滿海喬，王 嬌，唐光甫，桂艷玲，韓 潔，趙杰宏

(貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州省中藥生藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

0 引言

【研究意義】 蟬花(Cordycepscicadae)為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，是由蟲生真菌蟬棒束孢〔IsariacicadaeMiquel；同物異名：蟬擬青霉Paecilomycescicadae(Miquel) Samson〕寄生蟬若蟲后形成的菌蟲復(fù)合體[1]。早在南北朝的《雷公炮炙論》中已有記載，歷代醫(yī)藥典籍對(duì)蟬花有大量描述，其具疏散風(fēng)熱、透疹、明目退翳的功效[2]。近代研究表明，蟬花有改善腎功能、抗腫瘤、降血糖等藥理作用[3-4]，臨床上有望成為冬蟲夏草的替代藥。蟬花主要生長(zhǎng)環(huán)境為竹林以及熱帶和亞熱帶的闊葉林等，遍布在中國(guó)秦嶺至淮河以南的省份[5-6]，因?yàn)槠湮兜栗r美，營(yíng)養(yǎng)豐富，民間有長(zhǎng)期食用的習(xí)慣，已成為藥食兩用的重要蟲草資源。蟲草往往有無(wú)性型和有性型兩種形態(tài)，自然界常見的是有性型，如蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)和冬蟲夏草(C.sinensis)，但蟬花卻主要是無(wú)性型(即蟬棒束孢)，其有性型極其稀缺，也無(wú)法通過人工培養(yǎng)獲得，導(dǎo)致蟬花有性型的藥材基原混亂，至今也未知蟬花有性型稀缺的原因。因此，解析蟬花有性生殖的遺傳調(diào)控機(jī)制對(duì)其深入研發(fā)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，劉愛英等[7]從廣西樂業(yè)天坑采集1株有性型和無(wú)性型共存的復(fù)型蟬花標(biāo)本，并將其命名為神木蟬蟲草(C.cicadae-SM sp.Nov.Liu Ai-Ying&Zou Xiao)；李增智等[8]從江西井岡山采挖到蟬花有性型標(biāo)本，命名為C.chanhuaZ.Z.Li,F.G.Luan,Hywel-Jones,C.R.Li &S.L.Zhang,sp.nov.，并指出與劉愛英等[7]報(bào)道的標(biāo)本在顯微結(jié)構(gòu)上存在區(qū)別，因此蟬花有性型仍存在爭(zhēng)議。有性生殖能去除真菌有害基因突變，還可以產(chǎn)生基因型多樣性，增強(qiáng)環(huán)境適應(yīng)性[9-10]。蟲草屬真菌的有性生殖主要由交配型基因MAT參與調(diào)控。MAT基因及其編碼蛋白具有調(diào)控生殖器官分化、營(yíng)養(yǎng)繁殖和子囊殼形成等作用[11-12]。根據(jù)MAT基因在單倍體細(xì)胞中的分布情況，有性生殖可分為同宗配合和異宗配合[13-14]。同宗配合是同時(shí)含有MAT1-1和MAT1-2交配型基因[15]，1株即可完成有性生殖；而異宗配合含有不同交配型基因，需不同交配型的菌株共同完成有性生殖[16-18]。MAT1-1含MAT1-1-1、MAT1-1-2和MAT1-1-3交配型基因，其中，MAT1-1-1研究較多，編碼含HMG α-box保守域的轉(zhuǎn)錄因子[19-20]；MAT1-2僅含交配型基因MAT1-2-1，編碼含HMG box保守域的轉(zhuǎn)錄因子[21-22]?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】蟬花有性型稀缺，其是否與蟬棒束孢交配型基因MAT的序列結(jié)構(gòu)、基因變異及基因分布特征有關(guān)，尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過研究7省12市100份蟬花標(biāo)本中蟲生真菌蟬棒束孢的MAT基因，初步揭示蟬棒束孢M(jìn)AT基因的分布特征和多樣性，為提高蟬花的生殖率提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

新鮮蟬花標(biāo)本共100個(gè)，采自全國(guó)7省12市(表1)。用酒精棉球擦拭蟲體表面，無(wú)菌鑷子輕輕將其掰開，接種針挑取少許內(nèi)菌核，接種于常規(guī)沙氏固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d和14 d時(shí)觀察記錄各菌株的菌落形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)。

表1 蟬花標(biāo)本的來(lái)源Table 1 Source of Cordyceps cicadae samples

1.2 ITS和MAT序列擴(kuò)增

用基因組提取試劑盒(購(gòu)自北京天根生化)提取各菌株的基因組DNA，采用引物ITS1/4、1MAT1-1F/R、2MAT1-1F/R、gaoMAT1-1F/R和gaoMAT1-2F/R(表2)分別擴(kuò)增目標(biāo)序列，反應(yīng)體系：上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×Taq PCR Mix 10 μL，模板2 μL，最后用ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送華大基因測(cè)序。

表2 ITS和MAT序列的擴(kuò)增引物Table 2 Amplification primers of ITS and MAT sequences

1.3 聚類分析

獲得的ITS或MAT序列在NCBI進(jìn)行 Blastn(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)比對(duì)，選取覆蓋率和相似性最高的菌種作為分子鑒定結(jié)果。在MEGA 7中，將獲得的不同ITS序列進(jìn)行Align對(duì)齊，截去兩端不齊序列后，選擇Phylogenetic Analysis，點(diǎn)擊Phylogeny，選擇Construct/Test Neighbor-Joining Tree，更改No.of Bootstrap Replications為1 000，其余參數(shù)為默認(rèn)值點(diǎn)擊Compute，最后查看和下載聚類樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蟬花的形態(tài)多樣性

不同來(lái)源的蟬花標(biāo)本均在蟲體上具有典型的無(wú)性型孢梗束結(jié)構(gòu)，但未發(fā)現(xiàn)有性型子座。不同產(chǎn)地蟬花的孢梗束長(zhǎng)短、色澤和產(chǎn)孢量差異較大，其中，福建產(chǎn)蟬花的孢梗束較細(xì)長(zhǎng)；廣州的較短，產(chǎn)孢量也較??；安徽宣城、安徽霍山、安徽新華、廣州和平蟬花的孢梗束金黃色，福建德化的淡黃色，四川雅安的棕色。蟬花菌種在沙氏培養(yǎng)基上的菌落呈多層輪狀。顯微鏡下各菌株產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的瓶?；颗虼?，頂端驟尖，孢子為長(zhǎng)橢圓形，串生，孢子大小(5.0～7.5) μm ×(2.5～5.0) μm，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異，具有典型的蟬棒束孢顯微特征(圖1)。

2.2 ITS序列聚類

對(duì)從蟬花分離的100份菌株進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增和測(cè)序，經(jīng)NCBI blastn比對(duì)，100份

注：A為廣州和平3，B為福建德化1，C為四川天主4，D為安徽霍山5，E為安徽宣城3，F(xiàn)為安徽宣城9，G為安徽新華2；測(cè)微尺為2.5 μm/小格。

菌株與NCBI上蟬花C.cicadae(GenBank：MN128643.1)的序列相似性最高。隨機(jī)選擇從不同產(chǎn)地蟬花分離的13份菌株與NCBI上蟬擬青霉P.cicadae(GenBank：HQ874633.1)、環(huán)鏈棒束孢I.cateniannulata(GenBank：KT944289.1)、玫煙色棒束孢I.fumosorosea(GenBank：KR184828.1)、斜鏈棒束孢I.cateniobliqua(GenBank：KP743151.1)、爪哇棒束孢I.javanica(GenBank：MF416455.1)、日本棒束孢I.japonica(GenBank：AT001673.1)以及蟬花C.cicadae(MF460361.2，KY924492.1，MZ373136.1，MN128643.1)的ITS序列聚類分析，以產(chǎn)黃青霉Penicilliumchrysogenum(GenBank：U57323.1)為外群，由MEGA 7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)顯示，13份菌株與蟬擬青霉和蟬花聚為一類，支持率為100%，與其他棒束孢屬菌種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，進(jìn)一步證明該試驗(yàn)的菌株是從蟬花分離的蟬棒束孢。

注：?為研究分離菌株。Note:? indicates studied isolated plant.圖2 部分不同來(lái)源蟬棒束孢ITS序列進(jìn)化樹Fig.2 ITS sequence cladogram of different I. cicadae strains from different sources

2.3 MAT序列的克隆

用引物分別克隆各菌株的1MAT1-1-1、2MAT1-1-1、gaoMAT1-1-1和gaoMAT1-2-1靶標(biāo)序列，獲得的片段分別是1 150 bp、1 850 bp、480 bp和362 bp(圖3)，符合預(yù)期大小。測(cè)序表明，1MAT1-1-1有HMG α-box功能域，2MAT1-1-1缺失HMG α-box，gaoMAT1-1-1為1MAT1-1-1的部分序列，gaoMAT1-2-1具有HMG box。以FJDH7和AHLJ1菌株為例，1MAT1-1-1、2MAT1-1-1分別與NCBI上蟬花MAT1-1-1(GenBank：KP749925.1)的堿基序列相似性為99.80%(覆蓋率100%)和99.81%(覆蓋率48%)，氨基酸序列相似性為100%和42.02%；gaoMAT1-2-1與NCBI上蟬花MAT1-2-1(GenBank：KP749926.1)的堿基序列相似性為99.73%(覆蓋率99%)，氨基酸序列相似性為90.18%?？梢?，1MAT1-1-1和gaoMAT1-2-1指向的基因具有功能，2MAT1-1-1的基因可能序列和功能不全。

2.4 MAT序列的分布

PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，100個(gè)菌株中13個(gè)菌株僅有1MAT1-1-1，79個(gè)菌株僅有g(shù)aoMAT1-2-1，其中，兼有1MAT1-1-1和gaoMAT1-2-1交配型基因的菌株有8個(gè)(表3)，兼有菌株分布在安徽新華、安徽宣城、江西湖口、四川天主和福建德化。2MAT1-1-1與gaoMAT1-2-1同時(shí)存在，有1MAT1-1-1(包括兼有g(shù)aoMAT1-2-1)的菌株未檢測(cè)到2MAT1-1-1，但福建產(chǎn)FJDH7和FJDH9菌株同時(shí)存在1MAT1-1-1、2MAT1-1-1和gaoMAT1-2-1序列(圖3D)。多數(shù)地區(qū)的菌株以gaoMAT1-2-1占優(yōu)勢(shì)，而四川天主和廣西樂業(yè)菌株以1MAT1-1-1占優(yōu)勢(shì)。安徽廬江、安徽霍山、江蘇宜興和廣州和平的菌株未檢測(cè)到1MAT1-1-1。從數(shù)據(jù)上看，蟬花有同宗配合的潛力，也存在異宗配合的可能，有性生殖的概率較高，但與蟬花有性型稀缺的實(shí)際情況不符。

Note:A,gaoMAT1-2-1;B,gaoMAT1-1-1(1～6：GZHP2，AHWH7，AHCZ2，AHXC5，AHXC6 and AHXC7);C,1MAT1-1-1(7～13：AHXC7，AHXC8，AHXC9，AHXH2，AHWH3，AHWH6 and AHCZ4)；D,2MAT1-1-1(14～35：AHWH8，JSYX3，JXHK3，JXHK4，JXHK8，JXHK9，SCTZ2，SCTZ6，AHLJ1，AHLJ2，AHXC3，AHXC9，AHXC11，AHXH1，AHXH2，AHCZ1，GZHP1，AHHS12，AHHS13，F(xiàn)JDH6，GXTK1 and ddH2O)；E：1MAT1-1-1/2MAT1-1-1(36～37：FJDH7 and FJDH9).M1:DL1 000 DNA marker.M2:DL2 000 DNA marker.圖3 部分菌株MAT基因的電泳圖譜Fig.3 Electrophoretogram of MAT gene of part strains

表3 不同蟬棒束孢M(jìn)AT序列存在類型Table 3 Types of MAT sequence in different I.cicadae strains

2.5 MAT序列聚類和結(jié)構(gòu)特性

對(duì)21個(gè)菌株的1MAT1-1-1序列、87個(gè)菌株的gaoMAT1-2-1序列分別進(jìn)行聚類分析(圖4)，21個(gè)1MAT1-1-1與蟬花已知序列(GenBank：KP749925.1)聚為一枝，支持率99%；87個(gè)gaoMAT1-2-1與蟬花已知序列(GenBank：KP749926.1)聚為一枝，支持率98%。安徽來(lái)源的多株蟬棒束孢未單獨(dú)聚類成群，可見相同來(lái)源蟬棒束孢菌株間無(wú)明顯地域居群分布相關(guān)性，與參比菌種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其中親緣關(guān)系較近的參考菌種是細(xì)腳棒束孢(Isariatenuipes)。

序列比對(duì)結(jié)果(圖4C)顯示，1MAT1-1-1為蟬花MAT1-1-1(KP749925.1)的一部分外顯子序列，2MAT1-1-1為NCBI 上現(xiàn)有3個(gè)獨(dú)立蟬花基因組(GenBank：ASM296887v1、ASM1021170v1和ASM164478v1)的部分基因序列，在3個(gè)蟬花基因組僅有2MAT1-1-1和gaoMAT1-2-1序列，未發(fā)現(xiàn)1MAT1-1-1。2MAT1-1-1與1MAT1-1-1僅有30%序列覆蓋(覆蓋區(qū)域相似性99.69%)，推測(cè)缺失HMG ɑ-box的2MAT1-1-1無(wú)功能。

注：A為MAT1-1-1序列聚類分析，B為gaoMAT1-2-1序列聚類分析，C為MAT 1-1-1序列結(jié)構(gòu)示意圖；方框?yàn)橥怙@子，橫線為內(nèi)含子或居間序列。Note:A:Cluster analysis of MAT1-1-1;B:Cluster analysis of gaoMAT1-2-1;C:Structure diagram of MAT1-1-1;Box:Exon;Horizontal line:Intron or intermediate sequence.圖4 蟬棒束孢M(jìn)AT序列進(jìn)化樹和MAT1-1-1序列結(jié)構(gòu)Fig.4 MAT sequence cladogram of I. cicadae.and MAT1-1-1 sequence structure

3 討論

蟬花在食品和臨床等領(lǐng)域有較廣泛的應(yīng)用，但至今其有性型仍存爭(zhēng)議[7-8]，現(xiàn)有中醫(yī)藥典籍《中藥大辭典》和《中華本草》等著作中記載的蟬花有性型更是被上述報(bào)道推翻。出現(xiàn)以上現(xiàn)狀的主要原因是蟬花有性型非常稀缺，難以采集也無(wú)法人工培養(yǎng)，至今對(duì)蟬花的有性生殖知之甚少。

圍繞蟬花的交配型基因研究，高揚(yáng)等[18]將采自安徽各地的40株蟬棒束孢分成了2組，分別含有交配型MAT1-1-1和MAT1-2-1序列，比例接近1∶2，且未發(fā)現(xiàn)同時(shí)含有2種交配型基因或缺少2種基因的菌株。本研究的靶標(biāo)序列1MAT1-1-1是根據(jù)高揚(yáng)等[18]發(fā)表的蟬花MAT1-1-1序列(GenBank：KP749925.1)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增的部分序列(163～1 334 bp)，靶標(biāo)序列2MAT1-1-1是利用MAT1-1-1在NCBI 與蟬花基因組blastn〔database：whole-genome shotgun contigs(wgs)；organism：cordyceps cicadae〕，根據(jù)獲得的最高相似序列及其上下游序列(GenBank：WJIA01000209)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增分析。

通過檢測(cè)安徽省6地市59個(gè)蟬花標(biāo)本分離的蟬棒束孢菌株發(fā)現(xiàn)，AHXH2、AHXC3和AHXC9同時(shí)含有MAT1-1-1(即1MAT1-1-1)和MAT1-2-1(即gaoMAT1-2-1)序列；來(lái)自其他6省市的41個(gè)蟬花標(biāo)本分離的菌株中檢測(cè)到5個(gè)菌株同時(shí)含有以上2個(gè)交配型基因序列，檢出率為8%；其他菌株僅含其中1個(gè)交配型基因，也未發(fā)現(xiàn)完全缺失的菌株。全部1MAT1-1-1與gaoMAT1-2-1的比例為24.14%(接近1∶4)，兼有菌株、單1MAT1-1-1菌株、單gaoMAT1-2-1菌株的比例為1∶1.625∶9.875(接近1∶1.5∶10)，可見不同交配型分布的比例不對(duì)等，對(duì)稀少的蟲草來(lái)說，其有性生殖變得更加困難。

LU等[23]對(duì)蟬花BA-001菌株的基因組(GenBank:AEIW00000000)分析發(fā)現(xiàn)，蟬棒束孢M(jìn)AT1-2和1個(gè)缺少HMG ɑ-box截短的MAT1-1-1同時(shí)存在，在各時(shí)期轉(zhuǎn)錄組中該截短基因不表達(dá)，并且通過單基因或雙基因敲除MAT1-2和MAT1-1-1對(duì)無(wú)性型孢梗束的形成無(wú)影響。另外，這種截短現(xiàn)象也發(fā)生在植物病原Grosmanniaspp.[24]、甲蟲相關(guān)真菌Leptographiumprocerum和L.profanum[25]中。本研究從100份蟬棒束孢I.cicadae菌株中也檢測(cè)到此段截短的MAT1-1-1(即2MAT1-1-1)，發(fā)現(xiàn)有1MAT1-1-1(包括兼有g(shù)aoMAT1-2-1)的菌株卻無(wú)2MAT1-1-1，2MAT1-1-1常與gaoMAT1-2-1共存，這與上述報(bào)道以及NCBI 上現(xiàn)有3個(gè)獨(dú)立的蟬花基因組(GenBank：ASM296887v1、ASM1021170v1和ASM164478v1)序列一致，但福建產(chǎn)FJDH7和FJDH9菌株含有1MAT1-1-1、2MAT1-1-1和gaoMAT1-2-1序列，暗示蟬花交配型基因在進(jìn)化過程中有著復(fù)雜的表現(xiàn)形態(tài)，似乎蟬棒束孢同時(shí)存在同宗配合和異宗配合的潛力，處于特殊的進(jìn)化階段。對(duì)于同宗配合和異宗配合的進(jìn)化，早期認(rèn)為兩者為共同起源，即MAT基因?yàn)槿旧w上同一DNA保守區(qū)，該區(qū)發(fā)生突變，導(dǎo)致不同交配方式產(chǎn)生，后又有研究支持子囊菌中的異宗配合起源于同宗配合[26-27]。因此，蟬花可能成為研究交配型基因進(jìn)化的重要樣本。

通過聚類分析未發(fā)現(xiàn)MAT基因的地域分布相關(guān)性特征，這可能與各菌株間缺乏基因交流，主要采用無(wú)性生殖有關(guān)。推測(cè)蟬花為了充分適應(yīng)生存環(huán)境，可能通過某種未知的機(jī)理，抑制或中斷了有性生殖途徑，逐漸將無(wú)性生殖方式保留。

4 結(jié)論

從7省12市100份蟬花標(biāo)本中分離出蟬棒束孢菌株，對(duì)各菌株的MAT基因分析發(fā)現(xiàn)，有的菌株僅有1MAT1-1-1或MAT1-2-1，兼有菌株占8%。此外還發(fā)現(xiàn)，截短的MAT1-1-1(即2MAT1-1-1)普遍不與1MAT1-1-1共存，常與MAT1-2-1伴存，但FJDH7和FJDH9菌株卻同時(shí)存在1MAT1-1-1、2MAT1-1-1和MAT1-2-1序列，可見群體中不同蟬棒束孢菌株的MAT基因有4種可能：?jiǎn)?MAT1-1-1、兼有MAT1-2-1和1MAT1-1-1、兼有MAT1-2-1和2MAT1-1-1、共有1MAT1-1-1/MAT1-2-1/2MAT1-1-1序列，給蟬花有性生殖帶來(lái)不確定性。推測(cè)蟬花有性型稀缺與MAT基因的分布模式多樣及比例失衡有密切關(guān)系。