基于EPO介導(dǎo)的JAK2/STAT5信號通路研究百會、大椎刺絡(luò)促缺血性腦卒中后血管新生的調(diào)控機(jī)制

王保國，曹 奕，陳倩倩，張靜波，高 紡，張 璨，施婧婧，周文婷

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012)

缺血性腦卒中是臨床常見的一種缺血性腦血管病，占急性腦血管病的70%左右，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點(diǎn)，給社會帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。缺血性腦卒中后缺血區(qū)域血管新生具有至關(guān)重要的作用，是保證缺血腦組織在短時(shí)間內(nèi)重新獲取氧分的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，側(cè)支血管的建立可改善缺血區(qū)域微循環(huán)，增加局部腦缺血區(qū)血流灌注，從而促進(jìn)機(jī)體神經(jīng)功能缺損癥狀的恢復(fù)[2]。腦梗死后缺血區(qū)域血管新生是由多種生物因子及多條信號通路共同參與的復(fù)雜過程[3]。促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種由肝臟、腎臟分泌的酸性糖蛋白，與其相應(yīng)受體結(jié)合后可使相鄰受體發(fā)生同源二聚化，導(dǎo)致JAK酪氨酸激酶激活，JAK是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，該族成員有7個(gè)同源區(qū)，其中2區(qū)為偽激酶區(qū)，因其既能催化與之相連的細(xì)胞因子受體發(fā)生酪氨酸磷酸化，從而激活多個(gè)下游信號通路，其中JAK2及其介導(dǎo)的STAT5通路是常見的下游信號通路之一，而此信號通路是目前已發(fā)現(xiàn)的與血管新生有關(guān)的一條分子信號通路[4]。有學(xué)者運(yùn)用EPO對大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注模型(middle cerebral artery occlusion/reperfusion model，MCAO/R)大鼠進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，缺血區(qū)域存在血管新生現(xiàn)象，同時(shí)研究[5]證實(shí)了小鼠腦缺血區(qū)域血管新生現(xiàn)象與EPO介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化有關(guān)。

近些年來中醫(yī)臨床對于缺血性腦卒中的治療也在逐步發(fā)展，針灸作為臨床常見中醫(yī)療法之一，其干預(yù)缺血性腦卒中機(jī)制是一種多種途徑共同參與的復(fù)雜過程，如改善缺血區(qū)微循環(huán)、促進(jìn)缺血區(qū)血管新生、對抗腦缺血后炎癥反應(yīng)、保護(hù)腦組織、改善神經(jīng)功能缺損、改善血液流變性[6]。中醫(yī)刺絡(luò)療法具有活血化瘀、祛瘀生新之功，結(jié)合督脈上通于腦竅的特性，取其要穴百會、大椎進(jìn)行刺絡(luò)治療，可使腦竅“瘀血祛、新血生”，以達(dá)祛瘀生新之效。前期研究[7]表明，百會、大椎刺絡(luò)可調(diào)節(jié)缺血性腦卒中患者腦組織氧合血紅蛋白飽和度及血流量，改善血液流變學(xué)的各項(xiàng)指標(biāo)，能顯著改善患者的神經(jīng)功能缺損癥狀，但其作用機(jī)制仍不清晰。因此，為進(jìn)一步研究百會、大椎刺絡(luò)改善缺血性腦卒中后血管新生的作用機(jī)制，本研究以EPO介導(dǎo)的JAK2/STAT5信號通路調(diào)控血管新生的機(jī)制為切入點(diǎn)，探討百會、大椎刺絡(luò)治療缺血性腦卒中的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 試劑 蘇木精染色液(批號 BA-4041)、伊紅染色液(醇溶性)(批號 BA-4022)：Baso；中性樹膠(批號 10004160)：國藥集團(tuán)；Trizol(批號 15596018)：Life technogies；SYBR Green染料(批號 E096-01B)：novoprotein；RNA引物：上海生工生物工程股份有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(批號 RR047A)：TaKaRa；P-JAK2(批號 ab32101)：Abcam；P-STAT5(批號 bs-5620R)：北京博奧森生物技術(shù)有限公司；血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothetial grow factor,VEGF)(批號 SC-7269)：Santa Cruz；β-actin(批號 TA-09)、山羊抗兔IgG(批號 ZB-2301)、山羊抗小鼠IgG(批號 ZB-2305)：北京中杉生物技術(shù)有限公司；ECL超敏發(fā)光試劑盒(批號 340958)：Thermo。

1.2 儀器 生物組織自動脫水機(jī)(ZT-12M)、生物組織包埋機(jī)(YB-7LF)、生物組織烤片機(jī)(YT-7FB)：湖北亞光；徠卡切片機(jī)(RM2016)：Leica；顯微鏡(CX41)：OLYMPUS；高速冷凍離心機(jī)(JW-3021HR)：安徽嘉文儀器裝備有限公司；熒光定量PCR儀(PIKOREAL 96)：Thermo Scientific；普通PCR儀(K960)：杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；超微量分光光度計(jì)(OD1000+)：南京五義科技有限公司；Western電泳儀(EPS300)、轉(zhuǎn)膜儀(VE-186)：上海天能科技有限公司；自動曝光儀(JS-1070P)：上海培清科技有限公司。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 SD雄性大鼠150只，SPF級，體質(zhì)量(220±20)g，日齡42～49 d，購于江蘇省邳州市東方養(yǎng)殖有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2017-0003。實(shí)驗(yàn)動物在安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為Ⅱ級，光照周期12 h/12 h，室溫為22～25 ℃，相對濕度為45%～60%，自由進(jìn)食、飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后將150只SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組、模型對照組、刺絡(luò)治療組、刺絡(luò)+EPO拮抗組，每組30只。

2.2 模型制備及干預(yù)方法 正常對照組不進(jìn)行手術(shù)，假手術(shù)組僅分離血管而不插線栓，模型對照組、刺絡(luò)治療組、刺絡(luò)+EPO拮抗組采用改良的Zea-Longa法制備MCAO/R模型大鼠，并參考經(jīng)典的Zea-Longa法判定模型成功與否[8-10]。模型制備后刺絡(luò)治療組、刺絡(luò)+EPO拮抗組采用“百會”“大椎”穴刺絡(luò)進(jìn)行干預(yù)，取穴標(biāo)準(zhǔn)參照《常用動物腧穴圖譜》[11]。將大鼠固定于鼠板上，采用特制的大鼠頭部固定器固定大鼠頭部，在保持其清醒狀態(tài)下剃毛標(biāo)記，百會、大椎穴采用0.45號一次性使用無菌注射針(江蘇蘇云醫(yī)療器材有限公司，生產(chǎn)批號：20200221)點(diǎn)刺，使其出血，每次每穴1滴(出血量為0.05 mL)，每隔24 h進(jìn)行刺絡(luò)治療1次，連續(xù)治療3周，并于取材前1 h進(jìn)行最后1次刺絡(luò)治療。刺絡(luò)+EPO拮抗組在刺絡(luò)前將脂質(zhì)體-siEPO2復(fù)合物按5 mg/kg劑量對大鼠進(jìn)行腹腔注射，使之進(jìn)入合成EPO的靶細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)引起針對EPO的RNA干擾效應(yīng)。

2.3 取材及指標(biāo)檢測

2.3.1 組織取材 采用2%戊巴比妥鈉按2 mL/kg劑量腹腔注射麻醉大鼠后，剪開腹腔，腹主動脈放血后斷頭處理大鼠，每組取一半大鼠全腦于4%多聚甲醛(預(yù)冷)中固定24 h后常規(guī)脫水、石蠟包埋制作切片(厚度為5 μm)；每組另一半大鼠取左腦頂葉組織置于凍存管中，保存于-80 ℃冰箱中。

2.3.2 蘇木精-伊紅染色觀察各組大鼠腦皮質(zhì)病理形態(tài) 將各組大鼠腦皮質(zhì)組織樣品在冰凍切片條件下完成均質(zhì)化，進(jìn)行固定、組織脫水、包埋，待蠟液出現(xiàn)凝固層后，冰浴凝固，用加熱的外科刀按組織塊位置修整蠟片，然后浸入蘇木精染液與伊紅染液染色5 min，1%鹽酸乙醇溶液分化數(shù)秒，稀碳酸鋰水溶液藍(lán)化30 s，純水沖洗后入伊紅染色液(醇溶性)染色10～30 s，95%乙醇Ⅰ、Ⅱ中各調(diào)色約10 s，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ中各脫水2 min，苯酚-二甲苯、二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各透明2 min，中性樹膠封片，使用顯微鏡進(jìn)行拍照以觀察腦皮質(zhì)組織病理狀態(tài)。

2.3.3 RT-PCR法檢測各組大鼠缺血腦皮質(zhì)中EPO、VEGF的mRNA表達(dá)水平 取樣本加入適量TRIzol試劑，通過勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿處理，隨后進(jìn)行分層、沉淀、清洗及溶解等步驟制得RNA備用，制備過程注意使用無酶槍頭。取制備好的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后加入SYBR Green染料與VEGF、EPO及β-actin上下游引物混合離心(引物序列見表1)，隨后于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，循環(huán)完成后作溶解曲線。以采集到的熒光信號值進(jìn)行相對定量分析。

表1 所選基因引物序列

2.3.4 Western Blot法檢測各組大鼠腦皮質(zhì)中P-JAK2、P-STAT5、VEGF蛋白表達(dá)水平 取100 mg組織，加入600 μL RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)后勻漿，提取蛋白，測量蛋白濃度，沸水浴變性后備用。將提取的總蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉，分別孵育P-JAK2、P-STAT5、VEGF及β-actin(1∶1 000)抗體，4 ℃過夜。洗膜，室溫孵育二抗1.5 h(山羊抗小鼠1∶20 000，山羊抗兔1∶20 000)。洗膜，均勻涂抹ECL超敏化學(xué)發(fā)光液，于成像系統(tǒng)曝光拍照，使用Image J軟件對各組蛋白的相對灰度值進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠腦皮質(zhì)病理形態(tài)學(xué)觀察 正常對照組與假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量多，排列整齊，形態(tài)基本正常，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央；模型對照組及刺絡(luò)+EPO拮抗組大鼠腦組織疏松，神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核固縮，顏色深染。與模型對照組相比，刺絡(luò)治療組腦組織形態(tài)明顯恢復(fù)，細(xì)胞核固縮較模型組程度低，神經(jīng)細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)消失但大體形態(tài)存在。見圖1。

3.2 各組大鼠腦皮質(zhì)中EPO、VEGF mRNA表達(dá)水平比較 與正常對照組比較，假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)中EPO、VEGF mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，模型對照組大鼠腦皮質(zhì)中EPO、VEGF mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型對照組比較，刺絡(luò)治療組大鼠腦皮質(zhì)中EPO、VEGF mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步升高(P<0.05)；與刺絡(luò)治療組比較，刺絡(luò)+EPO拮抗組大鼠腦皮質(zhì)中EPO、VEGF mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。見圖2。

注:A.正常對照組;B.假手術(shù)組;C.模型對照組;D.刺絡(luò)治療組;E.刺絡(luò)+EPO拮抗組;箭頭所示為神經(jīng)細(xì)胞核固縮

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05；與刺絡(luò)治療組比較，#P<0.05

3.3 各組大鼠腦皮質(zhì)中P-JAK2、P-STAT5、VEGF蛋白表達(dá)水平比較 與正常對照組比較，假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)中P-JAK2、P-STAT5、VEGF蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，模型對照組大鼠腦皮質(zhì)中P-JAK2、P-STAT5、VEGF蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型對照組比較，刺絡(luò)治療組大鼠腦皮質(zhì)中P-JAK2、P-STAT5、VEGF蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高(P<0.05)；與刺絡(luò)治療組比較，刺絡(luò)+EPO拮抗組大鼠腦皮質(zhì)中P-JAK2、P-STAT5、VEGF蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見圖3。

注：A.正常對照組；B.假手術(shù)組；C.模型對照組；D.刺絡(luò)治療組；E.刺絡(luò)+EPO拮抗組；與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05；與刺絡(luò)治療組比較，# P<0.05

4 討論

缺血性腦卒中是中國常見的老年患者突發(fā)疾病，《中國腦卒中防治報(bào)告(2019)》中指出，中國缺血性腦卒中的發(fā)病率、致殘率與死亡率均處于較高水平[12]。因此，有效的預(yù)防和治療方法及其作用機(jī)制是目前臨床研究的熱點(diǎn)。對于缺血性腦卒中，缺血是腦卒中的始因和核心，并貫穿疾病病理演變的全過程[13]。本研究通過改良的Zea-Longa法制備MCAO/R模型大鼠作為研究對象，研究結(jié)果顯示，模型對照組大鼠腦皮質(zhì)病理損傷明顯，提示MCAO/R大鼠模型復(fù)制成功。國內(nèi)研究結(jié)果顯示，刺絡(luò)療法可改變微循環(huán)障礙，減輕紅細(xì)胞聚集現(xiàn)象，增加血氧含量，并減少血管滲出，從而改善腦梗死患者的血液高凝狀態(tài)[14-15]。另有研究[16]認(rèn)為，刺絡(luò)療法可能是通過血流動力學(xué)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分泌功能，進(jìn)而強(qiáng)化血管功能，改善局部微循環(huán)。中醫(yī)針灸理論中，百會穴為“百穴之巔”[17]，大椎穴為“諸陽之會”[18]，兩穴同為督脈要穴。兩穴合用，取其刺絡(luò)，可瀉陽之亢、祛絡(luò)之瘀，以達(dá)祛瘀生新之效。本研究顯示，通過百會、大椎刺絡(luò)治療，MCAO/R大鼠腦組織、神經(jīng)細(xì)胞等病理損傷情況得到顯著改善。

血源性EPO作為一種巨大糖蛋白，有研究[19]表明，在腦缺血后EPO因?yàn)檠X屏障的破壞而進(jìn)入腦部，并與特異性受體結(jié)合，以胞吞等方式通過血腦屏障運(yùn)輸?shù)竭_(dá)腦靶位起到保護(hù)受損腦組織的作用。EPO與受體結(jié)合后引起受體的構(gòu)象發(fā)生改變，促使相鄰的2個(gè)受體互相靠近發(fā)生同源二聚化，導(dǎo)致2個(gè)JAK2 酪氨酸激酶激活，然后促紅細(xì)胞生成素受體的多個(gè)酪氨酸殘基被磷酸化，激活JAK/STAT通路，促進(jìn)紅系祖細(xì)胞的增殖和分化[20]。本研究結(jié)果顯示，MCAO/R大鼠腦皮質(zhì)區(qū)EPO、P-JAK2、P-STAT5的表達(dá)水平顯著上升，百會、大椎刺絡(luò)治療后，MCAO/R大鼠腦皮質(zhì)區(qū)EPO、P-JAK2、P-STAT5的表達(dá)水平進(jìn)一步上升。而當(dāng)通過EPO抑制劑抑制EPO的表達(dá)時(shí)，大鼠腦組織中P-JAK2與P-STAT5表達(dá)水平顯著降低，提示EPO能通過介導(dǎo)JAK2/STAT5通路發(fā)揮作用。

VEGF是一種分泌的二聚體蛋白，參與許多生物學(xué)過程，如維持內(nèi)皮細(xì)胞完整性，增加微血管密度，提高短暫性腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞存活[21-23]。其不僅能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，增加血管通透性，最主要的功能還是參與血管新生。研究[24-25]表明，VEGF還是JAK/STAT通路下游的關(guān)鍵因子。本研究結(jié)果顯示，百會、大椎刺絡(luò)能夠顯著提升MCAO/R大鼠腦皮質(zhì)區(qū)的VEGF水平，提示局部血管新生水平增加，當(dāng)通過EPO抑制劑抑制EPO表達(dá)時(shí)，大鼠腦組織中VEGF表達(dá)水平顯著降低，提示抑制EPO的表達(dá)能夠抑制MCAO/R大鼠梗死區(qū)域血管新生。

綜上所述，百會、大椎刺絡(luò)治療MCAO/R模型大鼠能夠促進(jìn)腦血管新生，其機(jī)制可能與上調(diào)EPO的表達(dá)，激活JAK2/STAT5信號通路有關(guān)。