張一凡 劉萍
冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是多種心血管疾病的共同病理基礎(chǔ)[1]。近些年研究人員逐漸聚焦到胞葬作用及其在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用[2],胞葬作用通過(guò)吞噬細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞)及時(shí)清理凋亡細(xì)胞,促進(jìn)炎癥消退及膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn),縮小壞死核面積,增加斑塊穩(wěn)定性[3]。小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞通常被用來(lái)體外基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究,但對(duì)其胞葬作用的研究較少。
本課題組結(jié)合中醫(yī)理論和前期的臨床研究,以瓜蔞薤白半夏湯為基礎(chǔ)方,化裁得到冠心康。冠心康由黃芪、丹參、瓜蔞、薤白、半夏、益母草組成,具有益氣化痰活血之效。前期研究發(fā)現(xiàn),冠心康可以促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾臟巨噬細(xì)胞、RAW264.7細(xì)胞的胞葬作用改善動(dòng)脈粥樣硬化[4-6]。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在觀察冠心康凍干粉(以下簡(jiǎn)稱“冠心康”)對(duì)小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞小分子類(lèi)泛素修飾物特異性蛋白酶1(small ubiquitin-related modifiers /sentri-specific proteases 1,SENP1)/信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)分子表達(dá)及胞葬作用的影響,進(jìn)一步探討冠心康治療動(dòng)脈粥樣硬化的分子機(jī)制。
雄性C57BL/6J小鼠6只,6周齡,體質(zhì)量為18~23 g,購(gòu)于江蘇集萃藥康生物科技有限公司。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(蘇)2018-0008,動(dòng)物合格證號(hào):202000150。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理號(hào):2019-N002)。
RIPA裂解液(批號(hào):P0013B)、BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào):P0010)、SDS-PAGE電泳試劑(批號(hào):103019200702)、中性紅細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(批號(hào):030521210525),巨噬細(xì)胞集落刺激因子(批號(hào):100421211007),均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司; STAT3、P-STAT3、GAPDH抗體(貨號(hào):34、12、7),購(gòu)自美國(guó)CST公司;TAM酪氨酸激酶受體(TYRO3/AXL/MER receptor tyrosine kinase)、血小板反應(yīng)蛋白-1(Thrombospondin 1,THBS1)、乳脂球表皮生長(zhǎng)因子8(milk fat globule-epidermal growth factor,MFGE8)抗體(批號(hào):GR284192-5、GR220083-6、GR153845-2、GR3304513-1),均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;SENP1抗體(批號(hào):K0817),購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司;引物(批號(hào):111359735)由上海閃晶分子生物科技有限公司合成;氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL,批號(hào):H3011720),購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。
高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)5810R,德國(guó) Eppendorf 公司);StepOne Plus 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)7500,美國(guó) ABI 公司);酶標(biāo)儀(型號(hào)SynergyH4,美國(guó)BioTek公司);凝膠成像儀(型號(hào)731BR02744)、蛋白電泳儀(型號(hào)552BR 225015),均購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司;顯微鏡(型號(hào)403497,日本尼康公司)。
冠心康(黃芪30 g、全瓜蔞15 g、薤白12 g、制半夏12 g、益母草30 g、丹參12 g),由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房提供。將全部草藥放入煎藥容器煎煮2次;藥液放冷后無(wú)菌紗布過(guò)濾3次,利用旋蒸儀,將中藥水煎液濃縮至 1 g/mL,置于-80℃冰箱過(guò)夜;次日使用冷凍干燥機(jī)制備冠心康凍干粉。DMEM培養(yǎng)基溶解凍干粉,超聲混勻過(guò)夜,混勻溶液用0.22 μm濾器過(guò)濾除菌,配制成50 μg /mL原液,實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋至所需濃度。
選取SPF級(jí)小鼠,腹腔麻醉后采用脊椎脫臼法處死小鼠,在75%乙醇中浸泡5分鐘,用剪刀分離雙腿,剔除腿部肌肉組織及其他軟組織,暴露出完整的股骨及脛骨;浸入75%乙醇中 5分鐘,預(yù)冷無(wú)菌 PBS 5分鐘;在關(guān)節(jié)處剪斷腿骨;用無(wú)血清的 DMEM 培養(yǎng)基沖洗腿骨,將骨髓沖洗液加入到離心管中,1 000 r/min離心 5分鐘;去上清,加入10 mL 含巨噬細(xì)胞集落刺激因子(10 μg/L)和含10%血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸,然后分裝到細(xì)胞培養(yǎng)皿中,置于 37 ℃, 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
選取上述細(xì)胞,用ox-LDL 40 μg/mL誘導(dǎo)6小時(shí),并分別給予含有冠心康凍干粉低、中、高劑量(1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL)的培養(yǎng)基,分為對(duì)照組、模型組、冠心康低劑量組、冠心康中劑量組、冠心康高劑量組。提取細(xì)胞樣本做后續(xù)檢測(cè),每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
在 24 孔板中,加入濃度為 1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,培養(yǎng)。24小時(shí)后,棄上清,4%多聚甲醛固定10分鐘,0.1% Triton-X-100通透細(xì)胞15分鐘。含5% BSA 的0.2% PBST封閉細(xì)胞1小時(shí)。以一抗F4/80(1∶100)4 ℃ 孵育過(guò)夜,二抗(1∶1 000)室溫避光孵育 1小時(shí)。DAPI染核1分鐘,避光。在倒置相差熒光顯微鏡觀察拍照。
在96孔板中,加入濃度為3×104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液100 μL,培養(yǎng)24小時(shí);PBS洗3次,分別加入完全培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基+ox-LDL、完全培養(yǎng)基+ox-LDL+低、中、高劑量冠心康,培養(yǎng)24小時(shí);PBS 洗3次,每孔加入20 μL中性紅染色液+200 μL培養(yǎng)基,孵育2小時(shí);去除含有中性紅染色液的細(xì)胞培養(yǎng)液,用PBS洗3次,加入200μL中性紅檢測(cè)裂解液,室溫?fù)u床上裂解10分鐘。測(cè)定540 nm處OD值。
采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)測(cè)定AXL、MERTK、TYRO3、THBS1 mRNA表達(dá),按照Trizol法提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA選用ABI逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。在StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。采用2-△△Ct法分析結(jié)果,計(jì)算目的基因在各組的相對(duì)表達(dá)量。引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成。
表1 qRT-PCR引物序列
加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白。采用 BCA 法進(jìn)行蛋白定量。蛋白樣品上樣至聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離,電轉(zhuǎn)至 PVDF膜。封閉1小時(shí)后,分別以一抗(1∶1 000)4℃ 孵育過(guò)夜,二抗(1∶5 000)室溫孵育1小時(shí)。電化學(xué)法顯影后,采集條帶并進(jìn)行灰度分析。
免疫熒光檢測(cè)巨噬細(xì)胞的純度,巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物 F4/80表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)到 99%,表明小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞培養(yǎng)成功。見(jiàn)圖1。
運(yùn)用中性紅法檢測(cè)細(xì)胞吞噬率。與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞吞噬率降低(P<0.05);給予不同劑量的冠心康干預(yù)后,細(xì)胞吞噬率升高(P<0.05),表明冠心康增強(qiáng)了小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞的吞噬功能。見(jiàn)表2。
表2 冠心康對(duì)骨髓源巨噬細(xì)胞吞噬率的影響
運(yùn)用qRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞胞葬相關(guān)分子mRNA表達(dá)。與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞AXL、MERTK、TYRO3、THBS1的mRNA表達(dá)降低(P<0.05);給予不同劑量的冠心康干預(yù)后,冠心康高劑量組AXL的mRNA表達(dá)升高(P<0.05),冠心康中劑量組TYRO3的mRNA表達(dá)升高(P<0.05),冠心康中、高劑量組MERTK、THBS1的mRNA表達(dá)升高(P<0.05),表明冠心康促進(jìn)小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞胞葬相關(guān)分子mRNA表達(dá)。見(jiàn)表3。
表3 冠心康對(duì)骨髓源巨噬細(xì)胞胞葬相關(guān)分子mRNA表達(dá)的影響
運(yùn)用Western Blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞胞葬相關(guān)分子蛋白表達(dá)。與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞AXL、MERTK、TYRO3、THBS1、MFGE8 蛋白表達(dá)降低(P<0.05);給予冠心康干預(yù)后,冠心康低、中、高劑量組AXL、MERTK、TYRO3蛋白表達(dá)升高(P<0.05),冠心康中、高劑量組THBS1、MFGE8y蛋白表達(dá)升高(P<0.05),表明冠心康促進(jìn)小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞胞葬相關(guān)分子蛋白表達(dá)。見(jiàn)圖2、表4。
注:A 對(duì)照組;B 模型組;C 冠心康低劑量組;D 冠心康中劑量組;E 冠心康高劑量組
表4 冠心康對(duì)骨髓源巨噬細(xì)胞胞葬相關(guān)分子蛋白表達(dá)的影響
與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞SENP1、p-STAT3蛋白表達(dá)降低(P<0.05);給予冠心康干預(yù)后,冠心康低、中、高劑量組SENP1蛋白表達(dá)升高(P<0.05),冠心康中、高劑量組 p-STAT3蛋白表達(dá)升高(P<0.05),表明冠心康促進(jìn)SENP1/p-STAT3分子表達(dá)。見(jiàn)圖3、表5。
注:A 對(duì)照組;B 模型組;C 冠心康低劑量組;D 冠心康中劑量組;E 冠心康高劑量組
表5 冠心康對(duì)骨髓源巨噬細(xì)胞SENP1/p-STAT3蛋白表達(dá)的影響
冠狀動(dòng)脈粥樣硬化屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹心痛”“脈痹”等范疇。葉天士《臨證指南醫(yī)案》曰:“痹者……皆由氣血虧損,腠理疏豁,風(fēng)寒濕三氣得以乘虛外襲,留滯于內(nèi)以致濕痰、濁血流注凝澀而得之?!北咀C為本虛標(biāo)實(shí)之證,脾腎兩虛,氣虛導(dǎo)致痰濁、血瘀內(nèi)生,痰瘀互結(jié),痹阻脈絡(luò),發(fā)為痹癥[8]。因此在治療上需要健脾益氣、化痰祛瘀的治法[9]。本課題組結(jié)合動(dòng)脈粥樣硬化氣虛痰瘀的中醫(yī)病機(jī)和前期的臨床研究,以瓜蔞薤白半夏湯為基礎(chǔ)方臨證化裁為黃芪、丹參、瓜蔞、薤白、半夏、益母草,組成冠心康。全方以黃芪為君藥,補(bǔ)氣虛治本,其主要活性成分黃芪多糖能提高巨噬細(xì)胞吞噬活性[10];瓜蔞、丹參為臣藥,化痰活血,其中丹參多種活性成分如丹酚酸B、丹參酮IIA,對(duì)胞葬作用均有調(diào)控作用[11];薤白、半夏、益母草為佐藥,助臣藥化痰活血之力。全方具有益氣活血、化痰降濁之效。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[4-6],冠心康有效改善小鼠動(dòng)脈粥樣硬化,上調(diào)THBS1和TAM受體蛋白,促進(jìn)胞葬作用,但冠心康調(diào)控胞葬作用的機(jī)制尚不完善。
有效的胞葬作用能防止凋亡細(xì)胞發(fā)生繼發(fā)性壞死以及釋放炎性因子,減緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[12]。胞葬作用的有效完成需要多種分子協(xié)同配合,如“尋我”信號(hào)分子、“食我”信號(hào)分子、橋接分子等。TAM酪氨酸激酶受體家族作為 “食我”受體,包括TYRO3、AXL和MERTK。當(dāng)MERTK缺失會(huì)加重小鼠炎癥,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[13];TYRO3和MERTK的變異與頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生關(guān)系密切[14]。THBS1、MFGE8均是橋接分子,負(fù)責(zé)結(jié)合凋亡細(xì)胞“食我”信號(hào)分子與巨噬細(xì)胞的吞噬受體。研究發(fā)現(xiàn),骨髓源性細(xì)胞中缺乏MFGE8會(huì)增加斑塊中凋亡細(xì)胞的積累[15]。在晚期動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型中,MFGE8、MERTK等多種胞葬相關(guān)分子發(fā)揮重要作用清除斑塊中凋亡細(xì)胞[16]。
SENP1是一種半胱氨酸特異的蛋白酶,是SENP家族酶活性較強(qiáng)且最為經(jīng)典的成員,可以調(diào)控血管生成、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等[17]。研究發(fā)現(xiàn),SENP1+/-小鼠冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積顯著增大[18]。STAT3是信號(hào)傳導(dǎo)活化轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員,調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成、炎癥反應(yīng)等[19]。研究發(fā)現(xiàn),SENP1可以上調(diào)STAT3的磷酸化和轉(zhuǎn)錄活性,活化的STAT3可以提高巨噬細(xì)胞的胞葬作用[20-21]。
本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞吞噬率、胞葬相關(guān)分子、SENP1、p-STAT3表達(dá)量降低;與模型組比較,冠心康干預(yù)后,細(xì)胞吞噬率、胞葬相關(guān)分子、SENP1、p-STAT3表達(dá)量升高。綜上所述,冠心康通過(guò)上調(diào)SENP1的表達(dá),促進(jìn)STAT3的磷酸化,從而增強(qiáng)骨髓源巨噬細(xì)胞的胞葬作用,但相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究為SENP1、STAT3與巨噬細(xì)胞胞葬作用的關(guān)系提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。