黃春陽，吳瑀婕，楊 彪，馬晶晶，楊 靜，鄒 燁,*，王道營,3,*，徐為民,3，羅 章

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2.江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室培育基地，江蘇 南京 210014；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品冷鏈物流技術(shù)重點實驗室，江蘇 南京 210014）

中國作為畜產(chǎn)品消耗大國，2020年豬肉產(chǎn)量超過 4 000 萬t，占全國肉類總產(chǎn)量一半以上。隨著人們生活質(zhì)量的提高及對健康飲食的追求，低脂肉制品的開發(fā)成為研究熱點。然而，降低肉制品脂肪含量嚴(yán)重影響肉品質(zhì)地與口感，可采用適當(dāng)?shù)闹咎娲飦肀ＷC肉品品質(zhì)。豬肉糜常作為豬肉加工制品的原料，其品質(zhì)受pH值、水分含量、肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)等因素的影響。傳統(tǒng)肉糜成分主要包括脂肪、組織和水，其中脂肪可以豐富食品的感官性狀、減少人體蛋白質(zhì)的消耗、促進(jìn)脂溶性維生素的溶解。然而，較高的飽和脂肪酸攝入不利于人體健康，易導(dǎo)致肥胖、心腦血管疾病等。肌原纖維蛋白是影響肉糜品質(zhì)的重要因素，也是豬肉中的主要蛋白，其凝膠和消化特性對最終產(chǎn)品的感官品質(zhì)和營養(yǎng)特性具有重要影響。

研究表明，非肉蛋白可以有效地與肉糜中的脂肪顆粒結(jié)合，影響肉糜保水性與黏性，使其具備更好的感官品質(zhì)和更高的產(chǎn)品得率。Jafarpour等通過使用非肉蛋白調(diào)控體系的凝膠性，影響食品獨特的形態(tài)、風(fēng)味及質(zhì)地等特征。劉廣娟等發(fā)現(xiàn)，在香腸和肉餅中添加4%大豆蛋白可在不影響產(chǎn)品風(fēng)味和特征的前提下，明顯提高產(chǎn)品保水性。Eisinanite等采用新型乳化法將乳清蛋白與植物油混合，制備形成的乳狀液可使豬肉腸具備較好的色澤穩(wěn)定性。本研究通過在肉糜中添加4 種不同添加量的非肉蛋白，評估pH值、色度、蒸煮損失、質(zhì)構(gòu)和凝膠微觀結(jié)構(gòu)等指標(biāo)變化，初步分析非肉蛋白最佳添加量；此外，基于肉糜肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)變化，分析非肉蛋白添加提升肉糜品質(zhì)的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮純種丹麥系長白豬里脊肉（6 月齡，宰后48 h）與豬肥膘，購自南京孝陵衛(wèi)菜市場，豬肉剔除表面結(jié)締組織和筋膜后待用。

血球蛋白粉（spray-dried blood cells，SBC）、大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）、蛋清蛋白 （egg white protein，EWP）、豬血漿蛋白（porcine plasma protein，PPP） 秦皇島金海食品有限公司；其余試劑均為分析純 南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CR-400色差儀 日本Knoica Minolta公司；Gen5 全波長酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek儀器有限公司；TVT-300XP質(zhì)構(gòu)儀 瑞典TexVol公司；T-25數(shù)顯勻漿機 德國IKA 公司；HI-9125酸度計 意大利Hanna公司；UniCenMR臺式冷凍離心機 德國Herolab公司；EVO-LS10掃描電子顯微鏡 德國Zeisse Oberkochen公司；NicoletiS-5傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 肉糜的制備

新鮮豬肉與肥膘切丁，其中瘦肉400 g、肥膘100 g。原料肉腌制時，參考孔保華等的肉糜制備方法：瘦肉中加入鹽3%、糖1.5%、亞硝酸鹽0.01%、異抗壞血酸鈉0.05%和復(fù)合磷酸鈉0.4%，肥肉中只加3%鹽。按肉的總質(zhì)量計，添加變性淀粉10%，冰水50%，分別添加1.0%、1.5%、2.0%（分別記作L、M、H組）4 種非肉蛋白（PPP、SBC、SPI和EWP），不添加非肉蛋白為對照組。

1.3.2 肉糜pH值測定

稱取3 g樣品置于50 mL塑料離心管中（內(nèi)含0.15 mol/L NaCl溶液15 mL），500 r/min低速均質(zhì)10 s。使用手持酸度計測定pH值，測定3 次取平均值。

1.3.3 肉糜色澤測定

使用色差儀測定肉糜色澤變化（、、分別表示肉糜亮度值、紅度值、黃度值）。色差儀測定前需經(jīng)白板（=98.99、=0.21、=1.10）校正，每份樣品隨機位置測定6 次取平均值。

1.3.4 肉糜蒸煮損失測定

取適量肉糜（，g）置于100 mL離心管中，于3 000 r/min離心10 min去除內(nèi)部空氣。將裝有肉糜的離心管于90 ℃恒溫水浴鍋中水浴20 min后迅速取出，冷卻至室溫，用濾紙吸干表面水分，經(jīng)冰箱平衡過夜后擦干表面水分稱質(zhì)量（，g）。蒸煮損失按下式計算。

1.3.5 肉糜凝膠質(zhì)構(gòu)測定

取上述熟制肉糜于室溫平衡2 h，使用金屬采樣器將其切割成直徑2.5 cm、高2 cm的圓柱體。使用配有P50型探頭的質(zhì)構(gòu)儀測定其硬度、彈性、黏附性和咀嚼性。測試條件如下：測前速率2.0 mm/s，測試速率5.0 mm/s，測后速率5.0 mm/s，壓縮比60%，觸發(fā)類型為自動，觸 發(fā)力10 g。

1.3.6 肉糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)觀察

將熟肉糜切成大小為5 mm×5 mm×3 mm的長方體小塊，經(jīng)液氮速凍后置于真空冷凍干燥機干燥。干燥后的樣品噴金鍍膜，使用掃描電子顯微鏡觀察凝膠微觀結(jié)構(gòu)變化，加速電壓10.0 kV，放大倍數(shù)200 倍。

1.3.7 肌原纖維蛋白的提取

參考伍夢婷等的方法并稍作修改。稱取10 g生肉糜，添加4 倍體積預(yù)冷的提取緩沖液A（0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl、1 mmol/L 乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸、6.1 mmol/L NaHPO·12HO、3.9 mmol/L NaHPO·2HO，pH 7.0），冰浴條件下10 000 r/min勻漿60 s，2 000×、4 ℃離心15 min，棄上清，取沉淀，重復(fù)上述操作2 次。將沉淀用8 倍體積pH 6.25的緩沖液B （0.1 mol/L NaCl、1 mmol/L NaN）冰浴勻漿后離心（條件同上），取沉淀重復(fù)該操作2 次，最后一次離心前需對均質(zhì)液進(jìn)行過濾除去雜質(zhì)。獲得的沉淀溶于緩沖液C （0.6 mol/L NaCl、15 mmol/L 哌嗪-,-(2-乙磺酸)，pH 6.25），其蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度用雙縮脲法測定，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。提取的肌原纖維蛋白溶液置于4 ℃冰箱，并在5 d內(nèi)使用完畢。

1.3.8 肌原纖維蛋白-非肉蛋白混合體系的制備

用緩沖液C將豬肉肌原纖維蛋白溶液質(zhì)量濃度調(diào)整為40 mg/mL，分別加入質(zhì)量濃度為1.2、1.6、2.0 mg/mL（記作L、M、H組）的非肉蛋白，不添加非肉蛋白為對照組，使用高速勻漿機于10 000 r/min勻漿60 s（每勻漿20 s間歇20 s），2 229 r/min低速離心5 min，去除混合蛋白溶液中的氣泡。置于冰浴條件下，并貯存在0～4 ℃環(huán)境中。

1.3.9 傅里葉變換紅外光譜測定

參考Zhao Xue等的方法，將上述混合蛋白溶液真空冷凍干燥，凍干樣品置于傅里葉變換紅外光譜儀中掃描，掃描范圍為4 000～500 cm，掃描64 次，掃描分辨率4 cm，以空氣為背景，獲取樣品紅外光譜圖。

1.3.10 紫外光譜測定

使用緩沖液C調(diào)整蛋白混合溶液質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，測定其紫外光譜。掃描范圍為200～700 nm，掃描間隔10 nm，循環(huán)1，時間間隔60 s，光程10 mm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24.0軟件（IBM公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、方差分析，應(yīng)用Origin 8.5軟件（Origin Lab公司）繪制圖表，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Tukey檢驗進(jìn)行多重比較，＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 非肉蛋白添加對肉糜pH值的影響

由圖1可知，與對照組相比，PPP組肉糜的pH值顯著提高，這主要是由于添加的PPP的pH值較高所致，可能是PPP的堿性基團與豬肉組織中的酸性成分發(fā)生反應(yīng)，引起肉中蛋白離子功能位點的變化，從而改變了肉品pH值。Porcella等報道表明，與不添加非肉蛋白組相比，添加SPI并沒有顯著提高pH值，與本實驗結(jié)果一致。與對照組相比，SBC組pH值提高，隨著添加量的增加pH值下降，但都影響甚微。Woodward等研究表明，EWP組在pH＜8時，形成的凝膠結(jié)構(gòu)粗糙，保水性差。EWP-M組和EWP-H組可明顯降低肉糜的pH值（pH＜8），與下文EWP保水性降低相符。

圖1 不同非肉蛋白添加量對肉糜pH值的影響Fig. 1 Influence of addition of non-meat proteins on pH value of minced meat

2.2 非肉蛋白添加對肉糜色澤的影響

肉品色澤反映了肉品新鮮度，良好的色澤可提高消費者的購買欲。由表1可知，與對照組相比，EWP組肉糜無顯著變化，而SBC組顯著下降，并且隨著SBC添加量的增大顯著下降。這可能是因為SBC添加量增加使游離水緊密結(jié)合在蛋白質(zhì)表面，從而減弱了光散射程度，導(dǎo)致減小。有研究表明，在肉中添加SPI會導(dǎo)致肉凝膠的降低，且隨SPI添加量的增多呈下降趨勢；張秋會等研究大豆組織蛋白對重組肉糜制品的作用效果時發(fā)現(xiàn)，隨著SPI添加量的提高，產(chǎn)品有所下降，這與本實驗結(jié)果趨勢一致。EWP組變化較大，添加EWP后降低了肉糜的，說明EWP使豬肉糜中的肌紅蛋白和血紅蛋白氧化程度不斷加重，逐漸變?yōu)榧t褐色，促使肉糜顏色變暗。由于SBC呈現(xiàn)紅色，從而導(dǎo)致SBC組顯著升高。除PPP組外，其余組均顯著低于對照組。非肉蛋白對于肉糜色澤的影響可能是由于蛋白粉本身的顏色為黃色或乳白色，加入肉糜后會削弱而提高，提高可能是由于EWP粉本身的偏高。

表1 不同非肉蛋白添加量對肉糜色澤的影響Table 1 Effects of additon of non-meat proteins on the color of minced meat

2.3 非肉蛋白添加對肉糜蒸煮損失的影響

肉糜保水性是評價肉糜品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，直接影響肉糜香味、多汁性、嫩度及產(chǎn)品得率。由圖2可知，相同條件下PPP組的肉糜蒸煮損失均低于對照組，其次是SPI-M和SBC-M組。這可能是由于這3 種蛋白填充了肉糜凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的空隙，蛋白具有較高吸水性，可以控制不易流動水，從而提高肉糜的持水能力，但過量非肉蛋白的添加反而會降低豬肉糜的持水能力。康壯麗等研究表明，SPI可用于改善肉品品質(zhì)，提高肉品質(zhì)構(gòu)和保水性。PPP組的蒸煮損失顯著低于對照組，這表明PPP參與了水分的保持，可與蛋白質(zhì)相互作用交聯(lián)，從而增加肉糜的系水能力，并將水分捕獲在三維網(wǎng)絡(luò)中，從而提高復(fù)合凝膠的蒸煮得率。添加EWP的肉糜保水性顯著降低，這與陳洪生等研究結(jié)果一致；高溫蒸煮使豬肉蛋白發(fā)生不可逆變性，而EWP具有較低的變性溫度，受熱后蛋白質(zhì)分子迅速聚集，過快的聚集速率導(dǎo)致氨基酸鏈還未完全展開就發(fā)生隨機交聯(lián)，從而形成較為粗糙的結(jié)構(gòu)。這些顯著的差異可能是由于所使用的蛋白質(zhì)類型和物理化學(xué)性質(zhì)不同。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-水相互作用，影響肉和肉制品的保水能力。SBC與肉糜中蛋白的相互作用對其保水性的影響不明顯。

圖2 不同非肉蛋白添加量對肉糜蒸煮損失的影響Fig. 2 Effects of addition of non-meat proteins on the cooking loss of minced meat

2.4 非肉蛋白添加對熟肉糜質(zhì)構(gòu)的影響

肉糜產(chǎn)品的品質(zhì)可以通過測定其質(zhì)構(gòu)特性來表征，其中硬度和彈性是熟肉糜質(zhì)構(gòu)最重要的2 個指標(biāo)。由表2可知，在硬度方面，非肉蛋白通過改變系統(tǒng)的組成部分、肉和非肉蛋白之間的相互作用影響熟肉糜的硬度，與對照組相比，添加SPI和PPP可以顯著提高肉糜的硬度。Samara等研究發(fā)現(xiàn)，添加SPI可以提高肉糜硬度，并且隨著添加量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與本研究結(jié)果一致。這可能是由于SPI中含有較多巰基，蒸煮過程中大量巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵，使分子間二硫鍵作用加強。添加EWP顯著降低了肉糜的硬度，組內(nèi)無顯著差異，這表明肉蛋白與EWP之間可能產(chǎn)生了拮抗作用，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用較弱，蛋白質(zhì)-水相互作用也明顯降低，與上文蒸煮損失結(jié)果一致。在黏附性方面，SBC組相比對照組顯著提高，SPI組和EWP組隨著非肉蛋白添加量的增加呈現(xiàn)增加趨勢。添加非肉蛋白有利于蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，從而增加肉糜的彈性和咀嚼性?？傮w而言，通過在肉糜中添加特定的非肉蛋白可以顯著提高凝膠強度、增加肉糜的黏附性、促進(jìn)蛋白分子間交聯(lián)。

表2 不同非肉蛋白添加量對熟肉糜質(zhì)構(gòu)參數(shù)的影響Table 2 Effects of addition of non-meat proteins on the textural parameters of cooked minced meat

2.5 非肉蛋白添加對熟肉糜微觀結(jié)構(gòu)的影響

通過掃描電子顯微鏡觀察添加不同種類非肉蛋白混合肉糜的微觀結(jié)構(gòu)，由圖3可知，與對照組相比，添加EWP的肉糜結(jié)構(gòu)孔隙更大、團聚明顯，肉糜結(jié)構(gòu)的粗糙度和表面不平整程度逐漸增加，孔洞周圍缺少交聯(lián)，并且不利于水分的截留，因而表現(xiàn)為硬度與保水性降低。SPI組和SBC組與對照組區(qū)別不明顯，有少許黏連。隨著PPP添加量的增加，聚集體逐漸減少，孔洞周圍出現(xiàn)更多交聯(lián)，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密、有序。這可能與血漿蛋白能夠形成較多的化學(xué)鍵以及具備良好的溶解性能密切相關(guān)。PPP與肉糜中的蛋白質(zhì)交聯(lián)，形成致密而均勻的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，阻斷水分子的遷移和滲出。血漿可吸收蛋白質(zhì)變性過程中滲出的水分，從而大大減少因失水而形成的氣孔，提高蒸煮得率。Salvador等研究凝膠結(jié)構(gòu)和保水性的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)致密的凝膠更容易截留水分，因此具有較高的保水性。本研究微觀結(jié)構(gòu)和保水性的趨勢基本一致。此外，蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)也可能受蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)間的熱相容性及蛋白質(zhì)溶解性等因素的影響。

圖3 不同非肉蛋白添加量對肉糜微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig. 3 Effects of additon of non-meat proteins on the microstructure of minced meat

2.6 混合蛋白體系的紅外光譜變化

傅里葉變換紅外光譜可有效描述蛋白質(zhì)的變性過程，特別是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化。由圖4可知，特征峰變化主要在1 500～1 600 cm處的酰胺Ⅱ帶、1 600～1 700 cm處的酰胺Ⅰ帶和3 200～3 400 cm處的酰胺A帶。酰胺Ⅰ帶常用來解釋蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，其中-螺旋波數(shù)為1 646～1 661 cm、無規(guī)則卷曲波數(shù)為1 637～1 648 cm。EWP組酰胺Ⅰ帶最大吸收峰藍(lán)移，說明-螺旋含量下降，無規(guī)則卷曲含量升高。-螺旋依靠蛋白質(zhì)多肽鏈羰基氧和氨基氫之間的氫鍵穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，-螺旋的減少表示肌球蛋白發(fā)生解旋，因為蛋白質(zhì)中-螺旋 主要在肌球蛋白中，解旋的發(fā)生會影響蛋白質(zhì)骨架的穩(wěn)定性。上述變化可導(dǎo)致凝膠結(jié)構(gòu)變松散，引起凝膠強度與凝膠保水性下降。PPP組和SBC組酰胺Ⅰ帶最大吸收峰均紅移，表明螺旋含量升高，無規(guī)則卷曲含量下降。當(dāng)N-H基團涉及氫鍵時，酰胺A帶吸收峰將向低波數(shù)移動，由于肌原纖維蛋白和非肉蛋白中含有大量羥基和胺基，在形成混合溶液的過程中，分子間和分子內(nèi)形成大量氫鍵而相互締合，因此，在紅外光譜上形成了寬峰，且向低波數(shù)方向移動，說明在添加PPP和SBC的溶液中氫鍵作用增強，由此提高了蛋白的凝膠特性，此結(jié)果與上述蒸煮損失和質(zhì)構(gòu)分析吻合。

圖4 不同非肉蛋白添加量對混合體系傅里葉變換紅外圖譜的影響Fig. 4 Effect of addition of non-meat proteins on the Fourier transform infrared (FTIR) spectra of mixed protein systems

2.7 混合蛋白體系的紫外二階光譜變化

紫外二階光譜可以用來分析蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化，肌原纖維蛋白中含有酪氨酸、色氨酸等氨基酸，它們在紫外吸收光譜中的變化與其微環(huán)境的改變密切 相關(guān)。由圖5可知，肌原纖維蛋白在275 nm波長處有明顯的吸收峰，且隨著SBC添加量的增加，最大紫外吸收峰呈下降趨勢。隨著SPI、PPP、EWP添加量增加，最大吸收峰全部呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。但經(jīng)非肉蛋白處理的肌原纖維蛋白紫外吸收強度普遍有所降低，這一結(jié)果表明，蛋白質(zhì)的構(gòu)象從平面狀態(tài)變?yōu)榉瞧矫鏍顟B(tài)，這種“空間位阻”效應(yīng)可能是由蛋白質(zhì)聚集體的形成引起的。此外，最大紫外吸收峰的降低也證實了肌原纖維蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)的變化。紫外吸收光譜圖中的最大吸收峰略微紅移，表明蛋白質(zhì)所處的環(huán)境極性減弱?？赡苁怯捎诘鞍踪|(zhì)分子通過非共價鍵形成了蛋白質(zhì)復(fù)合體，使得發(fā)色基團被包埋。發(fā)色基團所處的微環(huán)境發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變。

圖5 不同非肉蛋白添加量對混合蛋白體系紫外光譜的影響Fig. 5 Effects of addition of non-meat proteins on UV spectrum of mixed protein systems

3 結(jié) 論

非肉蛋白通過不同程度影響肉糜間的交聯(lián)影響肉糜制品的水分含量和硬度。其中，SPI可顯著提高肉糜硬度，SPI和PPP均能改善肉糜的膠黏性。此外，隨著PPP添加量的增加，肉糜聚集體逐漸減少，結(jié)構(gòu)更加致密、有序；添加PPP可有效提高肉糜的保水性、硬度及pH值。因此，非肉蛋白，尤其是PPP在肉糜深加工中可有效提高肉糜品質(zhì)。