普通煙草茉莉酸生物合成途徑3個(gè)基因的分子克隆、表征和表達(dá)分析

武兆云， 孫聚濤， 張智強(qiáng)， 薛 剛， 楊鐵釗

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南鄭州 450002)

茉莉酸主要包括茉莉酸甲酯(MeJA)及其前體茉莉酸(JA)。作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，茉莉酸在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著明顯作用，如種子萌發(fā)、花粉發(fā)育等，并能應(yīng)對(duì)病原體感染、機(jī)械和害蟲(chóng)、非生物脅迫等。JA生物合成途徑始于-亞麻酸，由質(zhì)體內(nèi)的13-脂肪氧化酶(LOX)催化，游離-亞麻酸轉(zhuǎn)變成13-氫-過(guò)氧十八碳三烯酸[13-(OOH)-18 ∶3]。隨后，丙二烯氧化合酶(AOS)將13-(OOH)-18 ∶3轉(zhuǎn)化為高度不穩(wěn)定的丙二烯氧化中間體，隨后該中間體受到丙二烯氧化環(huán)化酶(AOC)的作用，產(chǎn)生12-氧代植物二烯酸(12-oxophytodienoic acid，12-OPDA)。OPDA隨后從質(zhì)體輸送到過(guò)氧化物酶體中，在過(guò)氧化物酶體中，OPDA被OPDA還原酶3(OPR3)還原，然后經(jīng)過(guò)3輪β-氧化，產(chǎn)生JA。

JA與植物非生物脅迫密切相關(guān)。在非生物脅迫中，干旱對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量的制約最大。關(guān)于玉米的研究結(jié)果表明，在干旱脅迫下，4個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)，在伸長(zhǎng)組織、成熟組織中的表達(dá)量最高。在干旱條件下，植物的整體LOX活性和丙二醛(MDA)含量與轉(zhuǎn)錄水平之間存在密切關(guān)系。因此可見(jiàn)，茉莉酸含量可能會(huì)隨脂質(zhì)氧化脅迫而增加，因?yàn)檐岳蛩岬纳锖铣砂趸铣?。缺氧?duì)植物生長(zhǎng)有嚴(yán)重的不利影響，并會(huì)造成嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)損失。最近的研究結(jié)果表明，外源茉莉酸甲酯可以增強(qiáng)野生型擬南芥對(duì)再氧化的耐受性，并且在JA生物合成過(guò)程中的突變體對(duì)再氧化表現(xiàn)出更高的敏感性。鋁毒性是限制酸性土壤作物生產(chǎn)的另一個(gè)主要因素。根據(jù)JA生物合成或信號(hào)傳導(dǎo)中突變?nèi)毕莸谋硇头治鼋Y(jié)果，JA在調(diào)節(jié)鋁脅迫下的根生長(zhǎng)抑制中發(fā)揮作用，外源施用JA增強(qiáng)了鋁脅迫下的擬南芥根生長(zhǎng)抑制。

作為植物生長(zhǎng)和發(fā)育的關(guān)鍵大量營(yíng)養(yǎng)元素，鉀參與許多生理過(guò)程，包括酶激活、膜電勢(shì)維持、電中和、氣孔運(yùn)動(dòng)和滲透調(diào)節(jié)。迄今還沒(méi)有文獻(xiàn)闡明JA信號(hào)在植物缺鉀中的作用，本研究旨在分析、和基因的分子特性和表達(dá)模式，了解其在煙草低鉀脅迫下的調(diào)控作用，從而揭示JA合成途徑參與煙草低鉀脅迫的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料和培養(yǎng) 將表面消毒的煙草種子(品種：ND202、NC89)播種在無(wú)菌培養(yǎng)皿中。NC89屬于耐低鉀品種，ND202屬于低鉀敏感品種。將煙草種子置于K充足(Hoagland配方，K濃度為 6 mmol/L)或低K(記為L(zhǎng)K，K濃度為125 μmol/L)的培養(yǎng)基上。LK培養(yǎng)基由Hoagland培養(yǎng)基改良而成，添加1%(質(zhì)量濃度)瓊脂。

將幼苗置于相對(duì)濕度為70%的生長(zhǎng)室中，在 28 ℃ 條件下光照培養(yǎng)16 h，然后在21 ℃條件下黑暗培養(yǎng)8 h。光照度約為100 μmol/(m·s)，7 d后收獲新鮮的根，用于基因克隆。本試驗(yàn)于2021年3—8月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院育種試驗(yàn)室開(kāi)展。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆 使用()、()、()核苷酸序列作為查詢序列，進(jìn)行NCBI BLAST搜索(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，旨在識(shí)別煙草核苷酸收集NR/NT數(shù)據(jù)庫(kù)中包含、和直向同源物的序列，從而搜尋出(X84040)、(AB778304)和(AJ308487)。

用3對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增：，上游引物5′-C G T T T T T C T T G G A A G G T T A T T G A G A G A G-3′，下游引物5′-A C A A T T T A G A A C T G G G C A C T T T G T G-3′；，上游引物5′-A T G G C A G T A G C A A C A G C A A C-3′，下游引物5′-C T A A G C T C T C T T C A A A G A G G T T A T A G-3′；，上游引物5′-C C A A C A C A T T T G C A A G T T C A T T C C-3′，下游引物5′-A G A G G A A A C G A T G A A C T T A C A T T G G-3′。

從普通煙草(L.)cDNA模板中擴(kuò)增全長(zhǎng)cDNA，使用擴(kuò)增整個(gè)cDNA序列的引物，然后將、和的擴(kuò)增片段克隆到pMD-19 Simple T載體(TaKaRa)中進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 用ClustalW進(jìn)行多序列比對(duì)分析，用MEGA 7構(gòu)建、和進(jìn)化樹(shù)，設(shè)1 000次重復(fù)，使用默認(rèn)參數(shù)。用ANTHERPROT進(jìn)行氨基酸序列分析。用Interpro (http：//www.ebi.ac.uk/interpro/)掃描蛋白質(zhì)序列以獲取結(jié)構(gòu)信息，用TargetP 1.1服務(wù)器(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)分析預(yù)測(cè)包含N端前序的序列。用WoLF PSORT (https：//wolfpsort.hgc.jp/)確認(rèn)3種酶可能的亞細(xì)胞定位。采用全自動(dòng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同源建模服務(wù)器 SWISS-MODEL(https：//www.swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行NtLOX、NtAOS和NtAOC的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.2.3 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建 PCR生成的包含開(kāi)放閱讀框(ORF)的-片段、包含開(kāi)放閱讀框的Ⅰ-Ⅰ片段和包含NtAOC開(kāi)放閱讀框的Ⅰ-Ⅰ片段已被亞克隆到質(zhì)粒 pCAMBIA1305.1-GUSPlus上。使用的引物如下：，上游引物5′-G G G G T A C C A T G T T T C T T G G A G A A G A T T G T G-3′，下游引物5′-G G G G T A C C C T A T A T G A C A C A C T G T T A G G-3′；，上游引物 5′-A A C T G C A G A T G G C A G T A G C A A C A G C A A C-3′，下游引物 5′-A A C T G C A G C T A A G C T C T C T T C A A A G A G G T-3′；，上游引物5′-G G G G T A C C A T G G C C A C T G C C T C C T C A G-3′，下游引物 5′-A A C T G C A G T C A A T T A G T G A A A T T T T T C A G G-3′。引物 M13-R 用于識(shí)別片段插入方向，基因融合表達(dá)由CaMV35S啟動(dòng)子控制。

1.2.4 表達(dá)分析 在處理3、4、5、6周后(weeks after treatment，WAT)收獲幼苗。TRIzol? 試劑(Invitrogen公司，美國(guó))用于從植物樣品中提取RNA。用基因特異性引物對(duì)目的基因、、和(登錄號(hào)：XM_016618658)進(jìn)行qRT-PCR。在PCR中，使用 SYBR? Premix ExⅡ (TaKaRa Cat.RR820A)試劑盒配制反應(yīng)溶液，使用StepOnePlus系統(tǒng)(應(yīng)用生物系統(tǒng))進(jìn)行PCR，共設(shè)3次技術(shù)重復(fù)。將表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為，然后使用 方法計(jì)算倍數(shù)變化。將以下基因特異性引物對(duì)用于qRT-PCR：，5′-T G C C C T C A G T T C T T G A T G G A G T-3′和5′-C T T T G C T G C G T T T C C C T T G T-3′；，5′-G T T C G T C C C A T T A C A C T C T C-3′和5′-A G G A T C G G A A A A C T C T T G C C-3′；，5′-C T C C A C C A A C T C C A A G T C A T-3′和5′-C C C C T T T C T T T T C C T C T T C G-3′；和，5′-A A G G G A T G C G A G G A T G G A-3′和5′-C A A G G A A A T C A C C G C T T T G G-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列的克隆和生物信息學(xué)分析

在普通煙草中鑒定了JA合成途徑中3個(gè)關(guān)鍵的基因，分別為、和。長(zhǎng)2 831 bp，有1個(gè)可編碼862個(gè)氨基酸的ORF，其相對(duì)分子量為97.6 ku。、的長(zhǎng)度分別為1 569、983 bp(圖1)。、分別編碼522、245個(gè)氨基酸的ORF，相對(duì)分子量分別為58.9、26.5 ku。

NtLOX與來(lái)自普通煙草、番茄()、辣椒()和漸狹葉煙草()的脂肪氧化酶具有最大的相似度。煙草脂氧合酶與白黃麻()具有更高的同一性，NtLOX與CcLOX(登錄號(hào)：OMO62561)的氨基酸序列同一性為73%。

NtAOS與來(lái)自普通煙草、馬鈴薯()、辣椒和漸狹葉煙草的丙二烯氧化合酶具有最高的相似度。NtAOS與甜瓜具有較高的氨基酸序列同一性，NtAOS與CmAOS1(登錄號(hào)：NP_001315375)之間有68%的氨基酸序列同一性。

NtAOC與來(lái)自普通煙草、馬鈴薯、番茄、莨菪()和長(zhǎng)春花()的脂肪氧化酶具有最大的相似性。煙草AOC與蒺藜苜蓿()的同一性更高，NtAOC與MtAOC(登錄號(hào)CAI29046)的氨基酸序列同一性為65%。

圖2-A顯示了NtLOX與其他植物物種特征蛋白之間的關(guān)系，其中NtLOX與NbLOX之間的關(guān)系最密切。圖2-B顯示了NtAOS與其他植物物種特征蛋白之間的關(guān)系，其中NtAOS與NaAOS之間的關(guān)系最密切。圖2-C顯示了NtAOC與其他植物物種的特征蛋白之間的關(guān)系，其中NtAOC與StAOC、SlAOC、HnAOC、LcAOC之間的關(guān)系最密切。

2.2 NtLOX、NtAOS和NtAOC的結(jié)構(gòu)分析

Interpro序列分析和分類(lèi)結(jié)果顯示，NtLOX屬于植物脂肪氧化酶家族(結(jié)構(gòu)域編號(hào)：IPR001246)。NtLOX包含3個(gè)域：PLAT/LH2域(結(jié)構(gòu)域編號(hào)：IPR001024，17～173位氨基酸)、結(jié)構(gòu)域3(結(jié)構(gòu)域編號(hào)：IPR027433，289～378位氨基酸)和C端(結(jié)構(gòu)域編號(hào)：IPR013819，163～862位氨基酸)(圖3-A)。此外，在NtLOX的518～532位氨基酸處發(fā)現(xiàn)了1個(gè)鐵結(jié)合位點(diǎn)。GO途徑和分子功能預(yù)測(cè)結(jié)果表明，NtLOX參與氧化還原過(guò)程(GO：0055114、0016702)。NtAOS是細(xì)胞色素P450、E類(lèi)、Ⅳ組(結(jié)構(gòu)域編號(hào)：IPR002403)家族成員(圖3-B)。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，NtAOS的57～506位氨基酸將其歸類(lèi)為SSF48264超家族的一部分。與NtLOX類(lèi)似的是，NtAOS參與氧化還原過(guò)程(GO：0055114、0016705)。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，NtAOC的73～245位氨基酸可能編碼屬于SSF141493超家族的域。分子功能分析結(jié)果表明，NtAOC具有異構(gòu)酶活性(GO：0016853，圖3-C)。

蛋白激酶C、酪氨酸激酶和酪蛋白激酶Ⅱ誘導(dǎo)的磷酸化以及-肉豆蔻?；稽c(diǎn)在NtLOX、NtAOS和NtAOC中高度保守。除了所有3種蛋白質(zhì)共有的位點(diǎn)外，筆者還在NtLOX中發(fā)現(xiàn)了另外2個(gè)位點(diǎn)，即-糖基化位點(diǎn)、依賴(lài)于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。

使用TargetP 1.1服務(wù)器分析NtLOX的亞細(xì)胞定位，分別獲得了概率值為 0.134、0.093和0.040的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(cTP)、線粒體靶向肽(mTP)和信號(hào)肽(SP)。NtAOS的TargetP 1.1分析得出的cTP、mTP、SP概率值分別為0.802、0.148、0.127，表明NtAOS最有可能位于葉綠體上。NtAOC的TargetP 1.1分析得出的cTP、mTP、SP概率值分別為0.954、0.044、0.005，表明NtAOC位于葉綠體中。WoLF PSORT被用于進(jìn)一步預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示，NtAOS、NtAOC明確定位于葉綠體上，而NtLOX定位于細(xì)胞質(zhì)上。不同LOX蛋白在不同細(xì)胞器中發(fā)揮著不同的作用，擬南芥基因組至少包含4個(gè)基因，其中位于細(xì)胞質(zhì)中，位于質(zhì)體基質(zhì)中。與類(lèi)似的是，、包含葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，但它們被視為質(zhì)體。在葉片衰老的過(guò)程中，的表達(dá)量明顯升高，而的表達(dá)量急劇下降。

NtLOX的SWISS-MODEL預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)與大豆脂氧合酶(LOX-3) 1rrl.1相似，在氨基酸模型-模板范圍內(nèi)具有65.33%的序列同一性(25～862位氨基酸，圖4-A)。NtAOS的全自動(dòng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同源性建模結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)與擬南芥AOS 3dsi.1具有結(jié)構(gòu)相似性，在氨基酸模型-模板范圍內(nèi)(57～522位氨基酸)中具有68.63%的序列同一性(圖4-B)。NtAOC的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同源性建模結(jié)果表明，它在結(jié)構(gòu)上與擬南芥AOC2 4cq6.1相似，在氨基酸模型-模板范圍內(nèi)(73～245位氨基酸)具有67.43%的序列同一性(圖4-C)。

2.3 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

將限制酶消化位點(diǎn)引入開(kāi)放閱讀框中，Ⅰ-Ⅰ、Ⅰ-Ⅰ和Ⅰ-Ⅰ位點(diǎn)分別被引入、和。每個(gè)基因序列通過(guò)PCR擴(kuò)增(圖5-A)，每個(gè)片段用相應(yīng)的限制酶消化(圖5-B)。將限制性片段亞克隆到質(zhì)粒pCAMBIA1305.1-GUSPlus中。用擴(kuò)增基因序列的引物鑒定成功轉(zhuǎn)化的含有所需質(zhì)粒的菌落(圖5-C)。其中引物M13-R用于確定、的插入方向。存在擴(kuò)增片段表明插入片段處于正向(對(duì)應(yīng)圖5-D，對(duì)應(yīng)圖5-E)。

2.4 NtLOX、NtAOS和NtAOC的表達(dá)分析

在鉀充足的條件下，煙草ND202的基因型比NC89的基因型積累了更多的鉀。然而，ND202比NC89對(duì)低鉀脅迫更敏感。有趣的是，在ND202、NC89植物中，、在鉀充足條件下的表達(dá)水平高于低鉀條件(ND202對(duì)應(yīng)圖6-A、圖6-C；NC89對(duì)應(yīng)圖6-B、圖6-D)。在鉀充足條件下，NC89的相對(duì)表達(dá)水平在4、5、6 WAT時(shí)分別是0.76、2.55、1.83倍(圖6-B、圖6-D)。在缺鉀條件下，ND202的、表達(dá)水平在4、5、6 WAT沒(méi)有明顯變化(圖6-C)。然而，在相同條件下，在5 WAT轉(zhuǎn)錄水平下表達(dá)水平明顯增加(圖6-C)，NC89在4 WAT的相對(duì)表達(dá)水平明顯改變并持續(xù)到6 WAT。值得注意的是，NC89的相對(duì)表達(dá)水平在4、5、6 WAT時(shí)分別是3.24、2.38、5.41倍(圖6-D)。上述結(jié)果表明，無(wú)論植物的基因型如何，在鉀充足的條件下，、的表達(dá)量都會(huì)增加(圖6-A、圖6-B)。在缺鉀條件下，與ND202敏感基因型相比，NC89耐受基因型的表達(dá)更為及時(shí)，并持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間。因此可見(jiàn)，的表達(dá)水平可能與植物對(duì)低鉀脅迫的抗性相關(guān)。

有文獻(xiàn)報(bào)道了擬南芥鋁脅迫3 h時(shí)，與根中JA合成相關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)，如、和。當(dāng)鋁脅迫持續(xù)6 h時(shí)，、和的表達(dá)水平下降。然而，鋁脅迫對(duì)與JA生物合成相關(guān)的其他基因的表達(dá)沒(méi)有影響，如、和。據(jù)報(bào)道，缺鉀植物中JAs、羥基-12-氧代-十八碳二烯酸和12-氧代-植物二烯酸的水平高于鉀充足的植物。在低鉀脅迫下，13-LOX途徑中的營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)存蛋白(vegetative storage protein，)、和其他酶的轉(zhuǎn)錄水平增加。與對(duì)照相比，在N、P或Ca缺乏條件下生長(zhǎng)2周的植物中，或的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有增加。然而，在缺鉀植物中，、轉(zhuǎn)錄本大大增加，分別編碼9-LOX和另一種 13-LOX，同種型的、沒(méi)有太大變化。本研究結(jié)果也表明，并非所有JA合成相關(guān)基因都對(duì)低鉀脅迫能作出反應(yīng)(圖 6-C、圖6-D)。

3 結(jié)論與討論

越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，JA在非生物脅迫中具有重要作用。淹水會(huì)導(dǎo)致植物缺氧，淹水后暴露于氧氣(即再充氧)中稱(chēng)為復(fù)氧。參與茉莉酸合成途徑的基因(包括、和)的轉(zhuǎn)錄水平在復(fù)氧過(guò)程中上調(diào)。外源性MeJA的應(yīng)用提高了擬南芥對(duì)復(fù)氧脅迫的耐受性，而缺乏JA 合成(如和)和信號(hào)通路(如和)的突變體對(duì)復(fù)氧的敏感性增加。編碼JA信號(hào)傳導(dǎo)所必需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。與野生型相比，MYC2-OE顯示出較少的損傷，而、突變體在再充氧4 d后顯示出更多的損傷。這些發(fā)現(xiàn)表明，JA通過(guò)激活抗氧化防御系統(tǒng)，成為植物對(duì)淹沒(méi)后復(fù)氧反應(yīng)必不可少的主要上游信號(hào)分子，這反過(guò)來(lái)又有助于減輕復(fù)氧引起的氧化損傷，進(jìn)而提高植物對(duì)復(fù)氧脅迫的耐受性。

干旱是作物生產(chǎn)力的主要限制因素。近期的研究發(fā)現(xiàn)，JA途徑參與了玉米的干旱脅迫。關(guān)于玉米微陣列的研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，編碼LOX同種型的6種LOX酶中的4種酶的基因(即、、和)的表達(dá)水平提高，在伸長(zhǎng)、成熟組織中、的表達(dá)水平最高?？侺OX活性和MDA含量緊隨響應(yīng)干旱的轉(zhuǎn)錄譜，向葉的成熟部分增加，表明干旱在葉片的所有區(qū)域誘導(dǎo)氧化損傷，成熟組織表現(xiàn)出最強(qiáng)的反應(yīng)。這些結(jié)果表明干旱脅迫會(huì)對(duì)葉片所有部分造成氧化損傷，在成熟組織中觀察到最強(qiáng)的反應(yīng)。有研究者觀察到隨著葉片的成熟脂質(zhì)過(guò)氧化，部分LOX活性增強(qiáng)。這些結(jié)果可以支持茉莉酸的產(chǎn)生是因?yàn)檐岳蛩嵘锖铣缮婕巴ㄟ^(guò)脂質(zhì)氧化合成脂氧合物(oxylipins)，特別是，其轉(zhuǎn)錄水平在脅迫條件下被顯著誘導(dǎo)，這是造成根中脅迫誘導(dǎo)茉莉酸積累的原因。

憑借與生長(zhǎng)素、乙烯的相互作用，茉莉酸對(duì)調(diào)節(jié)環(huán)境脅迫下的根系生長(zhǎng)發(fā)育極為有益。例如，由于鹽分脅迫，水稻生長(zhǎng)普遍受到限制。突變體對(duì)鹽脅迫表現(xiàn)出較弱的敏感性。和突變體可以在其葉片中積累少量Na，并且可以更好地清除鹽脅迫所產(chǎn)生的活性氧。在應(yīng)激傳導(dǎo)中，野生型葉片及JA突變體可以積累相似數(shù)量的脫落酸。在寬型葉片中，JA及其氨基酸結(jié)合物(JA-異亮氨酸)的水平變化不大。相比之下，野生型強(qiáng)烈誘導(dǎo)JA前體12-OPDA對(duì)鹽脅迫作出反應(yīng)，這在突變體中沒(méi)有出現(xiàn)。突變體中12-OPDA的缺失不僅與普遍增加的活性氧清除活性相關(guān)，而且與抗氧化途徑中特定酶的更高活性相關(guān)。外源JA加強(qiáng)了對(duì)鋁誘導(dǎo)的根生長(zhǎng)的抑制。此外，根據(jù)JA生物合成或信號(hào)傳導(dǎo)缺陷突變體的表型分析結(jié)果，JA參與調(diào)節(jié)了鋁誘導(dǎo)的根生長(zhǎng)抑制?？傊?，JA對(duì)于植物生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)是復(fù)雜的。

JA對(duì)非生物脅迫具有重要意義。本試驗(yàn)基于qRT-PCR分析了在缺鉀條件下2種基因型品種JA合成途徑3個(gè)基因的表達(dá)模式，耐低鉀基因型表達(dá)水平升高更早且持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，表明的表達(dá)水平可能與低鉀脅迫的耐性相關(guān)。