曹新芳 鄭雪莉王洪永 蔣本模卜書海

(西北農(nóng)林科技大學，陜西·楊凌，712100)(鳳縣逢春濟民養(yǎng)殖有限公司)(西北農(nóng)林科技大學)

林麝(Moschusberezovskii)是我國一級保護動物和東亞特產(chǎn)經(jīng)濟動物，以雄麝香囊腺所產(chǎn)的分泌物——麝香而聞名。20世紀60年代，非法偷獵和棲息地喪失導致麝資源急劇下降，野生麝數(shù)量減少到歷史的3%～5%[1]。為保護麝資源和實現(xiàn)麝香的可持續(xù)利用，我國開始提倡人工養(yǎng)麝，但該種群數(shù)量增長緩慢，長期處于飼養(yǎng)規(guī)模較小的境況[2]。近十幾年來，隨著活體取香、疾病防治和飼養(yǎng)管理等技術(shù)的深入研究，以及醫(yī)藥企業(yè)和個體養(yǎng)殖戶的加入，麝養(yǎng)殖種群得到快速增長[3]。目前，我國林麝養(yǎng)殖數(shù)量約3萬只，其中陜西省占70%以上[4-5]。盡管如此，天然麝香產(chǎn)量仍不能滿足市場需求，擴大林麝養(yǎng)殖規(guī)模依然迫切。

我國林麝養(yǎng)殖奠基種群數(shù)量小，種源調(diào)配缺乏管理，個體間隨機交配造成該種群存在近親繁殖趨勢[3，6]，顯著影響了幼體的存活率，導致種群某些等位基因頻率下降甚至消失[7]。遺傳多樣性是防止種群退化、保持種群持續(xù)增長潛力的關(guān)鍵因素[8]；分子標記輔助育種能夠有效抑制近交衰退，快速建立優(yōu)異種群[9]。因此，評估圈養(yǎng)群體遺傳多樣性，進一步篩選優(yōu)良種質(zhì)，對抑制種群遺傳退化、利用和保護優(yōu)異種質(zhì)資源起支撐作用。

微衛(wèi)星標記是目前動物遺傳育種中應用最多的一種分子標記方法，在家畜、魚類和鹿科動物中均得到了廣泛應用[10]，但多集中在遺傳多樣性評估、親緣關(guān)系鑒定等，在優(yōu)異種質(zhì)篩選方面的研究較少。牛麗莉[11]初步提出了微衛(wèi)星標記構(gòu)建畜禽核心種質(zhì)的方法；魯翠云等[9]利用微衛(wèi)星分子標記對鏡鯉群體進行選育。本研究擬利用12對高度多態(tài)性的微衛(wèi)星引物對陜西圈養(yǎng)林麝的遺傳多樣性進行評估，根據(jù)等位基因最大化留樣原則，運用逐步聚類法構(gòu)建核心種質(zhì)，旨在為現(xiàn)有林麝資源保護、繁育管理以及優(yōu)質(zhì)麝香資源利用提供優(yōu)異的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

成年雄麝的毛發(fā)樣本分別采自陜西省鎮(zhèn)坪逢春養(yǎng)殖場(52份)、鳳縣養(yǎng)殖場(102份)和鳳縣麻省溝農(nóng)戶(12份)，種源分別起源于巴山和秦嶺山脈；由于母麝處于孕期，為避免應激反應和配合麝場管理要求，僅在鳳縣養(yǎng)殖場采集了64份樣品。采集帶有毛囊的毛發(fā)樣品，裝進紫外滅菌的自封袋冰盒保存，帶回實驗室置于冰箱中-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 微衛(wèi)星分子標記

采用PCR儀法提取林麝基因組DNA[12]，PCR體系包含100 μL Hair Buffer Stock和1 μL蛋白酶K(20 mg/mL)；反應程序為58 ℃ 30 min，75 ℃ 15 min，4 ℃ 5 min。采用質(zhì)量分數(shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性。

選用12對具有高度多態(tài)性的微衛(wèi)星引物(見表1)，其中11對由本實驗室通過Rad-seq和近緣物種擴增所開發(fā)，另1對(Mb40)來自Zhao et al.[13]的研究，所有引物由北京擎科生物公司合成。PCR-SSR擴增體系20 μL：Taq酶10 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 8 μL。擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。6%非變性聚丙烯酰胺凝膠分離擴增產(chǎn)物，110 V電壓下電泳60 min，1%硝酸銀染色，顯色、洗凈后拍照統(tǒng)計條帶。

表1 12對微衛(wèi)星引物信息

1.3 數(shù)據(jù)分析

Gel-Pro analyzer分析電泳條帶的相對分子質(zhì)量，同一位點上擴增出的條帶從小到大依次按A到Z標記。應用PopGene1.32計算遺傳多樣性參數(shù)，包括等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、近交系數(shù)(Fis)；PIC-CALC計算多態(tài)信息含量(PIC)。在Excel中將電泳圖譜數(shù)據(jù)整理為[0,1]矩陣(0代表無帶，1代表有帶)，利用NTsys2.1軟件中的SM相似系數(shù)計算遺傳相似系數(shù)；運用MEGAX軟件通過UPGMA法繪制聚類圖，并在工具欄對圖片進行簡單美化。

1.4 核心種質(zhì)的構(gòu)建與評價

根據(jù)等位基因數(shù)最大化法則留樣，通過逐步聚類法進行核心種質(zhì)篩選。從聚類分析圖最低水平的分支中選擇等位基因數(shù)目最多的個體，若兩個個體等位基因數(shù)相同，則隨機選取，若只有一個個體直接進入下輪篩選。PopGene1.32計算篩選種質(zhì)的遺傳多樣性參數(shù)，并利用SPSS21軟件對核心種質(zhì)和原始種質(zhì)的Na、I、H和He共4個遺傳參數(shù)及進行t檢驗；GenAlEx 6.503軟件對原始和核心種質(zhì)進行PCA分析，確認篩選的核心種質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 林麝群體遺傳多樣性

由表2可知，12對SSR引物對230份林麝樣本共擴增出145個等位基因(Na)，平均每個位點12.083 3個，各位點的有效等位基因數(shù)(Ne)范圍為4.573 1(MaI02)～8.995 8(Mb40)；Shannon’s信息指數(shù)(I)范圍為1.744 4(MaI02)～2.379 7(Mb40)；觀測雜合度(Ho)為0.097 3(MaI32)～0.615 4(Mber40G)，期望雜合度(He)為0.783 2(MaI02)～0.890 8(Mb40)；多態(tài)信息含量(PIC)為0.750 4(MaI02)～0.878 9(Mb40)，每個位點均具有高度多態(tài)性(PIC>0.5)。

由表3可知，按性別將林麝種群分為兩個群體來看，雄麝群體的Na、Ne、I、Ho、He和PIC值均高于雌麝群體，表明其種群具有較高的遺傳多樣性。兩個群體的觀測雜合度均低于期望值，且近交系數(shù)(雄麝0.596 0；雌麝0.598 8)較高，表明該種群均存在一定程度的近親繁殖趨勢。

表2 林麝12個SSR位點的遺傳多樣性參數(shù)

表3 雄麝和雌麝群體遺傳多樣性參數(shù)

2.2 核心種質(zhì)資源的構(gòu)建

由圖1可知，林麝原始種質(zhì)僅有1只雄麝獨自聚為一支，其余以2～20個個體聚為大小不同的37個分支；有5只雌麝分別聚為一支，其余以2～7個個體聚為大小不同的16支。雄麝存在不同地理來源的林麝樣本被聚為一支的情況，表明該種群存在基因滲透現(xiàn)象。

由表4、表5可知，根據(jù)聚類結(jié)果，采用逐步聚類等位基因最大化取樣法對雄麝和雌麝種群分別進行了三輪篩選，第一輪篩選得到105份雄麝種質(zhì)和40份雌麝種質(zhì)，分別占原始種質(zhì)的63.25%和62.50%；第二輪分別為67份和25份，各占原始種質(zhì)的40.36%和39.06%；第三輪分別為43份和18份，各占原始的25.9%和28.13%。

由于私有等位基因在生產(chǎn)繁殖過程中極易出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的丟失，應使攜帶私有等位基因的13只個體全部參與繁殖，在第三次壓縮得到的群體中加入未參與的含私有等位基因個體，最終成功構(gòu)建出核心種質(zhì)(雄麝：47份，雌麝：23份)。核心種質(zhì)的遺傳多樣性分析顯示，雄麝遺傳多樣性參數(shù)保留率達到了95%以上，且產(chǎn)優(yōu)質(zhì)麝香的個體占比從原始種質(zhì)的44.81%提高到了55.56%；雌麝遺傳參數(shù)保留率達到了86%以上，表明篩選出的核心種質(zhì)保留了較高的遺傳多樣性。

QL為秦嶺種群；BS為巴山種群。

表4 不同壓縮群體遺傳多樣性

表5 含私有等位基因的林麝個體

2.3 核心種質(zhì)的評價與確認

由表6可知，原始種質(zhì)和核心種質(zhì)的4項遺傳參數(shù)t檢驗結(jié)果顯示，雄麝核心種質(zhì)的等位基因數(shù)(Na)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)和期望雜合度(He)在P=0.05水平上與原始種質(zhì)均無顯著差異；雌麝核心種質(zhì)的I、H和He與原始種質(zhì)無顯著差異(P>0.05)。關(guān)鍵的遺傳多樣性指標(I、H)無較大變化，表明構(gòu)建的核心種質(zhì)能夠以最小數(shù)量保留原始種質(zhì)的遺傳信息，具有較好的代表性。

由圖2可知，林麝原始種質(zhì)和核心種質(zhì)的主成分二維分布顯示原始種質(zhì)中樣本分布較為密集；而核心種質(zhì)明顯降低了原始分布的緊密度，分布形式也與原始種質(zhì)較為相似且覆蓋均勻，能夠代表原始群體在主成分中的幾何分布，表明篩選出的核心種質(zhì)剔除了遺傳冗余，并較好保留了原有的遺傳信息。

表6 原始種質(zhì)和核心種質(zhì)的遺傳參數(shù)t檢驗

統(tǒng)計量Nei’s遺傳多樣性指數(shù)雄麝原始種質(zhì)雄麝核心種質(zhì)雌麝原始種質(zhì)雌麝核心種質(zhì)期望雜合度雄麝原始種質(zhì)雄麝核心種質(zhì)雌麝原始種質(zhì)雌麝核心種質(zhì)平均值0.84130.84460.82160.80790.84400.85390.82870.8260標準差0.03740.03220.04300.06170.03570.03250.04330.0631標準誤0.01080.00930.01240.01780.01080.00940.01250.0182t值-0.7111.582-2.1370.306p值0.4920.1420.0560.765

保留種質(zhì)是指原始種質(zhì)去掉核心種質(zhì)后剩余的部分，可作為備選種質(zhì)資源，核心種質(zhì)缺失時可從中尋找替代樣本。由表7可知，保留種質(zhì)的遺傳參數(shù)Ne、I、H和He均低于核心種質(zhì)，表明篩選到的核心種質(zhì)去除了遺傳多樣性較低的樣本，以少量樣本較好的代表了原始種質(zhì)的遺傳多樣性。雌麝核心種質(zhì)的Na小于保留種質(zhì)，可能是由于取樣比例小，導致了少量等位基因被剔除。

3 結(jié)論與討論

3.1 林麝群體遺傳多樣性評估

本研究利用12對SSR引物對230份林麝資源進行遺傳多樣性檢測，各位點等位基因數(shù)范圍為10～16個。有研究表明SSR標記檢測群體遺傳多樣性時，要求樣本最好在50份以上[14]，各位點的等位基因數(shù)至少為4個[15]，本研究符合檢測要求。多態(tài)信息含量(PIC)是衡量基因變異程度的指標，當PIC>0.5時，該基因座具有高多態(tài)性[16]，當PIC>0.7時，該位點可作為最理想的標記[17]。本實驗中各SSR位點的PIC值為0.750 4～0.878 9，均大于0.7，表明選用的12個位點可作為檢測林麝群體遺傳多樣性的理想標記，收集的圈養(yǎng)林麝資源有著高度信息量。

a為雄麝原始種質(zhì)，b為雌麝原始種質(zhì)，c為雄麝核心種質(zhì)，d為雌麝核心種質(zhì)，PC1、PC2分別表示第一、第二主成分。

表7 核心種質(zhì)和保留種質(zhì)遺傳多樣性參數(shù)

群體雜合度即基因多樣度，可作為群體遺傳變異的檢測指標[18]。平均雜合度高，表明群體遺傳變異豐富。本研究中，林麝群體平均期望雜合度(He)為0.845 9，高于麋鹿(He為0.46～0.54)、梅花鹿(He為0.601 8)和藏羚羊(He為0.83 8)等瀕危獸類[19-21]；同時也高于王豆等[22]對圈養(yǎng)林麝的研究結(jié)果(He為0.830 2)，表明本研究收集到的林麝資源具有豐富的遺傳多樣性。這是因為陜西秦巴山區(qū)是野生林麝的核心分布區(qū)[23]，且陜西是最早開始林麝養(yǎng)殖的省份之一，前期野生種源能夠得到充分補充。而平均觀測雜合度(Ho)為0.337 8，低于期望雜合度，且明顯低于四川圈養(yǎng)林麝(Ho為0.552)和野生林麝(Ho為0.74)的期望雜合度[24-25]，表明群體內(nèi)存在近交現(xiàn)象，說明當前的“輪配繁育管理系統(tǒng)”(BMS-RM)難以準確記錄林麝遺傳譜系[26]，致使圈養(yǎng)林麝群體遺傳多樣性存在降低的風險。

3.2 核心種質(zhì)的構(gòu)建

核心種質(zhì)是通過科學的方法篩選出種質(zhì)資源的一部分，能夠以最少數(shù)量和遺傳重復代表整體資源的遺傳多樣性。通常依據(jù)具體群體選擇原始資源的10%～30%[27]，一般遺傳多樣性較低或種群數(shù)量大的群體，取樣比例相對較小。在核心種質(zhì)構(gòu)建中等位基因數(shù)目最大化取樣策略最具優(yōu)勢，能夠篩選到遺傳多樣性最為豐富的種質(zhì)資源，滿足遺傳學要求[28]。本研究中以等位基因數(shù)最大為篩選依據(jù)，對原始種質(zhì)進行了三輪逐步聚類，得到雄麝25.90%和雌麝28.13%的壓縮種質(zhì)集。私有等位基因(在單個群體中出現(xiàn)的特有等位基因)可作為衡量遺傳多樣性的參數(shù)[29]，在生產(chǎn)繁殖過程中極易丟失，造成遺傳資源損失。Li et al.[30]和Huang et al.[31]的研究已經(jīng)分別將保護私有等位基因、防止其丟失作為圈養(yǎng)大熊貓和圈養(yǎng)林麝的養(yǎng)殖管理的策略之一。因此，本研究將攜帶私有等位基因個體全部加入選育，得到47份雄麝核心種質(zhì)和23份雌麝核心種質(zhì)。

3.3 核心種質(zhì)的評價

以分子標記手段構(gòu)建的核心種質(zhì)通常借助遺傳多樣性參數(shù)進行評價，主要參數(shù)包括等位基因數(shù)、雜合度、Shannon’s信息指數(shù)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)等[11，32]。核心種質(zhì)是否具有代表性，需要對原始和核心群體的遺傳參數(shù)進行t檢驗，并結(jié)合PCA圖中樣本分布的相似性進一步確認核心種質(zhì)。本研究通過Shannon’s信息指數(shù)(I)、Nei’s多樣性指數(shù)(H)這2項重要遺傳參數(shù)的t檢驗確定了核心種質(zhì)的代表性(P>0.05)。保留率是用來檢測核心種質(zhì)中是否保留了足夠多的遺傳變異，是核心種質(zhì)實用性檢驗的重要參數(shù)[33]。本研究中雄麝種質(zhì)的Na、I、H、Ho和He等5項遺傳參數(shù)的保留率為84.08%～101.16%，雌麝為86.78%～98.33%。構(gòu)建核心種質(zhì)的等位基因保留率需大于70%，其他遺傳參數(shù)越高越好的標準[34]，表明本研究構(gòu)建的林麝核心種質(zhì)能夠較好地保留原始的遺傳多樣性。各別遺傳參數(shù)的保留率出現(xiàn)大于100%的情況，可能是去遺傳冗余過程中各種等位基因頻率不規(guī)律增減所導致。

收益是衡量養(yǎng)殖過程中動物生產(chǎn)力的重要指標，通過對目標經(jīng)濟性狀進行選育，可以提高群體中有利基因的頻率[35]。麝香是雄性林麝育種的重要經(jīng)濟性狀，生產(chǎn)香味濃郁、黑色或棕褐色顆粒狀的優(yōu)質(zhì)麝香是飼養(yǎng)企業(yè)最為關(guān)心的目標。本研究將產(chǎn)優(yōu)質(zhì)麝香個體比例作為核心種質(zhì)選育成功重要評價指標，結(jié)果顯示產(chǎn)優(yōu)質(zhì)麝香個體比例原始群體44.81%提高到55.56%，基本達到核心種質(zhì)篩選目標。

綜上所述，本研究通過逐步聚類法分別構(gòu)建了雄、雌麝核心種質(zhì)，初步為防止優(yōu)異基因和種質(zhì)的丟失，同時也為陜西圈養(yǎng)林麝進一步種質(zhì)改良提供優(yōu)質(zhì)種源。核心種質(zhì)處于一個不斷變化的動態(tài)過程，可以在不夠完善的數(shù)據(jù)中盡可能選取具有代表性的樣本，再隨著后續(xù)研究的深入逐漸補充和完善缺乏的數(shù)據(jù)。在今后林麝核心種質(zhì)構(gòu)建工作中，隨著管理規(guī)范、家系清楚，以及雌麝的產(chǎn)仔數(shù)、幼仔存活率等指標的加入，以期得到更為全面的核心種質(zhì)群，為林麝資源保護、繁育管理提供參考依據(jù)。