牦牛附睪DPP4 基因CDS 區(qū)的克隆和表達(dá)研究

王紅梅，楊劉玥玲，吳逸韜，楊獻(xiàn)康，鄭旭昕，趙旺生（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng) 621010）

二肽基肽酶-4（Dipeptidyl Peptidase-4，DPP4）又稱腺苷脫氨酶復(fù)合蛋白26，是一種細(xì)胞表面蛋白酶，屬于脯氨酰寡肽酶家族，DPP4 蛋白可選擇性切割脯氨酸位于倒數(shù)第二位的肽中的氮末端二肽從而降解信號(hào)肽，發(fā)揮自身生物活性。同時(shí)，DPP4 與腺苷脫氨酶ADA 相互作用作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控因子從而控制細(xì)胞遷移和增殖。在體內(nèi)主要在組織內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞中表達(dá)。隨著年齡的增長(zhǎng)，男性生殖功能出現(xiàn)總體下降，主要表現(xiàn)為精子數(shù)量的減少和體內(nèi)雄激素的降低,作為精子的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，睪丸管周細(xì)胞（HTPCS）在雄性生殖過(guò)程中發(fā)揮突出作用，在探究睪丸功能衰退的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)睪丸管周細(xì)胞發(fā)生特異性改變，在出現(xiàn)線粒體網(wǎng)絡(luò)減少、溶酶體數(shù)量增加等蛋白質(zhì)紊亂現(xiàn)象的同時(shí)出現(xiàn)巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（）和水平升高。因此推測(cè)可能在雄性生殖過(guò)程中發(fā)揮作用。

三維結(jié)構(gòu)顯示，DPP4 是二聚體蛋白，每個(gè)單體的亞基由一個(gè)/水解酶結(jié)構(gòu)域和八葉螺旋槳結(jié)構(gòu)域組成，在自然條件下，-螺旋槳結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域共同參與DPP4 單體締合過(guò)程形成同型二聚體，絲氨酸、天冬氨酸、組氨酸形成催化三聯(lián)體的殘基，而水解酶結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸對(duì)催化活性至關(guān)重要。DPP4 獨(dú)特的螺旋結(jié)構(gòu)可作為蛋白質(zhì)互相作用的支架，-螺旋槳有4～8 個(gè)葉片，每個(gè)葉片由包含30～50 個(gè)氨基酸的重復(fù)亞基組成，相鄰的螺旋槳葉片環(huán)可形成配體與抗體的接觸位點(diǎn)。DPP4 作為廣泛表達(dá)的酶，通過(guò)錨定的跨膜分子和可溶性循環(huán)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，膜相關(guān)和可溶性DPP4（sDPP4）都具有催化活性，精液和腎臟是可溶性DPP4（sDPP4）的天然來(lái)源。目前，有關(guān)基因在牦牛附睪組織中的表達(dá)未見(jiàn)詳細(xì)研究，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)克隆獲得牦?；虻腃DS 區(qū)，利用熒光定量檢測(cè)其在牦牛附睪組織不同部位的表達(dá)并對(duì)其蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在為研究DPP4 在牦牛附睪上皮細(xì)胞中的功能提供基本數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 睪丸分離 實(shí)驗(yàn)所用睪丸來(lái)源于四川阿壩紅原，所用睪丸經(jīng)過(guò)Hanks 溶液漂洗3 次后分離附睪和睪丸，附睪組織分為附睪頭、附睪體、附睪尾3 部分，分離后立即放置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑及器材 TRIzolplus總RNA 提取試劑由Gen enode 提供；Moloney Murine Leukemia Virus 逆轉(zhuǎn)錄酶及2X SG Fast qPCR Master Mix 由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。QUAWELL 超微量紫外分光光度計(jì)（UV-5500PC）購(gòu)自艾本德（上海）國(guó)際貿(mào)易有限公司，熒光定量PCR 儀（T100 Thermal Cycler）購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.3 牦牛附睪總RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄 Trizol 試劑提取附睪頭、附睪體、附睪尾總RNA，QUAWELL 超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度。RNA 反轉(zhuǎn)錄，步驟一：基因組DNA 去除，反應(yīng)體系（10 μL）：5×gDNA Buffer 2.0 μL，總RNA 2.0 μL，RNase-Free ddHO 6.0 μL。反應(yīng)過(guò)程42℃，3 min。步驟二：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系（10 μL）：10 × King RT Buffer 2.0 μL，F(xiàn)astKing RT Enzyme Mix 1.0 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2.0 μL，RNase-Free ddHO 5.0 μL。將混合液加入到步驟一的反應(yīng)液中，混勻后，42℃孵育15 min，95℃孵育3 min，產(chǎn)物于-20℃冰箱保存。

1.4 目的基因克隆 以牦牛附睪組織反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系（20.0 μL）：DNA 聚合酶10.0 μL，雙蒸水7.0 μL，上下游特異性引物各1.0 μL（10 μmol/L）混勻，附睪頭、體、尾的cDNA 各添加1.0 μL。反應(yīng)過(guò)程：預(yù)變性94℃4 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃60 s；以上過(guò)程循環(huán)40 次，后經(jīng)72℃2 min 的延伸。將產(chǎn)物電泳檢測(cè)后進(jìn)行DNA純化并將目的片段和載體連接、進(jìn)行轉(zhuǎn)化及鑒定后，經(jīng)成都擎科梓熙生物公司測(cè)序。

1.5 熒光定量PCR 反應(yīng)體系（10.0 μL）：2x SG Fast qPCR Master Mix 5.0 μL，取上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL 混勻，PCR-grade water 3.7 μL，模板DNA 0.5 μL，以每樣3 個(gè)重復(fù)為對(duì)照，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃3 min，95℃2 s，60℃25 s；以上過(guò)程循環(huán)40 次。定量結(jié)果利用SPSS19.0 軟件分析。

1.6 DPP4 蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析 BioXM 2.6 軟件分析牦牛的核苷酸和氨基酸序列；在線軟件EXPASY（https://web.expasy.org/protparam/）對(duì)DPP4進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析，NCBI 的BLAST 比對(duì)其氨基酸同源性，并使用MEGA6.0 軟件對(duì)其系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行構(gòu)建，NeTPhos3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/ser vices/NetPhos/）預(yù)測(cè)牦牛DPP4 蛋白磷酸化位點(diǎn)，TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)DPP4 蛋白跨膜區(qū)，其他相關(guān)生物學(xué)預(yù)測(cè)方法同之前的研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因和內(nèi)參基因的引物 參考NCBI 中公布的牦?；騧RNA 序列（登錄號(hào)：XM_005897282.2）以及內(nèi)參基因（登錄號(hào)：NM_001037471.2），利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，具體信息見(jiàn)表1。

表1 目的基因和內(nèi)參基因的引物

2.2 牦?；蚩寺‘a(chǎn)物 克隆結(jié)果顯示，獲得牦牛附睪序列2 519 bp。CDS 區(qū)分析發(fā)現(xiàn)，基因CDS 長(zhǎng)度為2 298 bp，共編碼765 個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)AG（圖1）。

圖1 牦牛DPP4 基因的堿基和氨基酸序列

2.3 牦牛DPP4 蛋白質(zhì)的理化信息 DPP4 氨基酸分子式為CHNOS，分子量為88.37 ku，包含765 個(gè)氨基酸，其中含量最高是絲氨酸，占總氨基酸數(shù)的8.8%；其次是亮氨酸，占總氨基酸數(shù)的7.7%；酪氨酸，占氨基酸總數(shù)的7.1%；半胱氨酸含量最低，占氨基酸總數(shù)的1.4%。負(fù)電荷殘基（Asp+glu）和正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)分別為84 和71；等電點(diǎn)5.92，總親水系數(shù)-0.39，脂肪系數(shù)為78.99，不穩(wěn)定系數(shù)為45.38，由此可將DPP4 蛋白歸為帶負(fù)電的不穩(wěn)定蛋白。

2.4 牦?；虻奈锓N同源性分析 通過(guò)BLAST對(duì)基因同其他物種進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)牦?；蚝塑账嵝蛄信c綿羊（登錄號(hào)：XM_004004660.5）、山羊（登錄號(hào)：XM_005676046.3）、野豬（登錄號(hào)：NM_214257.1）、獼猴（登錄號(hào)：XM_011744180.2）、黑猩猩（登錄號(hào)：XM_009443585.3）的同源性分別是98.78%、98.61%、92.12%、90.17%、90.13%。MEGA 11.0 構(gòu)建以上物種的核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，可看出牦牛與綿羊、山羊親緣關(guān)系較近（圖2），符合物種進(jìn)化規(guī)律。

圖2 DPP4 的進(jìn)化樹(shù)

2.5 牦牛DPP4 蛋白結(jié)構(gòu) 牦牛DPP4 蛋白存在102 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中包括50 個(gè)絲氨酸位點(diǎn)，27 個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)，25 個(gè)酪氨酸位點(diǎn)。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，共765 個(gè)氨基酸組成DPP4 蛋白，其中18.17%（139 個(gè)）處于-螺旋區(qū)；6.14%（47 個(gè)）處于-轉(zhuǎn)角；30.46%（233個(gè)）位于延伸鏈；45.23%（346 個(gè)）氨基酸處于無(wú)規(guī)則狀態(tài)。親疏水性分析顯示（圖3），DPP4 蛋白在第24個(gè)氨基酸位點(diǎn)存在最大值2.956，此位點(diǎn)疏水性最強(qiáng)；第179 個(gè)氨基酸位點(diǎn)上存在最小值-2.589，此位點(diǎn)氨基酸親水性最強(qiáng)。從蛋白整體結(jié)構(gòu)看，親水性氨基酸均勻分布在整個(gè)肽鏈中未見(jiàn)明顯疏水區(qū)，可將DPP4 整體視為親水性蛋白，這與其理化性質(zhì)預(yù)測(cè)相符。在線網(wǎng)站TMHMM 2.0 分析DPP4 蛋白的跨膜區(qū)，結(jié)果顯示牦牛DPP4 蛋白的1～6 位氨基酸位于細(xì)胞膜內(nèi)，在7～29 位氨基酸之間形成跨膜螺旋區(qū)（圖4）；信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示DPP4 蛋白不存在信號(hào)肽（圖5），SoftBerry 預(yù)測(cè)牦牛DPP4 蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞膜上。

圖3 牦牛DPP4 蛋白親疏水性預(yù)測(cè)圖

圖4 牦牛DPP4 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

圖5 牦牛DPP4 蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)圖

2.6 牦?；蛟诟讲G不同區(qū)域的表達(dá) 對(duì)牦牛附睪頭、附睪體、附睪尾的cDNA 進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，基因在附睪頭部表達(dá)量低于其在附睪體部和附睪尾部的表達(dá)（＜0.01）（圖6）。

圖6 DPP4 基因在牦牛附睪不同部位的相對(duì)表達(dá)情況

3 討 論

DPP4 蛋白是一種多功能II 型細(xì)胞表面糖蛋白，其功能可以根據(jù)它們的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外定位、細(xì)胞類型、寡聚或聚合狀態(tài)以及配體、輔因子或產(chǎn)物的濃度發(fā)生變化。抑制劑通過(guò)降低內(nèi)源性腸促胰島素失活，進(jìn)而刺激胰島素的釋放，調(diào)節(jié)空腹血糖、餐后血糖和糖化血紅蛋白HbA1c 水平，被廣泛用于治療糖尿病。然而，在糖尿病男性病例研究中發(fā)現(xiàn)西格列汀對(duì)精子參數(shù)和睪酮水平存在不良影響。患者使用西格列汀后，在有效控制血糖的同時(shí)出現(xiàn)精子質(zhì)量和精子數(shù)量明顯下降，甚至出現(xiàn)無(wú)精子狀況，而停用西格列汀三個(gè)月后后精子質(zhì)量恢復(fù)至可受孕狀態(tài)。此外，二甲雙胍聯(lián)合抑制劑治療二型糖尿病時(shí)發(fā)現(xiàn)，與單一二甲雙胍治療相比，抑制劑協(xié)同治療時(shí)，患者M(jìn)DA、LHP水平顯著降低，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）水平顯著升高，證實(shí)抑制劑可以明顯改善患者氧化應(yīng)激情況。GSH-Px 作為機(jī)體抗氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)，可保護(hù)精子在附睪運(yùn)輸和尾腔儲(chǔ)存過(guò)程中免受過(guò)氧化物的不利影響，研究發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶家族成員在牦牛附睪不同部位表達(dá)以附睪頭表達(dá)量顯著高于附睪體和附睪尾，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，推測(cè)可能與一同參與精子氧化應(yīng)激過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)克隆獲得牦牛系列長(zhǎng)2 519 bp，其中CDS區(qū)長(zhǎng)2 298 bp，編碼765 個(gè)氨基酸。DPP4 蛋白是不穩(wěn)定帶負(fù)電的親水蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，其蛋白磷酸化位點(diǎn)有102 個(gè)，蛋白結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲和-螺旋為主，在此基礎(chǔ)上延伸。熒光定量結(jié)果顯示，在附睪頭中低表達(dá)，在附睪體和附睪尾高表達(dá)，與雄牛生殖組織的研究相符。目前有關(guān)對(duì)精子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮何種作用仍待深入研究，根據(jù)現(xiàn)有研究，使用抑制劑后對(duì)雄性精子帶來(lái)的不利影響得到驗(yàn)證，可推測(cè)在精子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮一定作用，可為后續(xù)研究提供一定思路。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)成功克隆牦?；?，基因在附睪頭部的表達(dá)顯著高于其在附睪體和附睪尾的表達(dá)。對(duì)牦牛DPP4 蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，DPP4 蛋白為不穩(wěn)定的帶負(fù)電的親水蛋白，在牦牛生殖過(guò)程中具體發(fā)揮何種作用有待進(jìn)一步研究，本研究可為進(jìn)一步研究基因在牦牛附睪上皮細(xì)胞中的功能提供一定基礎(chǔ)資料。