羅 渟， 賈 雯， 高 峰， 王 靜

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 內(nèi)窺鏡科，遼寧 沈陽(yáng) 110013

胃癌是癌癥相關(guān)死亡的第三大常見(jiàn)原因，診斷晚，病死率高[1]。Notch1屬于Notch受體家族，是多細(xì)胞生物固有的一種進(jìn)化保守的信號(hào)通路，在胚胎發(fā)生和組織穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用[2-3]。有研究表明，Notch1在胃癌的發(fā)展中起重要作用[4]。Wnt蛋白是一種分泌型生長(zhǎng)因子，在多細(xì)胞動(dòng)物的胚胎發(fā)育和成年組織穩(wěn)態(tài)期間調(diào)節(jié)干細(xì)胞和祖細(xì)胞的增殖、分化[5-6]。有研究表明，高水平的非對(duì)稱性二甲基精氨酸可正向調(diào)控胃癌中β-catenin的表達(dá)，并通過(guò)Wnt/β-catenin通路促進(jìn)胃癌遷移、侵襲[7]。Wnt3的上調(diào)通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和抑制凋亡在胃癌發(fā)生中起重要作用，Wnt3可能是胃癌治療的有利突破點(diǎn)[8]。本研究旨在探討胃癌組織中Notch1、Wnt3的表達(dá)情況及臨床意義?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取2015—2020年北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院收治的36例胃腺癌患者為研究對(duì)象。其中，女性10例，男性26例；年齡32～88歲，中位年齡63歲。術(shù)中取36例患者的胃癌組織及26例患者的癌旁正常組織，離體后經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋，-80℃冷凍備用。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 組織芯片制作 由一名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理專家挑選典型的癌與癌旁組織蠟塊，觀察并根據(jù)切片確定具有代表性的病變部位，加以標(biāo)記制作空白蠟塊，應(yīng)用組織微陣列儀在蠟塊中打孔(孔徑1 mm，長(zhǎng)4 mm)，然后在選取的蠟塊中穿取標(biāo)記組織直徑，準(zhǔn)確放入空白蠟塊的小孔中按照順序依次操作，直至所有組織標(biāo)本種植于空白蠟塊中，最后石蠟切片，低溫保存。

1.3 免疫組化

1.3.1 主要試劑 兔抗人Notch1單克隆抗體(北京中杉生物技術(shù)有限公司)，兔抗人Wnt3單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，濃度均為1∶100；SP兩步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；蘇木精(北京中杉生物技術(shù)有限公司)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，PBS洗液沖洗3次，每次3 min。用濃度為0.3%的過(guò)氧化氫溶液在室溫條件下抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物20 min，再以PBS洗液沖洗3次，每次3 min。分別選取Notch1、Wnt3的對(duì)應(yīng)多克隆抗體，工作濃度為1∶100，在37℃條件下培育1 h，再用PBS洗液沖洗3次，每次3 min。再以實(shí)驗(yàn)配套試劑在37℃條件下培育30 min，清洗3次，使用DAB顯色10 min，然后以蘇木素襯染，熱水藍(lán)化。吹干后，以樹(shù)脂進(jìn)行封片處理，最后在鏡下觀察。用已知標(biāo)準(zhǔn)的Notch1和Wnt3表達(dá)陽(yáng)性的正常胃組織標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，顯微鏡下觀察。

1.4 結(jié)果判定 根據(jù)半定量標(biāo)準(zhǔn)：取染色良好切片，顯微鏡100倍視野下隨機(jī)選取10個(gè)視野。染色結(jié)果取染色強(qiáng)度(0：無(wú)染色，1：輕度，2：中度，3：高度)和染色范圍(0為1%～10%；1為10%～25%；2為25%～50%；3為50%～75%；4為>75%)乘積，按0～12分為4個(gè)等級(jí)，0得0分，1～4得1分，5～8得2分，9～12得3分[9]。兩項(xiàng)評(píng)分乘積≥3為陽(yáng)性表達(dá)，乘積<3為陰性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以例(百分率)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織與正常組織Notch1、Wnt3表達(dá) 胃癌組織中Notch1陽(yáng)性率為33.3%(12/36)，低于正常組織的76.9%(20/26)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。胃癌組織中Wnt3陽(yáng)性率為83.3%(30/36)，高于正常組織的46.1%(12/26)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 胃癌組織Notch1、Wnt3表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)性 Notch1、Wnt3表達(dá)與胃癌患者的性別、年齡、TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。Notch1、Wnt3表達(dá)與胃癌的分化程度、浸潤(rùn)深度、有無(wú)脈管浸潤(rùn)均有相關(guān)性(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 Notch1、Wnt3表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 Notch1、Wnt3在胃癌組織中表達(dá)相關(guān)性 Notch1和Wnt3共同陽(yáng)性者7例，共同陰性者1例，Notch1陽(yáng)性而Wnt3陰性者5例，Notch1陰性而Wnt3陽(yáng)性者23例。Spearman相關(guān)性分析顯示，在胃癌組織中，Notch1和Wnt3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.474，P<0.05)。

3 討論

Notch1是Notch家族成員之一，與乳腺癌[10]、白血病[15]、膠質(zhì)瘤[12]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[13]等多種癌癥有關(guān)。一項(xiàng)薈萃分析中的分層分析顯示，Notch1表達(dá)升高與腫瘤部位、大小、類型、淋巴血管侵襲和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移有關(guān)[4]。Notch1信號(hào)通路是進(jìn)化保守的細(xì)胞相互作用的一種機(jī)制，參與胚胎發(fā)育和正常細(xì)胞的增殖、分化、生存和凋亡等過(guò)程[14]。Notch1在胃癌組織中表達(dá)升高，并與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，在胃癌細(xì)胞系中敲除Notch1可以減弱腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移并阻滯細(xì)胞周期[15-16]。有研究表明，Notch信號(hào)通路是維持胃竇干細(xì)胞生長(zhǎng)的必要因素，Notch1是調(diào)節(jié)小鼠和人胃上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的主要Notch受體之一[17]。緩慢激活胃干細(xì)胞的Notch通路可誘導(dǎo)細(xì)胞增生和組織肥大，提示Notch可能驅(qū)動(dòng)胃癌的發(fā)生[18]。

本研究采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)胃癌組織中Notch1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Notch1在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁組織。有研究認(rèn)為，Notch1在胃癌的發(fā)生中可能起抑制作用[19-20]。Ye等[21]研究表明，Notch1在不同的細(xì)胞中激活的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也不同，Notch1可能在胃癌中發(fā)揮抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，Wnt3在胃癌中的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，提示W(wǎng)nt3可能參與調(diào)控胃癌的浸潤(rùn)、遷移。Wnt是作用于細(xì)胞增殖、凋亡、分化和遷移等多種過(guò)程的一種分泌型脂質(zhì)修飾糖蛋白家族[22]。Wnt3是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的間充質(zhì)癌細(xì)胞分泌的促進(jìn)上皮癌細(xì)胞侵襲并誘導(dǎo)繼發(fā)性EMT表型的關(guān)鍵因子，揭示了腫瘤異質(zhì)性的重要意義，以及腫瘤微環(huán)境中上皮和間質(zhì)轉(zhuǎn)化的癌細(xì)胞之間的相互作用，通過(guò)Wnt依賴的機(jī)制促進(jìn)疾病轉(zhuǎn)移[23]。

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Notch1與Wnt3在胃癌組織中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。從臨床病理角度分析，Notch1與Wnt3在高分化、不伴脈管浸潤(rùn)、漿膜未侵犯的胃癌組織中分別高表達(dá)和低表達(dá)，提示Notch1、Wnt3的表達(dá)可能與胃癌患者的預(yù)后相關(guān)。但在不同組織中，Notch對(duì)細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的作用有所不同，即使是在同一組織的腫瘤，因?yàn)榘l(fā)展階段的不同，Notch的作用也會(huì)發(fā)生變化[20]。本研究結(jié)果顯示，Notch1在胃癌發(fā)展中起抑制作用，而Wnt3則起促進(jìn)作用，與既往多數(shù)研究結(jié)果存在差異，可能是Notch1作為腫瘤抑制基因還是致癌基因取決于癌癥的類型、階段和其他相關(guān)基因的突變。

綜上所述，Notch1在胃癌發(fā)展中可能起抑制作用，而Wnt3則起促進(jìn)作用，Notch1與Wnt3的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。本研究存在不足，樣本量較小可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本深入研究。