環(huán)狀非編碼A RNA及E ApoE基因?qū)υ\斷腦卒中后血管性癡呆的價(jià)值研究

肖海萍,黃杰,謝偉賢,巫碧佳,歐衛(wèi)謙,張普（廣東省佛山市第二人民醫(yī)院,廣東 佛山 528000）

血管性癡呆（VD）屬于精神系統(tǒng)常見(jiàn)疾患，近年來(lái)發(fā)病率呈現(xiàn)出升高的態(tài)勢(shì)，屬于慢性進(jìn)行性疾病，對(duì)患者的生活質(zhì)量與身心健康均產(chǎn)生較為嚴(yán)重的危害[1]。早期的干預(yù)治療能夠降低VD的發(fā)生，延緩VD的進(jìn)展[2]。有研究認(rèn)為，非編碼RNA（ncRNA）在VD的進(jìn)展過(guò)程中起了主要作用，人類基因組有超過(guò)97%的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為ncRNA，包括微小RNA（miRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）以及環(huán)狀RNA（circRNA），在生命活動(dòng)中有著廣泛多樣的生物功能[3]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于circRNA的研究較多，研究結(jié)果亦表明其在腦血管病、帕金森病、癲癇等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患中存在差異性表達(dá)，circRNA有望成為相關(guān)疾患的生物學(xué)標(biāo)志物，用于診斷及判斷預(yù)后[4]。有研究證實(shí)，AopE基因型與患者認(rèn)知功能有關(guān)，參與神經(jīng)系統(tǒng)的正常生長(zhǎng)和損傷后的修復(fù)過(guò)程[5]。目前關(guān)于circRNA、LncRNA以及AopE在VD疾患中診斷效能的研究報(bào)道均較罕見(jiàn)，故本研究特對(duì)VD患者的circRNA、LncRNA以及AopE進(jìn)行測(cè)定，旨在探究上述指標(biāo)的診斷效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年7月-2021年12月佛山市第二人民醫(yī)院收治的VD患者100例和NVD患者100例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①確診為缺血性腦卒中；②發(fā)病時(shí)間＜24h；③患者年齡≤79歲；④患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有阿爾茲海默癥疾患或精神系統(tǒng)疾患；②既往有腦卒中或腦外傷病史；③合并自身免疫性疾患；④腦干梗死或大面積腦梗死。VD組男62例，女38例，年齡50-81歲，平均（65.85±5.64）歲，腦梗死部位：基底節(jié)區(qū)55例，腦葉20例，腦干15例，其他10例，合并高血壓34例，糖尿病40例，高血脂28例，吸煙15例，受教育年限2-21年，平均（12.15±3.80）年。NVD組男6 5 例，女3 5 例，年齡5 1-8 2 歲，平均（65.86±6.68）歲，腦梗死部位：基底節(jié)區(qū)56例，腦葉22例，腦干17例，其他5例，合并高血壓36例，糖尿病38例，高血脂30例，吸煙18例，受教育年限3-22年，平均（12.09±3.64）年。另選擇同期健康體檢者100例作為對(duì)照組，其中男67例，女33例，年齡52-79歲，平均（65.53±6.09）歲，吸煙20例，受教育年限2-22年，平均（12.31±3.51）年。三組上述資料比較具有均衡性（P＞0.05），可行比較。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 方法

1.2.1 AopE 無(wú)菌收集受試者靜脈血5ml，EDTANa2抗凝，按常規(guī)方法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA，用于進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RCR），方法為PCR熒光探針?lè)?。從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫，各組充分融解，快速離心10s。核算本次實(shí)驗(yàn)所需的反應(yīng)數(shù)，按照23μl/孔分裝量將每種反應(yīng)液分別裝到反應(yīng)管內(nèi)，PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本區(qū)，剩余試劑放回-20℃±5℃冰箱中冷凍避光保存。提取樣本DNA，使用天根血液基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Blood DNA Kit DP318）進(jìn)行血液基因組DNA的提取，所提取的DNA需要用紫外線分光光度計(jì)測(cè)定濃度及純度，使得DNA的A260/280在1.8-2.0。將待測(cè)樣本的基因組DNA、空表對(duì)照、弱陽(yáng)性對(duì)照分別加入已裝有4種PCR反應(yīng)液的反應(yīng)管中，加入量為2μl/孔，待測(cè)樣本的基因組DNA濃度為5-15ng/μl。蓋好PCR反應(yīng)管蓋，記錄樣本加樣情況。將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到核酸擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。若PCR反應(yīng)管內(nèi)加入模板后遇到臨時(shí)情況不能立即上機(jī)，需將加好模板的PCR反應(yīng)管放于2℃-8℃條件下暫時(shí)保存，并在24h內(nèi)盡快上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。將PCR反應(yīng)管放置在儀器樣品上開(kāi)始進(jìn)行PCR擴(kuò)增，記錄好放置順序。開(kāi)始進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線，劃定合適基線（一般起始設(shè)定為3，終止設(shè)定為15）和熒光閾值（一般將閾值劃定在擴(kuò)增曲線對(duì)數(shù)形式下指數(shù)增長(zhǎng)期的中間），得到不同通道Ct值并按照相應(yīng)的表進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.2 LncRNA 抽取空腹靜脈血5ml于EDTANa2抗凝，分離血清，并用2個(gè)新的EP管分裝，于-80℃冰箱中保存。取出EP管解凍，加入Trizol試劑，顛倒混勻后再加入氯仿，劇烈震蕩，離心取上層無(wú)色液體至新EP管，加入異丙醇混勻離心棄上清液后加入焦碳酸二乙酯溶解，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒準(zhǔn)備逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，使用PCR進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 circRNA 抽取空腹靜脈血5ml于EDTANa2抗凝，在3000r/min的速率下離心10min，用Agilent Human circRNA芯片做檢測(cè)與分析，下一步進(jìn)行總RNA提取，并對(duì)芯片篩查結(jié)果做PCR驗(yàn)證。

1.2.4 認(rèn)知功能評(píng)分 缺血性腦卒中患者治療3個(gè)月后對(duì)VD組患者進(jìn)行認(rèn)知功能評(píng)分，采用簡(jiǎn)明精神狀態(tài)量表（MMSE）進(jìn)行，總分30分，輕度（13-23分）、中度（5-12分）、重度（＜5分）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS20.0軟件分析數(shù)據(jù)。對(duì)照組Hard-Weinberg遺傳平衡定律吻合度采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料以()表示，行F檢驗(yàn)，兩組間比較行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以(%)表示，行χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組AopE基因頻率分布 經(jīng)χ2檢驗(yàn)，對(duì)照組AopE基因型頻率符合Hard-Weinberg遺傳平衡定律，P值分別為0.180和0.460。VD組以及NVD組AopEε4等位基因頻率均高于對(duì)照組（P＜0.05），VD組和NVD組AopEε3等位基因頻率均低于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組AopE基因頻率分布[n(%)]

2.2 各組AopE、circRNA、LncRNA水平比較 AopE、circRNA、LncRNA比較，VD組＞NVD組＞對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組AopE、circRNA、LncRNA水平比較()

表2 各組AopE、circRNA、LncRNA水平比較()

注：與對(duì)照組比，*P＜0.05；與NVD組比，#P＜0.05。

2.3 不同VD嚴(yán)重程度AopE、circRNA、LncRNA水平比較 AopE、circRNA、LncRNA比較，輕度認(rèn)知障礙組＜中度認(rèn)知障礙組＜重度認(rèn)知障礙組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 不同VD嚴(yán)重程度AopE、circRNA、LncRNA水平的比較()

表3 不同VD嚴(yán)重程度AopE、circRNA、LncRNA水平的比較()

注：與輕度障礙組比，*P＜0.05。

2.4 AopE、circRNA、LncRNA在VD中的診斷效能分析 AopE、circRNA、LncRNA聯(lián)合診斷VD的敏感度和特異度分別為70.00%和90.00%，AUC為0.855，其效能優(yōu)于各指標(biāo)單獨(dú)診斷效能（Z=4.736、4.024、3.963，P=0.000、0.000、0.013，均＜0.05）。見(jiàn)表4及圖1。

表4 AopE、circRNA、LncRNA診斷效能分析

圖1 AopE、circRNA和LncRNA在VD中診斷價(jià)值的ROC圖

3 討論

VD是僅次于阿爾茲海默病引起老年群體癡呆第二大病因[6]。隨著社會(huì)老齡化的推進(jìn)以及腦血管疾患的高發(fā)，VD的發(fā)病人數(shù)也與日俱增[7]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)60歲以上的人群中VD患病率約為2.44%，僅次于阿爾茲海默病相關(guān)性癡呆[8]。故而，現(xiàn)階段VD的早期診斷以及防治對(duì)于腦血管疾病的患者而言至關(guān)重要。截至目前，國(guó)內(nèi)外仍舊缺乏診斷VD的早期敏感指標(biāo)，據(jù)調(diào)查，VD患者中僅有1/3的群體能夠在早期接受及時(shí)的診斷及干預(yù)，大部分患者就診時(shí)均已處于VD晚期，給生活帶來(lái)了較大的困擾，亟需尋找敏感、有效、方便且經(jīng)濟(jì)的診斷指標(biāo)。

有學(xué)者指出，缺血性腦卒中的發(fā)生與AopE基因多態(tài)性相關(guān)，高血壓、糖尿病、高脂血癥、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化等作為缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因素，亦與AopE基因的多態(tài)性也存在一定的相關(guān)性[9-10]。在ε2、ε3、ε4這3種等位基因中，ε4親和力最高，ε2親和力最低，因此對(duì)于血脂代謝產(chǎn)生相反的影響[11]。本研究中，VD組以及NVD組AopEε4等位基因頻率均高于對(duì)照組（P＜0.05），VD組和NVD組AopEε3等位基因頻率均低于對(duì)照組（P＜0.05），提示AopE基因可能通過(guò)調(diào)控血脂參與缺血性腦卒中的發(fā)生與發(fā)展中[12]。LncRNA通常由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄而成，既往研究及學(xué)者均認(rèn)為其是“垃圾”分子[13]。近些年隨著分子技術(shù)的不斷發(fā)展，LncRNA的作用及生物學(xué)功能逐漸被挖掘。相關(guān)研究指出，LncRNA可廣泛存在于人類血液、體液以及組織中，且血漿LncRNA在經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融后仍能夠保持穩(wěn)定，且各類型的LncRNA通常在正常組織中為較低表達(dá)，但在阿爾茲海默癥患者海馬組織以及腦血管疾病患者腦組織中均呈高表達(dá)[14-16]。本研究中，LncRNA比較，VD組＞NVD組＞對(duì)照組（P＜0.05），提示VD組患者出現(xiàn)LncRNA高表達(dá)的情況，與上述學(xué)者的觀點(diǎn)較為吻合。circRNA含量豐富且具有較高的組織特異性，已成為研究熱點(diǎn)，在心臟病以及阿爾茲海默病等多種疾病中作用突出，同時(shí)也與腦血管疾病的病理過(guò)程有著密切的關(guān)系[17-18]。本研究依據(jù)MMSE評(píng)分對(duì)VD患者的認(rèn)知障礙情況進(jìn)行劃分，發(fā)現(xiàn)AopE、circRNA、LncRNA比較，輕度認(rèn)知障礙組＜中度認(rèn)知障礙組＜重度認(rèn)知障礙組（P＜0.05），提示隨著認(rèn)知障礙的加重，AopE、circRNA以及LncRNA的水平也隨之上升并參與VD患者認(rèn)知障礙的進(jìn)展中。為明確AopE、circRNA和LncRNA在VD疾患中的診斷價(jià)值，本研究繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，AopE、circRNA、LncRNA聯(lián)合診斷VD的敏感度和特異度分別為70.00%和90.00%，AUC為0.855，其效能優(yōu)于各指標(biāo)單獨(dú)診斷效能（P＜0.05），提示對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)有助于臨床中VD的診斷，盡早發(fā)現(xiàn)患者有無(wú)認(rèn)知障礙狀況的發(fā)生，保障患者生命安全[19-20]。

綜上所述，VD患者存在AopE、circRNA以及LncRNA表達(dá)異常升高的情況，上述指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)有助于臨床判斷VD患者有無(wú)認(rèn)知障礙情況的出現(xiàn)，便于后續(xù)治療的開(kāi)展，進(jìn)而促進(jìn)患者的預(yù)后。但對(duì)于AopE、circRNA以及LncRNA在VD患者中的病機(jī)尚未明了，需要后續(xù)更加深入以及擴(kuò)大樣本量的研究。