甜菜谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因家族鑒定及在鎘脅迫下的響應(yīng)分析

鐘鑫愛(ài) 孟詩(shī)琪 周婉婷 姚 琦 張 瓊 興 旺 劉大麗

（1. 國(guó)家甜菜種質(zhì)中期庫(kù)，黑龍江大學(xué)，哈爾濱 150080；2. 黑龍江大學(xué)省高校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；3. 黑龍江大學(xué)省高校生化與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150080）

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（）是一種由超基因家族編碼的古老的多樣性蛋白家族，在生物機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮著解毒和抗氧化等作用。由于最初發(fā)現(xiàn)這種酶在植物中應(yīng)對(duì)除草劑的過(guò)程中起解毒作用，因此也被稱(chēng)為解毒酶。植物中的主要功能為響應(yīng)逆境條件脅迫，如化學(xué)藥品脅迫、重金屬逆境脅迫、高溫、高鹽、低溫等。

在植物中GSTs 可分為T(mén)au、Phi、Theta、Zeta、DHAR、Lambda、TCHQD 與EF18 個(gè)類(lèi)型的亞家族，除了Lambda 與DHAR 亞家族，GSTs 在溶液中均以二聚體蛋白的形式存在，與谷胱甘肽（Glutathione，GSH）共價(jià)結(jié)合后形成不相同的三肽疏水親電底物，在細(xì)胞中絡(luò)合活性氧物質(zhì)，調(diào)控細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，在次生代謝產(chǎn)物的解毒過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。在各個(gè)GSTs 亞家族中，Phi 與Tau亞家族為植物所特有，并且數(shù)量最多。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)植物基因家族已有大量研究，研究表明在 擬南芥（）、大 豆（）、玉米（）、水稻（）、楊樹(shù)（spp.）中分別存在25～81 個(gè)基因，并對(duì)其功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，植物的基因能夠?qū)Σ煌姆巧锩{迫做出響應(yīng)，如除草劑、重金屬脅迫、鹽脅迫和干旱脅迫等。

重金屬是植物生長(zhǎng)過(guò)程中重要的微量元素，但當(dāng)含量超過(guò)一定闕值時(shí)會(huì)導(dǎo)致生物活性分子的生理功能受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致植物重金屬中毒。鎘是一種環(huán)境中常見(jiàn)的重金屬，植物受到鎘脅迫的影響主要表現(xiàn)為“低促高抑”，低濃度的鎘可以適當(dāng)促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，而高濃度的鎘脅迫會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)停止。鎘的長(zhǎng)期積累，會(huì)轉(zhuǎn)移到食物鏈，對(duì)糧食安全和人類(lèi)健康構(gòu)成重大威脅。而當(dāng)遇到重金屬如鎘等脅迫時(shí)，生物體內(nèi)的GSTs 可催化GSH 結(jié)合過(guò)氧化物或絡(luò)合結(jié)合自由態(tài)Cd，也能夠通過(guò)解除活性親電子復(fù)合體來(lái)抵御一系列逆境脅迫的傷害，并在抵御活性氧物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的毒害中發(fā)揮重要作用。目前已有許多植物響應(yīng)鎘脅迫的報(bào)道，如番茄（）、苧麻（）、水稻、白菜（）和擬南芥等。Kilili 等在番茄的研究中，鑒定出5 個(gè)Tau 家族參與了氧化應(yīng)激反應(yīng)所涉及到的催化與調(diào)節(jié)功能網(wǎng)絡(luò)。在不同的苧麻品種中，部分苧麻基因表現(xiàn)出對(duì)鎘脅迫的積極響應(yīng)。水稻植株在鎘脅迫下，通過(guò)蛋白質(zhì)互作提高了還原性GSH 的含量，GSTs 蛋白質(zhì)復(fù)合體會(huì)產(chǎn)生特異性的表達(dá)，有效降低了鎘對(duì)水稻植株的毒害作用。在白菜中，的大量表達(dá)使部分白菜品種的Cd積累量和Cd耐受性升高。研究表明，擬南芥 中 的、、基因參與有毒物質(zhì)的代謝過(guò)程，其中、參與了鎘離子的脅迫應(yīng)答。此外，在煙草（）、苜蓿（）和 蘆 葦（）等植物中過(guò)表達(dá)基因，均證明基因與鎘耐受相關(guān)。

在研究土壤重金屬污染修復(fù)的方法中，傳統(tǒng)的修復(fù)方法如化學(xué)修復(fù)法、物理修復(fù)法都具有成本高、耗能大的問(wèn)題。而利用生物代謝治理重金屬污染的生物修復(fù)技術(shù)則具有經(jīng)濟(jì)有效，并且能夠防止二次污染的特點(diǎn)，是具有較大前景的修復(fù)方法。甜菜（）是我國(guó)乃至世界重要的糖料作物之一，同時(shí)由于其體內(nèi)含有大量的糖類(lèi)碳水化合物，因此可以生產(chǎn)工業(yè)乙醇，作為一類(lèi)新興的能源作物，其具有較大的經(jīng)濟(jì)效益。在面對(duì)土壤中重金屬污染時(shí)，甜菜適應(yīng)非生物脅迫的能力很強(qiáng)，能通過(guò)根際富集重金屬，促進(jìn)重金屬的分解，進(jìn)而可以降低土壤中重金屬的污染程度。但目前關(guān)于甜菜耐受重金屬脅迫的分子機(jī)制的研究較為少見(jiàn)。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，基因（LOC104898671）與鎘逆境脅迫存在著一定的應(yīng)答關(guān)系。將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌（）中，該基因可以有效的直接或間接地降低Cd 對(duì)細(xì)胞的毒害，進(jìn)而提高了大腸桿菌的重金屬耐受性。在對(duì)基因進(jìn)行不同濃度的Cd脅迫，均能誘導(dǎo)甜菜基因表達(dá)上調(diào)，在Cd濃度為0.5 mmol·L時(shí)該基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高值。這證實(shí)基因可以提高甜菜在鎘脅迫下的耐受性，但是其在鎘脅迫下精確的作用機(jī)制還有待研究，針對(duì)其家族成員的全基因組鑒定尚且鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究利用同源比對(duì)法，在甜菜基因組中挖掘基因家族成員，并對(duì)基因家族成員的保守基序、基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系與順式作用元件進(jìn)行深入的分析，結(jié)合對(duì)鎘脅迫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選與鎘脅迫相關(guān)的，并分析它們的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式。進(jìn)而為研究基因家族的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)信息，為提高甜菜對(duì)重金屬逆境的耐受性和種質(zhì)創(chuàng)新提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 植物材料

甜菜材料取自國(guó)家甜菜種質(zhì)資源中期庫(kù)。將大小均一的甜菜種子，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇消毒后，取蒸餾水反復(fù)沖洗，再用2%福美雙浸泡過(guò)夜，用蒸餾水沖洗干凈。將消毒后的種子均勻排列在含有蛭石的培養(yǎng)槽中，放在含有光照的溫室條件下培養(yǎng)。至甜菜種子萌發(fā)后，取2片子葉期的甜菜幼苗培養(yǎng)于Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液中，培養(yǎng)至6 片真葉期。用濃度為0.5 mmol·L的CdCl溶液處理甜菜幼苗6 h，以正常條件下生長(zhǎng)的甜菜幼苗為對(duì)照，每個(gè)處理3 次重復(fù)，分別取甜菜地上部及地下部組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2 不同物種基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的獲得及甜菜BvGSTs基因家族成員的鑒定

在Ensemble 網(wǎng)站（http：plants.ensemble.org/index.html）下載甜菜、擬南芥全基因組序列、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)及基因組注釋文件。借助隱馬爾科夫模型（PF00043，PF02798）搜索甜菜蛋白質(zhì)組中的GSTs蛋白序列，將冗余去除后，在Pfam（http//pfam.xfam.org）數(shù)據(jù)庫(kù)及CDD（http：www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）數(shù)據(jù)庫(kù)中將所有候選基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的確認(rèn)。

1.3 BvGSTs蛋白的理化性質(zhì)分析

利用Expasy-ProtParam tool 在線(xiàn)分析工具（http：//web.expasy.org/protparam/）獲得氨基酸數(shù)、等電點(diǎn)（pI）、相對(duì)分子質(zhì)量、不穩(wěn)定系數(shù)等數(shù)據(jù)，整理獲得相關(guān)的理化性質(zhì)。利用在線(xiàn)軟件Cell-PLoc 2.0（http：\www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2）對(duì)基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.4 BvGSTs基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

利用MEGA X 軟件中的Clustal W 功能對(duì)甜菜基因家族進(jìn)化分類(lèi)，根據(jù)52個(gè)甜菜和53 個(gè)擬南芥的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，采用鄰近法（neighbour-joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，其中Bootstrap method 值設(shè)定為1 000，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。

1.5 BvGSTs 基因家族的基因結(jié)構(gòu)和和保守基序分析及染色體定位

從甜菜基因組的GFF3 注釋文件中獲取基因家族成員的外顯子、內(nèi)含子結(jié)構(gòu)信息及染色體的位置信息，利用在線(xiàn)網(wǎng)站MEME（http：memesuite.org/tools/meme）對(duì)蛋白質(zhì)保守基序進(jìn)行分析。通過(guò)TBtools 軟件對(duì)基因結(jié)構(gòu)，保守基序、染色體位置進(jìn)行可視化，保守基序數(shù)目設(shè)置為9，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。

1.6 BvGSTs基因家族順勢(shì)作用元件分析

利用TBtools軟件提取與重金屬鎘脅迫相關(guān)的52 個(gè)成員起始密碼子上游2 000 bp 的基因序列，通過(guò)PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線(xiàn)軟件進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)，再用TBtools 軟件與R 軟件將順勢(shì)作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果可視化。

1.7 鎘脅迫下甜菜BvGSTs基因家族的差異表達(dá)分析

對(duì)提取的甜菜總RNA 進(jìn)行高通量測(cè)序，對(duì)獲取的家族基因在鎘脅迫下的表達(dá)量進(jìn)行差異表達(dá)分析。根據(jù)基因在地上部和地下部中的log（FoldChange）值，利用TBtools 軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析。

1.8 鎘脅迫下BvGSTs基因表達(dá)GO分析

利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果獲得鎘脅迫下響應(yīng)的甜菜基因的GO 條目，并運(yùn)用在線(xiàn)網(wǎng)站Hiplot（https：//hiplot.com.cn）對(duì)其GO 功能富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.9 qRT-PCR熒光定量分析

利用Trizol試劑盒提取樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)目的基因序列，分別設(shè)計(jì)定量PCR 引物（見(jiàn)表1），使用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）熒光定量試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，檢測(cè)每份樣品的目的基因和內(nèi)參基因Ct值，3次重復(fù)。利用2相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

表1 熒光定量引物及序列Table 1 The primers and sequences for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜BvGSTs基因家族的篩選與理化性質(zhì)

在Pfam 網(wǎng)站中利用序列號(hào)PF00043 和PF02798（GST 保守域）鑒定基因。在Ensemble 網(wǎng)站中下載甜菜全基因組蛋白序列。通過(guò)隱馬爾科夫模型（PF00043，PF02798）搜索甜菜蛋白質(zhì)組中的GSTs 蛋白序列。利用Pfam 和CDD 驗(yàn)證甜菜的保守結(jié)構(gòu)域，最終在甜菜基因組中鑒定出52個(gè)家族成員。

如表2所示，52個(gè)基因編碼的氨基酸在212aa（）～240aa（），推測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為17～28 kDa；pI 為4.72～9.65，其中47 個(gè)成員的pI 小于7，偏酸性；其余5 個(gè)成員的pI 大于7，偏堿性。在甜菜基因家族成員中41%的蛋白不穩(wěn)定系數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白，其余的為不穩(wěn)定蛋白；且大部分的定位于細(xì)胞質(zhì)，僅基因位于細(xì)胞核。

表2 甜菜BvGSTs基因家族的基本信息Table 2 The basic information of BvGSTs gene family in Beta vulgaris L.

2.2 甜菜BvGSTs基因家族的系統(tǒng)發(fā)育

利用52個(gè)甜菜BvGSTs蛋白序列和53個(gè)擬南芥AtGSTs蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，利用MEGA X軟件的Clustal W 功能構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（見(jiàn)圖1）。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分枝和保守序列可看出，甜菜與擬南芥的GSTs 聚類(lèi)為一個(gè)大分枝。甜菜GSTs可分為7 類(lèi)：DHAR、Lambda、Phi、Tau、TCHQD、Theta 和Zeta。各個(gè)亞家族中，Tau 類(lèi)亞家族是甜菜中較大的亞家族，數(shù)量有31 個(gè)；Phi 類(lèi)為11 個(gè)、DHAR 類(lèi)2 個(gè)、Lambda 亞家族有3 個(gè)、TCHQD 類(lèi)1個(gè)、Zeta類(lèi)2個(gè)以及Theta類(lèi)2個(gè)。

圖1 甜菜（BV）、擬南芥（AT）家族進(jìn)化樹(shù)分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of Beta vulgaris（BV）and Arabidopsis thaliana（AT）

2.3 甜菜BvGSTs家族基因結(jié)構(gòu)和保守基序及順式作用元件

利用MEME 在線(xiàn)工具對(duì)甜菜52 個(gè)成員的保守域進(jìn)行分析，并根據(jù)甜菜全基因組注釋文件GFF 和甜菜家族基因CDS 序列信息進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，通過(guò)TBtools進(jìn)行可視化（見(jiàn)圖2）。結(jié)果表明，Tau 亞家族成員大都為2 個(gè)外顯子；Phi亞家族外顯子大都為3個(gè)，極個(gè)別基因的外顯子為6～7個(gè)；Theta家族的和Zeta 家族的外顯子均為9 個(gè)；DHAR、Lambda亞家族外顯子為6個(gè)左右。在甜菜基因家族成員中，大部分都有5′和3′端翻譯 區(qū)（untranslated region，UTR），其 中的3′端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度較長(zhǎng)，將近2 500 bp；而在這些成員中，沒(méi)有5′和3′端UTR。

如圖2 所示，在基因家族成員中，共鑒定出9個(gè)保守基序，并且不同的家族成員含有的基序?yàn)?～7個(gè)。大部分基因家族成員都包含motif 2，說(shuō)明motif 2 在基因家族中較為保守。在52 個(gè)成員中可看出各個(gè)亞家族中的motif 排列相對(duì)相似，而不同亞家族之間的motif排列不同。Tau亞家族成員均含有motif 8、motif 9、motif 4、motif 3，且排列順序相同；Phi 亞家族大部分含有motif 7、motif 4、motif 8，其中motif 8為Phi家族特有。

圖2 甜菜BvGSTs基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析A.進(jìn)化樹(shù)；B.基因結(jié)構(gòu)；C.保守基序；刻度標(biāo)尺表示基因長(zhǎng)度（bp）和蛋白序列長(zhǎng)度（aa）Fig.2 Analysis of phylogenetic tree，gene structure and conserved motif elements of BvGSTs in Beta vulgarisA.Phylogentic；B.Gene structure；C.Conservative motif；Scale markers repersent gene length（bp）and protein sequence length（aa）

利用PlantCARE 在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)順式作用元件結(jié)果（見(jiàn)圖3），可發(fā)現(xiàn)所有成員都有光反應(yīng)、脫落酸反應(yīng)、生長(zhǎng)發(fā)育元干旱響應(yīng)元件及MYB結(jié)合位點(diǎn)?？梢酝茰y(cè)，甜菜基因家族可能響應(yīng)激素調(diào)節(jié)和非生物脅迫，并且MYB 可能是調(diào)控轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子之一。

圖3 甜菜BvGSTs基因家族順勢(shì)作用元件Fig.3 Putative cis-acting element analysis of BvGSTs gene family in Beta vulgaris

2.4 甜菜BvGSTs基因的染色體定位

52 個(gè)基因中的30 個(gè)基因在甜菜的8條染色上分布，但其余22 個(gè)基因定位在scaffold上，未定位到染色體上，仍需要進(jìn)行探索（見(jiàn)圖4）。甜菜染色體上的各個(gè)基因分布密度不同，在5 號(hào)染色體上分布最多，為11 個(gè)，并集中于40～50 Mb；6號(hào)染色體上的多位于50～60 Mb；7號(hào)染色體上基因相對(duì)分布均勻，其中和位 于10～20 Mb，位于20～30 Mb，其他5 個(gè)基因位置在30～50 Mb；其他染色體均在不同位置分布了數(shù)量不等的。相對(duì)于各個(gè)染色體的長(zhǎng)度，6、5、2、8、1 號(hào)染色體上各成員多集中于下部，9 和4號(hào)染色體上的成員分布下部。7號(hào)染色上各成員的分布較均勻。利用MCScan X 分析，發(fā)現(xiàn)基因家族中存在4 處串聯(lián)基因重復(fù)，多集中于Tau亞家族和Phi 亞家族，形成多個(gè)基因簇，其中5號(hào)染色體出現(xiàn)2處串聯(lián)復(fù)制基因簇。

圖4 甜菜BvGSTs基因家族染色體分布與基因復(fù)制Fig.4 Chromosome distribution and gene replication of BvGSTs gene family in Beta vulgaris L.

2.5 甜菜體內(nèi)響應(yīng)鎘脅迫的BvGSTs 基因表達(dá)GO功能富集分析

為了更好地探索基因在鎘脅迫下的分子機(jī)制，對(duì)52 個(gè)基因進(jìn)行了GO 功能富集分析（見(jiàn)圖5），共得到了36 個(gè)GO 條目。從Value 值來(lái)看，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性、轉(zhuǎn)移烷基或芳基（甲基除外）基團(tuán)、次級(jí)代謝、對(duì)毒性物質(zhì)的反應(yīng)、毒素代謝、毒素分解代謝過(guò)程和解毒作用這8 個(gè)GO 功能最為顯著，綜合來(lái)看，在甜菜鎘脅迫下可能發(fā)揮著重要的解毒作用。

圖5 甜菜BvGSTs家族基因在鎘脅迫下的GO富集Fig.5 GO enrichment analysis of BvGSTs family genes in sugar beet under cadmium stress

2.6 鎘脅迫下甜菜BvGSTs基因家族成員的表達(dá)特性

基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鑒定出的全部成員均與鎘脅迫相關(guān)。如圖6 所示，甜菜地下部中的33 個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中受到鎘脅迫的正向調(diào)控，19 個(gè)基因呈下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。在甜菜地上部中，、、和均顯著的受到了鎘脅迫的正向調(diào)控，鎘脅迫較為明顯的抑制了、、及的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

圖6 甜菜BvGSTs家族基因在鎘脅迫下的差異表達(dá)Cd_L 和Cd_R.甜菜BvGSTs 基因在鎘脅迫下，地上部與地下部cDNA 文庫(kù)中的表達(dá)量；Cv_L 和Cv_R.甜菜BvGSTs 基因在正常生長(zhǎng)條件下，地上部與地下部cDNA文庫(kù)中的表達(dá)量Fig.6 Differential expression of BvGSTs in Beta vulgaris under cadmium stressCd_L and Cd_R. Expression levels of BvGSTs gene in the leaf and the roof of sugarbeet’s cDNA libraries under cadmium stress；Cv_L and Cv_R.Expression levels of BvGSTs gene in the leaf and the roof of sugarbeet’s cDNA libraries under normal growth conditions

總體上看，鎘脅迫下，在甜菜地上部與地下部均呈上調(diào)表達(dá)的共有17 個(gè)，其中和的差異表達(dá)較明顯。在地上部和地下部呈下調(diào)共表達(dá)的基因?yàn)? 個(gè)（、、和）。結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析可以推斷，在地下部，Tau 亞家族基因在鎘脅迫時(shí)主要起正向調(diào)控作用，部分Zeta 亞家族基因在鎘脅迫時(shí)起負(fù)向調(diào)控作用；在地上部，鎘脅迫誘導(dǎo)Phi表達(dá)，抑制Tau表達(dá)。差異表達(dá)大的普遍分布于Tau 家族與Phi家族，在后續(xù)的鎘脅迫研究中可以多關(guān)注Tau 家族與Phi 亞家族。

為了進(jìn)一步確定基因家族在鎘脅迫下的生物學(xué)功能，在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中篩選在地上部和地下部均差異表達(dá)顯著的基因：（｜log（FoldChange）｜≥1；0.05）。將這4個(gè)基因利用qRT-PCR 技術(shù)分析它們?cè)?.5 mmol·L的鎘脅迫處理6 h 時(shí)，在地上部與地下部的表達(dá)量。如圖7 所示，在鎘脅迫下，在甜菜地上部組織中，呈 下調(diào)趨勢(shì)，呈上調(diào)趨勢(shì)；在甜菜地下部組織中，4 個(gè)差異表達(dá)顯著的基因都呈上調(diào)趨勢(shì)。在這4 個(gè)基因中，除為Phi 亞家族，其余3 個(gè)基因均來(lái)源于Tau 亞家族。qRT-PCR 的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果相符合，也進(jìn)一步證實(shí)了這4 個(gè)參與甜菜鎘脅迫應(yīng)答。

圖7 qRT-PCR分析4個(gè)BvGSTs在鎘脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性Fig.7 Transcriptional expression characteristics of 4 BvGSTs by qRT-PCR under cadmium stress

3 討論與結(jié)論

目前已在擬南芥、玉米、水稻、馬鈴薯（）等物種中鑒定出基因，并發(fā)現(xiàn)它們廣泛參與植物體中生長(zhǎng)發(fā)育的解毒和抗氧化過(guò)程。GST 能夠與谷胱甘肽（GSH）共價(jià)形成三肽疏水親電底物，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞氧化還原狀態(tài)等，介導(dǎo)調(diào)控由于重金屬逆境所引起的基因表達(dá)。甜菜適應(yīng)非生物脅迫的能力較強(qiáng)，在重金屬土壤污染修復(fù)方面有較大的潛力。實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)甜菜在鎘脅迫下的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序分析，并初步探索了其中的2 個(gè)差異表達(dá)基因在鎘脅迫下的功能。研究推測(cè)甜菜基因家族成員可能不同程度的參與到甜菜的鎘脅迫耐受調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中。

為了全面地了解和掌握甜菜體內(nèi)的基因家族成員，本研究基于甜菜全基因組數(shù)據(jù)共挖掘出52個(gè)基因，它們分屬于7個(gè)亞家族，占高等植物基因家族的87.5%。利用Expasy 對(duì)基因家族理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)90% 的基因偏酸性，59%為不穩(wěn)定蛋白。通過(guò)亞細(xì)胞預(yù)測(cè)，可發(fā)現(xiàn)大部分的位于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)的基因位于細(xì)胞核，這說(shuō)明作為可溶性的，它們幾乎都在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮功能。這與已有的研究中確定的的亞細(xì)胞位置相符。將篩選鑒定得到的甜菜GSTs 的52 個(gè)蛋白序列與模式植物擬南芥AtGSTs 的53 個(gè)蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)建樹(shù)，可初步將甜菜的GSTs分為了7個(gè)亞家族，分 別 為T(mén)au、Phi、Theta、Zeta、Lambda、TCHQD、DHAR。Tau 家族及Phi 家族在植物中分布較廣泛，與植物體中基因組分布特征結(jié)果相一致。在進(jìn)化過(guò)程中，Phi是由Tau亞家族分化而來(lái)，逐漸成為一個(gè)新的亞家族，但在植物的抗逆特性、解毒作用等特性上仍有相似性。已經(jīng)有研究報(bào)道證明擬南芥中的的過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)抗氧化酶的活性，進(jìn)而增強(qiáng)植物對(duì)非生物脅迫的耐受性；會(huì)調(diào)控種子萌發(fā)時(shí)的滲透耐受性。因此通過(guò)甜菜與擬南芥的系統(tǒng)發(fā)育分析，可以推測(cè)Tau 亞家族及Phi 亞家族中與與親緣關(guān)系較近的基因或許在抗逆作用中也有著可待挖掘的潛力。每個(gè)亞家族中的的保守基序、基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域是相似的，但不同亞家族之間有所不同。基因亞家族之間在結(jié)構(gòu)上存在著特異性，這可能決定不同亞家族發(fā)揮不同生物學(xué)功能。在基因家族中，基因串聯(lián)重復(fù)會(huì)對(duì)基因家族遺傳進(jìn)化起著重要作用，水稻基因家族的進(jìn)化是通過(guò)基因復(fù)制，然后由于復(fù)制基因的亞功能化或新功能化而保留下來(lái)。染色體定位分析中，半數(shù)的位于scaffold，未定位于染色體上，說(shuō)明對(duì)于基因的研究還仍需探索。其余30 個(gè)基因分別分布于甜菜的8條染色體上，其中5號(hào)、7號(hào)染色體上分布基因較多，并且存在兩處串聯(lián)復(fù)制基因簇，四處串聯(lián)基因重復(fù)，均屬于Tau 家族和Phi 家族，這可能也是導(dǎo)致Tau及Phi亞家族分化的一個(gè)原因。

在以往對(duì)于基因家族功能的研究中，可知基因家族成員能夠響應(yīng)多種生物與非生物的脅迫，如機(jī)械損傷、重金屬等。在對(duì)順式作用元件的分析中發(fā)現(xiàn)，基因家族成員能夠響應(yīng)多種環(huán)境應(yīng)激，推測(cè)順式作用元件的存在可能會(huì)影響在受到環(huán)境脅迫時(shí)轉(zhuǎn)錄表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，（）可以提高真菌對(duì)Cd 的耐受性；水稻和基因的大量表達(dá)在不影響酵母在正常生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)狀態(tài)的情況下，可以通過(guò)較高的GST 活性提高菌體對(duì)重金屬Cr（vI）的抗性。為了解基因家族成員在鎘脅迫下的表達(dá)特性，本研究對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的基因表達(dá)水平進(jìn)行了差異顯著性分析，并發(fā)現(xiàn)所有甜菜基因家族成員的轉(zhuǎn)錄表達(dá)均受到鎘脅迫不同程度的調(diào)控。在甜菜應(yīng)答鎘脅迫的機(jī)制中，Tau亞家族在地下部發(fā)揮著正調(diào)控作用，而Phi亞家族主要成員在地上部起正向調(diào)控作用，這個(gè)結(jié)果與和表達(dá)的數(shù)據(jù)十分相似。為了深入分析在鎘脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性，試驗(yàn)選擇差異表達(dá)顯著 的這4 個(gè)基因?qū)λ鼈冞M(jìn)行qRT-PCR 分析。結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相符，并且其都來(lái)源于Tau 亞家族或Phi 亞家族。我們可以推斷，或許在面對(duì)鎘脅迫時(shí)，甜菜GST 家族中的Tau 和Phi 亞家族在耐受性的提高上有著較大的潛力。

由此，在后續(xù)的研究我們可以多關(guān)注甜菜GST 家族中的Tau 亞家族與Phi 亞家族，這將為進(jìn)一步探究甜菜在鎘脅迫應(yīng)答機(jī)理中的作用提供科學(xué)依據(jù)。