基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和文獻(xiàn)聚類(lèi)分析研究陽(yáng)和湯治療非小細(xì)胞肺癌作用機(jī)制

艾青華 江久 程衛(wèi)國(guó) 張妍

肺癌位居我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病首位，研究報(bào)告顯示，2015年我國(guó)新發(fā)肺癌病例約為78.7萬(wàn)例，發(fā)病率為57.26/10萬(wàn),中標(biāo)率為35.96/10萬(wàn)[1]，已成為對(duì)國(guó)民健康造成嚴(yán)重威脅的疾病之一。手術(shù)、放化療、免疫療法及中醫(yī)藥治療是目前非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的主要治療手段，盡管近年來(lái)微創(chuàng)手術(shù)、精準(zhǔn)放療、靶向治療、射頻消融治療等取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，但其總體5年生存率仍不高，約10%～20%。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞賴(lài)以生存和發(fā)展的場(chǎng)所，調(diào)控腫瘤微環(huán)境成為了腫瘤治療的重要新策略。陽(yáng)和湯出自《外科證治全生集》，具有溫陽(yáng)散寒、活血化痰和通絡(luò)散結(jié)的功效，臨床常用于治療骨結(jié)核、腫瘤、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、無(wú)菌性肌肉深部膿腫、慢性婦女乳腺小葉增生、痛經(jīng)等證屬陽(yáng)虛寒凝者。近年來(lái)廣泛應(yīng)用于腫瘤的臨床治療，臨床研究表明陽(yáng)和湯聯(lián)合放化療治療腫瘤效果優(yōu)于單純使用放化療方案，陽(yáng)和湯觀(guān)察組可顯著提高患者生存、生命質(zhì)量，減輕患者痛苦[2]。然而，其化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)和抗NSCLC的作用機(jī)理尚不明確。為進(jìn)一步探明陽(yáng)和湯(本研究結(jié)合臨床實(shí)際應(yīng)用，在原方基礎(chǔ)上加淫羊藿、枸杞，減鹿角膠)的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)和抗NSCLC的作用機(jī)理，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)聚類(lèi)分析探討陽(yáng)和湯在體內(nèi)“多成分—多靶點(diǎn)—多通路”的整體藥理作用機(jī)制，從分子水平來(lái)解析中藥復(fù)方及配伍的科學(xué)基礎(chǔ)，為中醫(yī)治療肺癌提供新思路和用藥參考。

1 材料和方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1.1 陽(yáng)和湯成分靶點(diǎn)和NSCLC靶點(diǎn)篩選 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)[3](https://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索白芥子、甘草、干姜、枸杞、麻黃、肉桂、熟地黃以及淫羊藿的化合物成分，本研究中，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類(lèi)藥性(class of drugs，DL)≥0.12的化合物被選擇用于后續(xù)研究，將納入的化合物成分通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行成分的靶點(diǎn)獲取，經(jīng)匯總刪重后，白芥子獲得6個(gè)化合物成分，74個(gè)靶點(diǎn)；甘草獲得98個(gè)化合物成分，230個(gè)靶點(diǎn)；干姜獲得11個(gè)化合物成分，102個(gè)靶點(diǎn)；枸杞獲得55個(gè)化合物成分，200個(gè)靶點(diǎn)；麻黃獲得39個(gè)化合物成分，255個(gè)靶點(diǎn)；肉桂獲得4個(gè)化合物成分，63個(gè)靶點(diǎn)；熟地黃獲得9個(gè)化合物成分，36個(gè)靶點(diǎn)；淫羊藿獲得25個(gè)化合物成分，218個(gè)靶點(diǎn)。以“non-small cell lung cancer”為關(guān)鍵詞，在GeneCards[4]數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)、 NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)[5](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行人類(lèi)基因檢索，其中GeneCards的數(shù)據(jù)將Relevance score進(jìn)行中位值的篩選以獲得更相關(guān)的靶點(diǎn)。經(jīng)檢索，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到2453條相關(guān)基因，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得1939個(gè)基因。將這2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的基因合并刪重之后，得到3132個(gè)NSCLC相關(guān)基因，隨后將篩選出的陽(yáng)和湯成分靶點(diǎn)和NSCLC靶點(diǎn)輸入韋恩圖制作軟件Venny 2.1，得到190個(gè)交集靶點(diǎn)，作為陽(yáng)和湯作用于NSCLC的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，進(jìn)行后續(xù)的蛋白—蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)構(gòu)建、基因本體論(Gene ontology，GO)分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。

1.1.2 陽(yáng)和湯治療NSCLC靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵成分篩選 為了更好地理解陽(yáng)和湯治療NSCLC 作用機(jī)制中相應(yīng)靶點(diǎn)之間的復(fù)雜關(guān)系，本研究將納入的成分、NSCLC以及作用靶點(diǎn)為基礎(chǔ)，構(gòu)建了成分—疾病—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0[6]中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖的繪制并進(jìn)行拓?fù)浞治?，將成分進(jìn)行degree的排序，將大于2倍平均度值的成分篩選出來(lái)作為關(guān)鍵成分。

1.1.3 交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和拓?fù)浞治?為闡明靶點(diǎn)蛋白在生物網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)水平的作用，將獲取的交集靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫(kù)[7](https://string-db.org/cgi/input.pl)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，將生物種類(lèi)設(shè)定為“人類(lèi)(Homo sapiens)”，可信度設(shè)置為>0.9，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。本研究將獲取的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscape 3.8.0中，通過(guò)Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治?，以自由?degree)、介數(shù)(betweenness centrality)、 平均最短路徑長(zhǎng)度(average shortest path length) 和接近中心性(closeness centrality)這四個(gè)參數(shù)為參考標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)degree排序，選取分值大于平均分的基因作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，并篩選出前20個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.1.4 MCODE聚類(lèi)分析 通過(guò)MCODE分析[8]進(jìn)行關(guān)鍵基因的篩選，將已經(jīng)構(gòu)建好的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0中，打開(kāi)MCODE模塊進(jìn)行基因簇的分析以及核心靶點(diǎn)的篩選。

1.1.5 GO富集分析和KEGG通路富集 為進(jìn)一步說(shuō)明藥物與疾病交集靶點(diǎn)在基因功能和信號(hào)通路中的作用，本研究將藥物疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 的生物過(guò)程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞組分(cell component，CC)富集，引用String 數(shù)據(jù)庫(kù)，將校正P值≤0.05的項(xiàng)目進(jìn)行篩選，使用R 3.6.3 軟件，安裝并引用clusterProfiler、enrichplot、ggplot2包，進(jìn)行柱狀圖和氣泡圖繪制。

1.1.6 陽(yáng)和湯治療NSCLC的通路和靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將陽(yáng)和湯—成分—NSCLC—通路—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0進(jìn)行通路網(wǎng)絡(luò)圖的繪制，更直觀(guān)地展示陽(yáng)和湯活性成分在治療NSCLC過(guò)程中可能的作用通路和靶點(diǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)聚類(lèi)分析

基于對(duì)陽(yáng)和湯及關(guān)鍵成分槲皮素、木犀草素、山奈酚作用于NSCLC的實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，進(jìn)一步佐證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果。

1.2.1 文獻(xiàn)來(lái)源及檢索方式 2021年6月計(jì)算機(jī)檢索PubMed、EMBASE、Science Direct、中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)、萬(wàn)方知識(shí)服務(wù)平臺(tái)、維普網(wǎng)(VIP)和中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(CBM)等數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索均從建庫(kù)截至2021年6月。中文檢索詞：陽(yáng)和湯、槲皮素、木犀草素、山奈酚、大鼠、小鼠、細(xì)胞、通路、實(shí)驗(yàn)；非小細(xì)胞肺癌、肺癌、肺腫瘤、NSCLC；英文檢索詞：Yanghe decoction、Quercetin、luteolin、Kaempherol、cell、non-small cell lung cancer、lung cancer、lung carcinoma、NSCLC。

1.2.2 文獻(xiàn)納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)陽(yáng)和湯及關(guān)鍵成分槲皮素、木犀草素、山奈酚對(duì)NSCLC作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究；(2)陽(yáng)和湯為中藥復(fù)方制劑，實(shí)驗(yàn)用直接煎煮或成分萃取均可，槲皮素、木犀草素、山奈酚實(shí)驗(yàn)成分包括天然萃取與化學(xué)合成；(3)研究類(lèi)型包括體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(in vivo)和體外實(shí)驗(yàn)(in vitro)；(4)文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)必須有但不限于作用靶點(diǎn)；(5)語(yǔ)言包括中文或英文。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)作者與內(nèi)容、數(shù)據(jù)重復(fù)文獻(xiàn)，包括期刊論文與學(xué)位論文內(nèi)容/數(shù)據(jù)相同文獻(xiàn)，中、英文研究者與研究?jī)?nèi)容、數(shù)據(jù)相同文獻(xiàn)，均只選用最新發(fā)表文獻(xiàn)1篇，其余視為重復(fù)文獻(xiàn)排除；(2)綜述類(lèi)文獻(xiàn)；(3)藥理研究、實(shí)驗(yàn)、方藥機(jī)制類(lèi)文獻(xiàn)無(wú)作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)或者實(shí)驗(yàn)結(jié)果不確定的文獻(xiàn)；(4)關(guān)于槲皮素、木犀草素、山奈酚經(jīng)修飾后的衍生物實(shí)驗(yàn)研究的文獻(xiàn)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用Noteexpress進(jìn)行文獻(xiàn)管理和初篩，然后逐篇閱讀文獻(xiàn)全文，將符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)收入，利用Microsoft Excel 2016建立數(shù)據(jù)庫(kù)，錄入文獻(xiàn)的外部特征，如：題目、作者、文獻(xiàn)發(fā)表時(shí)間、發(fā)表形式等；文獻(xiàn)內(nèi)部信息，如：實(shí)驗(yàn)類(lèi)型、實(shí)驗(yàn)藥物、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物/細(xì)胞、檢測(cè)靶點(diǎn)、靶點(diǎn)信號(hào)的上調(diào)/下調(diào)、可能的信號(hào)通路等。對(duì)于檢測(cè)靶點(diǎn)、靶點(diǎn)信號(hào)的上調(diào)/下調(diào)數(shù)據(jù)信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以文獻(xiàn)中檢測(cè)出的靶點(diǎn)頻次為數(shù)據(jù)的度值，然后形成矩陣數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Heatmap illustrator軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果以矩陣熱圖表示，對(duì)于其他類(lèi)信息采用描述性統(tǒng)計(jì)方法。

2 結(jié)果

2.1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析陽(yáng)和湯治療NSCLC的作用機(jī)制

2.1.1 藥物疾病交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)分析和拓?fù)浞治?通過(guò)前期數(shù)據(jù)挖掘和靶點(diǎn)篩選，課題組將190個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1所示，該網(wǎng)絡(luò)中有190個(gè)節(jié)點(diǎn)，832條邊，平均度值為8.76。圖中的節(jié)點(diǎn)顏色和大小根據(jù)度值調(diào)整，度值越大顏色越深，度值越大線(xiàn)越粗，從粗到細(xì)表示邊介數(shù)從大到小。拓?fù)浞治鐾ㄟ^(guò)degree排序，總共篩選出個(gè)68關(guān)鍵靶點(diǎn)，將前20個(gè)靶點(diǎn)使用R 3.6.3進(jìn)行圖片繪制，橫坐標(biāo)為每個(gè)靶點(diǎn)的度值，見(jiàn)圖2。其中度值最高的為MAPK1，其他依次為MAPK3、STAT3、Akt1、JUN等，所有的關(guān)鍵基因都在NSCLC中的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色。

圖1 關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)互作圖

圖2 拓?fù)浞治鼋Y(jié)果(前20個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn))

2.1.2 核心基因與關(guān)鍵成分 通過(guò)MCODE分析進(jìn)行關(guān)鍵基因的篩選，總共得到7個(gè)基因簇和6個(gè)核心基因，核心基因?yàn)镃YP3A4、INSR、RXRB、PLG、PGR、SCD。將成分—疾病—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 中進(jìn)行拓?fù)浞治?。將成分進(jìn)行degree的排序，將大于2倍平均度值的成分篩選出來(lái)作為關(guān)鍵成分，總共有11個(gè)關(guān)鍵成分(度中心性值越高成分越重要)，詳見(jiàn)表1。

表1 陽(yáng)和湯關(guān)鍵成分信息表

根據(jù)關(guān)鍵成分的排序賦值成分在關(guān)聯(lián)藥物中的分值，槲皮素為11，其他10種成分依次為10至1，然后統(tǒng)計(jì)關(guān)聯(lián)藥物的分值，關(guān)聯(lián)藥物及分值詳見(jiàn)圖3。除熟地黃之外，陽(yáng)和湯其余藥物均與關(guān)鍵成分關(guān)聯(lián)，其中麻黃、甘草、淫羊藿分值居前三，并顯著高于其他的關(guān)聯(lián)藥物。

圖3 陽(yáng)和湯關(guān)鍵成分與關(guān)聯(lián)藥物分值圖

2.1.3 藥物疾病交集靶點(diǎn)的GO富集與KEGG通路富集 通過(guò)GO富集分析到2405條生物過(guò)程，165項(xiàng)分子功能相關(guān)，68項(xiàng)細(xì)胞組分相關(guān)。將藥物疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，總共富集到168條信號(hào)通路，并篩選出最顯著的前20條通路繪制氣泡圖，詳見(jiàn)圖4。

圖4 KEGG通路富集氣泡圖

2.1.4 陽(yáng)和湯治療NSCLC的多成分、多靶點(diǎn)、多通路網(wǎng)絡(luò)圖 運(yùn)用Cytoscape 3.8.0進(jìn)行中藥—成分—疾病—通路—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的繪制，見(jiàn)圖5。如圖所示，紫色為中藥，藍(lán)色為化合物，黃色為中藥作用于疾病的靶點(diǎn)，綠色為最顯著的前20條通路，紅色為NSCLC，直觀(guān)地展示了陽(yáng)和湯活性成分在治療NSCLC過(guò)程中的多成分—多通路—多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。

圖5 陽(yáng)和湯治療NSCLC的中藥—成分—疾病—通路—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 基于實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)聚類(lèi)分析陽(yáng)和湯治療NSCLC的作用機(jī)制

2.2.1 納入文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)情況 本次納入研究的文獻(xiàn)共44篇，其中中文35篇、英文9篇，發(fā)表年份與篇數(shù)分別為(2005/3，2007/3，2009/1，2010/1，2012/6，2013/1，2014/3，2015/3，2016/2，2017/5，2018/5，2019/4，2020/5，2021/2)。44篇文獻(xiàn)中納入實(shí)驗(yàn)50個(gè)，其中體內(nèi)實(shí)驗(yàn)14個(gè)，體外實(shí)驗(yàn)36個(gè)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括大鼠(2)和小鼠(12)，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞系/株與實(shí)驗(yàn)次數(shù)分別為(A549/26，H460/5，H1975/3，H1299/1，HCC827/1，BEAS-2B/1)。

2.2.2 陽(yáng)和湯及關(guān)鍵成分作用于NSCLC的靶點(diǎn)聚類(lèi)分析 研究將標(biāo)準(zhǔn)化處理后的檢測(cè)靶點(diǎn)、靶點(diǎn)信號(hào)的上調(diào)/下調(diào)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Heatmap illustrator軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果以矩陣熱圖表示，其中圖6左側(cè)為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)槲皮素(Que)、木犀草素(Lut)、陽(yáng)和湯(YHD)治療NSCLC的作用靶點(diǎn)與靶點(diǎn)信號(hào)的表達(dá)，圖6右側(cè)為體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)槲皮素(Que)、木犀草素(Lut)、山奈酚(Kae)治療NSCLC的作用靶點(diǎn)與靶點(diǎn)信號(hào)的表達(dá)，紅色顯示上調(diào)，藍(lán)色顯示下調(diào)，顏色的深淺顯示度值。

圖6 陽(yáng)和湯治療NSCLC的靶點(diǎn)信號(hào)熱圖

圖6顯示促腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)的上調(diào)，如Bax/Bcl-2、p53、PTEN等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)/抑制腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)的下調(diào)，如VEGF、EGFR、Akt、Vimentin、Src等，其可能的通路幾乎覆蓋了NSCLC的主要的通路，如Src/Fn14/NF-κB、PTEN-PI3K-Akt/mTOR、EGFR/ALK、RAS-MAPK、JAK-STAT、HER3，陽(yáng)和湯的關(guān)鍵成分作用點(diǎn)有相同也有不同，具有靶點(diǎn)信號(hào)調(diào)節(jié)的互補(bǔ)和疊加效應(yīng)，充分地顯示了中藥復(fù)方多成分—多靶點(diǎn)—多通路治療腫瘤的作用機(jī)制。

3 討論

《素問(wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論篇》云：“陽(yáng)化氣，陰成形。”中醫(yī)將肺癌稱(chēng)為“肺積”，陽(yáng)虛陰結(jié)、氣血虧虛、痰瘀互結(jié)是肺癌的主要病機(jī)。陽(yáng)和湯溫陽(yáng)補(bǔ)血，散寒通滯，可起“益火之源，以消陰翳”之功，以溫消積，多聯(lián)合放化療或者靶向治療脾腎陽(yáng)虛型中晚期NSCLC。本研究發(fā)現(xiàn)陽(yáng)和湯含有多個(gè)具有一定的抗腫瘤作用的關(guān)鍵成分，如槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、異甘草素等，顯著關(guān)聯(lián)藥物為麻黃、甘草、淫羊藿，提示開(kāi)通腠理逐寒凝、溫通氣血養(yǎng)肺金是陽(yáng)和湯治療陽(yáng)虛型肺癌的主要機(jī)制。近期研究認(rèn)為槲皮素和木犀草素均能調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，均可聯(lián)合吉非替尼起到協(xié)同抗NSCLC作用，其中槲皮素下調(diào)p-Akt蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[9]，通過(guò)抑制Src/Fn14/NF-κB信號(hào)通路，抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，槲皮素的低細(xì)胞毒性和高豐度代表了其在NSCLC臨床治療中的應(yīng)用前景[10]。有研究認(rèn)為，槲皮素通過(guò)調(diào)控SIRT1/AMPK[11]、AMPK/mTOR[12]信號(hào)通路可誘導(dǎo)自噬促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。木犀草素可降低TBK1的表達(dá)，部分恢復(fù)對(duì)吉非替尼的敏感性[13]。另有研究認(rèn)為，下調(diào)AIM2可能是木犀草素對(duì)NSCLC的抗腫瘤作用關(guān)鍵途徑[14]，木犀草素可有效抑制H460細(xì)胞的增殖和遷移，這可能與其對(duì)E-cadherin和N-cadherin等上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志蛋白的調(diào)控有關(guān)[15]。山奈酚能通過(guò)調(diào)控miRNA21/PTEN/Akt信號(hào)通路抑制NSCLC A549細(xì)胞增殖[16]，通過(guò)抑制ERRα降低NSCLC A549細(xì)胞侵襲和遷移能力，并抑制其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]。另外，成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要有MAPK、STAT3、Akt1、IL-6、EGFR等，這些蛋白參與細(xì)胞增殖、分化、癌變、轉(zhuǎn)移、凋亡等，調(diào)控靶點(diǎn)蛋白的表達(dá)是抑制NSCLC的過(guò)程中起到重要作用。結(jié)合GO及KEGG通路富集分析，陽(yáng)和湯可能通過(guò)調(diào)控MAPK/NF-κB/STAT/Akt1/TNF等多級(jí)交叉的信號(hào)通路抑制腫瘤血管生成，抑制腫瘤細(xì)胞增殖與遷移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析充分體現(xiàn)了陽(yáng)和湯治療NSCLC多通路、多靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)模式，中藥復(fù)方的多成分可以通過(guò)多種途徑作用于疾病的多個(gè)方面，并且產(chǎn)生相互協(xié)同效應(yīng)。研究的第二部分通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)的聚類(lèi)分析，進(jìn)一步清晰地展示了陽(yáng)和湯及其關(guān)鍵成分作用于NSCLC的生物靶點(diǎn)分布及靶點(diǎn)信號(hào)的調(diào)節(jié)，不僅佐證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果，并且更加豐富和具體，明確到成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信號(hào)的調(diào)節(jié)方式，成分之間靶點(diǎn)互補(bǔ)以及共同靶點(diǎn)的作用關(guān)系。在過(guò)去的20年中，NSCLC治療已經(jīng)從以細(xì)胞毒性治療為中心發(fā)展到以肺腺癌和肺鱗癌中特定分子亞型為靶點(diǎn)的有效且耐受性更好的治療方案[18]，近年有多項(xiàng)臨床研究認(rèn)為靶向藥聯(lián)合中藥復(fù)方治療NSCLC更能獲益，中藥復(fù)方可起到增敏增效、提高免疫力、提高患者生活質(zhì)量、減少不良反應(yīng)的作用[19]。本研究納入分析的文獻(xiàn)也為此提供了實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究顯示陽(yáng)和湯有較好的免疫調(diào)節(jié)作用，例如增加NK細(xì)胞活性[20]，提高CD3+、CD4+/CD8+比率，提高荷瘤小鼠體質(zhì)量、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)及血清Th1、細(xì)胞因子IL-2 含量，從而使荷瘤機(jī)體內(nèi)Th1/Th2平衡漂移向Th1 占主導(dǎo)的地位轉(zhuǎn)換，起到抑制腫瘤的效果[21]，為陽(yáng)和湯在臨床應(yīng)用中減輕放化療不良反應(yīng)，改善臨床癥狀提供了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。體外實(shí)驗(yàn)研究中部分實(shí)驗(yàn)采用TKI靶向藥耐藥株H1975[22]、PC9/GR10來(lái)檢測(cè)陽(yáng)和湯關(guān)鍵成分的抗耐藥效果，結(jié)果顯示對(duì)于重啟腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)通路具有積極作用，從而驗(yàn)證了陽(yáng)和湯在臨床應(yīng)用中對(duì)TKI靶向藥的增敏效果。目前一線(xiàn)靶向治療NSCLC藥物吉非替尼、奧希替尼、厄洛替尼等治療的靶點(diǎn)為EGFR，有研究結(jié)果顯示肺癌患者中肺陰虧虛型、氣虛虧虛型、痰濕蘊(yùn)肺型、腎陽(yáng)虛衰型、肺脾氣虛型EGFR表達(dá)依次增高[23]，提示扶陽(yáng)類(lèi)中藥改善肺癌患者的陽(yáng)虛體質(zhì)可增強(qiáng)EGFR-TKI藥效。陽(yáng)和湯篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)中也有EGFR，文獻(xiàn)聚類(lèi)分析顯示EGFR下調(diào)頻次最高，為陽(yáng)和湯聯(lián)合靶向藥治療陽(yáng)虛型肺癌提供了理論依據(jù)和用藥參考。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)聚類(lèi)分析以闡明陽(yáng)和湯及關(guān)鍵成分的作用靶點(diǎn)及網(wǎng)絡(luò)作用機(jī)制，對(duì)于臨床治療NSCLC不同亞型化藥耐藥、TKI抑制劑靶向藥耐藥的患者，在聯(lián)合用藥的藥方配伍上具有一定的指導(dǎo)意義，為研制更為有效的抗腫瘤藥物提供了一定的理論依據(jù)。本研究首次嘗試采用實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)挖掘、熱圖聚類(lèi)分析來(lái)佐證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果，實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)由于是全網(wǎng)檢索，實(shí)時(shí)采集，數(shù)據(jù)更新更全，可彌補(bǔ)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)更新滯后的不足，增加了研究深度與廣度，熱圖分析更能清晰地呈現(xiàn)研究結(jié)果，適合在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中推廣。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在藥物發(fā)現(xiàn)的過(guò)程中發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用，但在這個(gè)領(lǐng)域仍存在一定的局限性，目前采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)針對(duì)疾病篩選出的活性成分并非是中藥材現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的主要質(zhì)控成分或藥材中含量較高的成分，篩選出某些活性成分相似度較高，如槲皮素、山柰酚和谷甾醇等具有廣泛的活性，在不同藥物或處方的篩選中，篩選出來(lái)的結(jié)果有較大程度的相似性，顯然這一現(xiàn)象有待進(jìn)一步探討[24]。桂皮醛作為肉桂標(biāo)準(zhǔn)活性成分，能有效抑制細(xì)胞凋亡，通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，逆轉(zhuǎn)NSCLC細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[25]，但在本研究未篩選出來(lái)，提示數(shù)據(jù)庫(kù)尚有待完善，篩選成分的標(biāo)準(zhǔn)尚有待優(yōu)化。另中藥復(fù)方君臣佐使的配伍不僅針對(duì)疾病，也以證型為主，例如，中藥治療NSCLC有多個(gè)方劑，不同的方劑治療不同證型，中藥標(biāo)準(zhǔn)活性成分并不一定具有抗腫瘤作用，更側(cè)重于改善主要癥狀，從整體上改善內(nèi)環(huán)境，激發(fā)人體自愈機(jī)制，癥狀的改善對(duì)患者產(chǎn)生積極心理作用，心理作用并非藥理機(jī)制，這種復(fù)雜的、間接的抗腫瘤機(jī)制無(wú)法在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中體現(xiàn)出來(lái)。本研究陽(yáng)和湯中的熟地黃，用量最大，檢索2020版《中華人民共和國(guó)藥典(一部)》[26]，熟地黃標(biāo)準(zhǔn)活性成分為地黃苷D，并不具有抗腫瘤作用，地黃中的抗腫瘤作用成分為地黃多糖，地黃多糖在炮制過(guò)程發(fā)生了水解反應(yīng)，其含量明顯降低，抗腫瘤作用也隨之減弱，僅從藥物成分來(lái)看，生地黃抗腫瘤作用更佳[27]，但針對(duì)陽(yáng)虛型腫瘤患者，生地黃藥性偏寒，不可多用，重用藥性甘溫的熟地黃則能生精益髓，補(bǔ)陽(yáng)祛邪，其藥理作用主要為抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)造血、抗疲勞[28]，起到整體調(diào)節(jié)和體質(zhì)改善作用，利于其他藥物中的抗腫瘤活性成分藥理機(jī)制的發(fā)揮。中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)還需要經(jīng)過(guò)不斷地完善和改進(jìn)，不僅將其與藥理學(xué)、藥動(dòng)學(xué)、毒理學(xué)和藥效學(xué)等學(xué)科有效結(jié)合，更要堅(jiān)持以中醫(yī)藥整體觀(guān)念和辨證論治思維進(jìn)行課題研究的科學(xué)設(shè)計(jì)，使篩選得到的活性成分和作用機(jī)制更有說(shuō)服力。

注：本文出現(xiàn)的英文簡(jiǎn)寫(xiě)之中文全稱(chēng)對(duì)應(yīng)如下：

槲皮素(quercetin，Que)

木犀草素(luteolin，Lut)

山奈酚(kaempferol，Kae)

腺嘌呤核糖核苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)

黑素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)

絲/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，AKT)

間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)

激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)

淀粉樣β前體蛋白(amyloid beta precursor protein，APP)

自噬相關(guān)5、7、12同源物(autophagy related 5、7、12 homolog，Atg5、7、12)

B淋巴細(xì)胞瘤-2基因中X蛋白比值(BCL2-associated X/B-cell lymphoma-2，bax/bcl-2)

過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)

周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)

細(xì)胞分裂周期2(cell division cycle 2，CDC2)

髓細(xì)胞組織增生病毒癌基因同源物(myelocytomatosis viral oncogene homolog，c-Myc)

細(xì)胞色素c氧化酶亞基2，(cytochrome c oxidase subunit 2，COX-2)

趨化因子(C-X-C基元)配體8[chemokine (C-X-C motif) ligand 8，CXCL8]

細(xì)胞色素P4503A4酶(cytochrome enzyme code P4503A4，CYP3A4)

肝癌缺失1(deleted in liver cancer 1，DLC-1)

雙特異性磷酸酶6(dual specificity phosphatase 6，DUSP6)

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions, EMT)

雌激素受體相關(guān)受體α(recombinant estrogen related receptor alpha，ERRα)

雌激素受體1(estrogen receptor 1)

局部粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)分子-14(fibroblast growth factor-inducible 14，F(xiàn)n14)

v-fos FBJ鼠科骨肉瘤病毒癌基因同源物(v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog，F(xiàn)OS)

谷胱甘肽(glutathiore, GSH)

人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體-2,3(human epidermal growth factor receptor 2,3, HER2,3)

缺氧可誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor，HIF-1)

白細(xì)胞介素(interleukin，IL)

導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)

胰島素受體(insulin receptor，INSR)

兩面神激酶(janus kinase，JAK)

v-jun肉瘤病毒17(v-jun sarcoma virus 17，JUN)

亮氨酸氨肽酶3(leucine aminopeptidase 3，LAP3)

微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain3，LC3)

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)

鼠類(lèi)轉(zhuǎn)化3T3細(xì)胞雙分2,4(murine double minute 2，Mdm2,4)

微小核糖核酸34a-5p(micro RNA-34a-5p，miR-34a-5p)

絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen activated protein kinase phosphatase 1，MKP-1)

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin，mTOR)

銜接因子蛋白1(adaptor protein 1，NCK1)

核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)

自然殺傷細(xì)胞(nature killer cell，NK-C)

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nadph oxidase，NOX)

核受體亞家族3組C成員1(nuclear receptor subfamily 3 group C member 1，NR3C1)

腫瘤蛋白21,53,62(tumor protein 21,53,62，p21,53,62)

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)

增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)

丙酮酸脫氫酶激酶同工酶1(pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1，PDK1)

孕酮受體(progesterone receptor，PGR)

磷酸化組蛋白H3(phosphorylated histone H3，PHH3)

磷脂酰肌醇 -3- 激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)

血纖維蛋白溶酶原(plasminogen，PLG)

脯氨酸豐富蛋白BstNI亞家族( proline-rich protein BstNI subfamily，PRB)

蛋白S6激酶(protein S6 kinase，p-S6K)

第10染色體缺失與張力蛋白同源的磷酸酶基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)

鼠科白血病病毒癌基因同源物(rat eukemia viral oncogene homolog，RAF)

鼠肉瘤病毒相關(guān)基因(rat sarcoma virus related genes，RAS)

成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤1(retinoblastoma 1，RB1)

網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)多癥病毒癌基因同源物A(reticuloendotheliosis virus oncogene homolog a，RELA)

類(lèi)視黃醇X 受體(β retinoid X receptor，RXRB)

硬脂?；o酶A脫氫酶(stearoyl-CoA desaturase，SCD)

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(sirtuin 1，SIRT1)

錳超氧化物歧化酶2(manganese superoxide dismutase superoxide dismutase 2，SOD2)

信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription3，STAT3)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β引導(dǎo)(transforming growth factor beta-induced，TGFBI)

胰激肽釋放酶抑制劑(trypsin kallikrein inhibitor，TKI)

腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)

無(wú)翅基因β-連環(huán)蛋白(wingless/β-catenin，Wnt/β-catenin)