釋，其完整長度約為38 kb(圖3和表3)。XM2藻株cyr基因簇包含12個(gè)cyr基因?；蛐蛄信c拉氏尖頭藻AWT205、CHAB3438和CHAB358藻株同源性較高(98.97%～99.84%)；而且cyr簇中基因排列比較顯示，不同藻株的cyr基因序列較為保守，但排列模式各不相同。相比而言，XM2藻株的cyrB基因序列被分割成2部分，cyrI基因被分割為3部分；XM2藻株cyr基因簇中缺少cyrL、cyrN和cyrO基因(圖3和表3)。

表3 拉氏尖頭藻XM2藻株cyr基因簇注釋Table 3 The annotation of the genes of the cyr cluster from Raphidiopsis raciborskii XM2

圖3 Raphidiopsis raciborskii AWT205(澳大利亞藻株)[6]、CHAB3438/CHAB358(浙江藻株)[25]與XM2(福建藻株)的cyr基因簇基因結(jié)構(gòu)比較Fig. 3 Comparison of the gene organizations of cyr gene clusters from R. raciborskii AWT205 (Australia) [6],CHAB3438/CHAB358 (Zhejiang Province,China) [25] and XM2 (Fujian Province,China)

3 討論(Discussion)

本研究首次在福建省分離到4株產(chǎn)毒拉氏尖頭藻，通過CYNs合成基因分析和毒素測(cè)定證實(shí)了其具有產(chǎn)生CYNs的能力。廈門石兜水庫產(chǎn)毒拉氏尖頭藻的細(xì)胞形態(tài)基本相同，但是跟其他地區(qū)不同藻株間的藻絲體形態(tài)特征具有一定的差異。廈門藻株平均細(xì)胞長度(3.79～4.26 μm)小于澳大利亞分離的拉氏尖頭藻藻株細(xì)胞平均長度(5～10 μm)[10]，但廈門藻株藻絲體平均長度(122～199 μm)長于廣東千燈湖藻株(41～78 μm)[28]。

藍(lán)藻的同一物種可能包含多種生態(tài)型，它們對(duì)環(huán)境變化的多樣化響應(yīng)導(dǎo)致藻株生態(tài)類型的差異[43]。拉氏尖頭藻具有高度的環(huán)境適應(yīng)性，在生理和形態(tài)方面可塑性較高[44]，不同地理位置和不同水體生境可能會(huì)造成拉氏尖頭藻生態(tài)類型的變化。福建廈門拉氏尖頭藻藻株具有異形胞，在富含氮的條件下培養(yǎng)一段時(shí)間后消失，在澳大利亞藻株和泰國藻株中同樣發(fā)現(xiàn)在氮源充足條件下異形胞消失的概率增加[13,45]。異形胞主要功能為固氮，當(dāng)水體氮源充足時(shí)，異形胞分化基因可能不表達(dá)[3,46]。即使在4株廈門藻株藻絲體形態(tài)之間也有輕微的形態(tài)差異，這表明在種群和個(gè)體水平上藻株也存在形態(tài)多樣性。

本研究同時(shí)使用ELISA試劑盒和LC-MS/MS方法對(duì)擬柱胞藻毒素進(jìn)行定量和定性分析，確定所分離的4株拉氏尖頭藻均為產(chǎn)毒藻株。其中，XM1、XM2和XM3藻株所產(chǎn)毒素以CYN為主，在拉氏尖頭藻對(duì)數(shù)生長后期培養(yǎng)液中濃度為0.71～1.02 pg·cell-1；XM4則以deoxy-CYN為主，濃度為0.42 pg·cell-1。目前，我國東南地區(qū)水庫拉氏尖頭藻的檢出率和檢出地區(qū)急劇增加，在研究人員分離的上百株藻株中僅報(bào)道4株是產(chǎn)毒株：2012年和2020年浙江省杭州市湘湖分別分離到2株產(chǎn)CYN藻株和1株產(chǎn)CYN藻株，產(chǎn)毒量為1 268～2 637 μg·g-1[27,29]；2017年在廣東省千燈湖分離到1株產(chǎn)deoxy-CYN藻株，產(chǎn)毒量為1 745.19 μg·L-1[28]。遺憾的是，對(duì)我國內(nèi)陸水體尖頭藻的多數(shù)研究中并沒有分析檢測(cè)CYNs，本研究將我國已知的產(chǎn)毒拉氏尖頭藻純培養(yǎng)藻株擴(kuò)大到8株。因此，未來的研究中不僅需要關(guān)注拉氏尖頭藻水華，更應(yīng)當(dāng)重視研究拉氏尖頭藻產(chǎn)毒特性和機(jī)理。

早期研究基于16S rRNA基因序列分析可以大致區(qū)分來自不同地理區(qū)域的拉氏尖頭藻藻株[14]，有的研究則將16S rRNA基因與ITS、rpoC1等基因結(jié)合，在更高的分辨率層面評(píng)估五大洲拉氏尖頭藻的遺傳變異與種群分化[47]。本研究從16S rRNA基因來看，XM1、XM3和XM4藻株匯聚到亞洲/歐洲進(jìn)化枝，亞洲和歐洲拉氏尖頭藻藻株之間具有更高的同源性[3,46]，然而大洋洲和美洲的藻株將亞歐進(jìn)化分枝分為2部分；值得注意的是，XM2藻株與非洲藻株同源性較高。這說明廈門石兜水庫中的拉氏尖頭藻可能存在不同的基因型，遺傳多樣性較高。我們認(rèn)為可能的解釋有3種：擴(kuò)散假說、分化假說和擴(kuò)散分化混合假說。擴(kuò)散假說可以理解為，石兜水庫不同基因型的拉氏尖頭藻分別來源于不同地方，共存于石兜水庫水體；分化假說可以理解為，石兜水庫不同基因型的拉氏尖頭藻具有同一個(gè)來源，是在中國福建當(dāng)?shù)剡z傳分化的結(jié)果；混合假說可以理解為拉氏尖頭藻物種擴(kuò)散和遺傳分化同時(shí)發(fā)生的結(jié)果，并不能用單一的擴(kuò)散過程或分化過程解釋。

毫無疑問，拉氏尖頭藻遺傳多樣性是長期演化的產(chǎn)物，較高的遺傳多樣性可能意味著較快的演化速率。在擴(kuò)散過程中的演化導(dǎo)致了基因型的多樣化，其擴(kuò)散過程可能是不同環(huán)境需求對(duì)其基因型進(jìn)行選擇的過程[12]。國際上對(duì)于拉氏尖頭藻的起源、地理分布和擴(kuò)散具有不同的解釋，Padisák[44]提出拉氏尖頭藻起源于非洲，隨后擴(kuò)散到赤道地區(qū)和美洲中部、或者以澳大利亞為中心逐漸向熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)擴(kuò)散。有研究認(rèn)為歐洲大陸藻株最有可能起源于亞洲和澳大利亞[3,14]。Gugger等[11]綜合利用16S rRNA基因、ITS、ropC1和nifH基因分析了美洲、歐洲、非洲和澳大利亞的18株尖頭藻，認(rèn)為更新世冰期時(shí)代的干冷氣候?qū)е录忸^藻在美洲和歐洲絕大多數(shù)地區(qū)滅絕，僅有南方少數(shù)溫暖地區(qū)的尖頭藻生存下來，當(dāng)前美洲和歐洲地區(qū)尖頭藻可能主要來自其南方溫暖區(qū)域株系的擴(kuò)散。僅僅從16S rRNA基因序列單基因分析，難以判斷廈門拉氏尖頭藻是否來自非洲或者澳大利亞的擴(kuò)散。從產(chǎn)毒特性方面來看，由于目前在非洲未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)CYNs藻株，因此在廈門發(fā)現(xiàn)的藻株更有可能是由于澳大利亞藻株的擴(kuò)散所導(dǎo)致的結(jié)果。事實(shí)上，候鳥遷徙攜帶拉氏尖頭藻，可能會(huì)導(dǎo)致藻株基因型之間的頻繁交換。例如，候鳥在遷徙過程中，其足和喙能夠攜帶拉氏尖頭藻厚壁孢子[48]，在全球候鳥遷飛區(qū)中，中國東部沿海地區(qū)位于東亞-澳大利西亞遷飛區(qū)，在該遷飛區(qū)內(nèi)，每年有數(shù)以千萬計(jì)的水鳥在我國東部沿海地區(qū)遷徙過境或中轉(zhuǎn)停歇；涉及到亞洲與非洲的遷飛區(qū)是西亞-東非路線，因此很少有候鳥在非洲和東亞地區(qū)之間遷徙[49]。浙江、福建和廣東均位于東亞-澳大利西亞候鳥遷飛區(qū)，在此遷徙過境和停歇的部分水鳥(特別是數(shù)量眾多的鷸類)在澳大利亞越冬。因此推測(cè)近年在浙江和廣東發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)毒藻株可能與候鳥遷徙攜帶藻株的傳播和擴(kuò)散存在密切關(guān)系。此外，大陸之間往來的運(yùn)輸、船舶壓載水、熱帶魚的進(jìn)口和科學(xué)樣本的轉(zhuǎn)移等也可能是重要的傳播媒介[50]?？傊＝ㄊ邓畮煨藿ㄓ?0世紀(jì)50年代末，至今已有60年的歷史，石兜水庫拉氏尖頭藻的來源十分復(fù)雜，可能存在多種途徑，目前的數(shù)據(jù)仍然缺乏對(duì)拉氏尖頭藻地理分布、起源擴(kuò)散的一致性解釋，因此，未來需要全球科學(xué)家通力合作，綜合野外觀測(cè)、控制實(shí)驗(yàn)和模型模擬等方法進(jìn)一步深入研究其遺傳多樣性與地理分布之間的關(guān)系，為這一新型水華藍(lán)藻防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

廈門拉氏尖頭藻同其他大洲的產(chǎn)毒藻株與無毒藻株聚在一起，進(jìn)一步說明基于16S rRNA基因難以區(qū)分產(chǎn)毒與無毒藻株，這也暗示CYNs合成基因可能會(huì)在藻株之間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移；或者，在一些拉氏尖頭藻藻株中，由于基因突變和缺失、序列重復(fù)和轉(zhuǎn)座子插入等造成CYNs生物合成基因簇中關(guān)鍵基因失活，進(jìn)而喪失了產(chǎn)毒能力[17,27]。拉氏尖頭藻XM2藻株的cyr基因簇中未發(fā)現(xiàn)cyrN和cyrO基因，這與在浙江杭州分離獲得的CHAB3438/CHAB358藻株cyr基因簇一致[27]。雖然在澳大利亞AWT205藻株cyr基因簇中報(bào)道了這2個(gè)基因，并推測(cè)這2種基因可能在毒素合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有一定的作用[6]，但是由于這2種基因僅在cyr基因簇末端被發(fā)現(xiàn)，且不與基因簇中的其他基因相鄰，所以可能不屬于cyr基因的核心組分[51-52]。值得注意的是，XM2藻株中cyr基因發(fā)生重新排列，與杭州2個(gè)CHAB藻株的cyr基因簇排列最為相似，事實(shí)上這3株藻株分離地點(diǎn)最近，均位于中國東南。在XM2藻株cyr基因簇內(nèi)呈現(xiàn)重排，可能是在DNA復(fù)制過程中發(fā)生了變異，導(dǎo)致基因結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，使cyrK、cyrJ和cyrH基因從末端被移除，并插入了cyrB所在的位置。這不僅導(dǎo)致了cyr簇基因序列的重排，還導(dǎo)致了cyrB和cyrI基因的分割。另一種假設(shè)認(rèn)為這些cyr簇基因在進(jìn)化過程中是相關(guān)的，但可能存在不同的祖先[51]。

綜上所述，福建省廈門市石兜水庫分離到4株拉氏尖頭藻，從細(xì)胞形態(tài)和16S rRNA基因序列方面都鑒定為拉氏尖頭藻，不同藻株之間藻細(xì)胞相同、但是藻絲體略有差異，在富含氮源的培養(yǎng)條件下異形胞會(huì)消失。CYNs合成基因分析、CYNs化學(xué)測(cè)定表明4株拉氏尖頭藻均可同時(shí)產(chǎn)生CYN和deoxy-CYN。16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析表明廈門拉氏尖頭藻種群遺傳多樣性較高，推測(cè)可能是擴(kuò)散過程和分化過程同時(shí)發(fā)生的結(jié)果。此外，福建廈門產(chǎn)毒藻株CYN合成基因簇與浙江杭州產(chǎn)毒藻株基因簇最為相似、高度同源，推測(cè)這些產(chǎn)毒藻株可能來自澳大利亞藻株的擴(kuò)散，與東亞-澳大利西亞遷飛區(qū)候鳥遷徙密切相關(guān)。未來的工作中，我們將結(jié)合多種標(biāo)記基因和基因組分析對(duì)拉氏尖頭藻地理種群的擴(kuò)散分化進(jìn)行深入的探討。

拉氏尖頭藻是一類新型水華藍(lán)藻，已經(jīng)在我國東南地區(qū)水庫中廣泛分布，能夠在中營養(yǎng)水庫形成藍(lán)藻水華，但是尚未引起管理部門和公眾的足夠重視。在氣候變暖背景下水庫型飲用水水源地拉氏尖頭藻監(jiān)測(cè)、預(yù)警及其水華防控值得深入研究，特別應(yīng)該加大投入支持研究中國水庫拉氏尖頭藻傳播擴(kuò)散的生態(tài)過程、生態(tài)機(jī)制與生態(tài)效應(yīng)，進(jìn)而保障飲用水安全。