異種肝移植中的急性體液性排斥反應(yīng)

章忠強(qiáng)， 梁碩洲， 司中洲， 齊海智

1 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 肝臟移植科， 長沙 410011；2 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 移植醫(yī)學(xué)研究中心， 長沙 410011

肝移植是治療急慢性肝衰竭、晚期肝硬化等終末期肝病最為有效的治療手段[1-2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，目前我國HBV感染者達(dá)8600萬人，HCV感染者約1000萬人，每年約33萬人死于HBV或HCV感染導(dǎo)致的晚期肝硬化，而肝移植是能夠挽救這些患者生命的唯一手段。據(jù)中國肝移植注冊中心統(tǒng)計(jì)，我國每年約有20余萬人正在等待肝移植手術(shù)，但最終能夠獲得肝臟供體的患者僅7000人左右，大多數(shù)患者在等待供體的過程中死亡，肝臟供體短缺狀況在我國尤為突出。

異種器官移植作為潛在解決器官短缺的方法，一直是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)[3-4]。 人類從1968年開始基于大動物異種肝移植模型的實(shí)驗(yàn)研究[5]，早期的動物異種肝移植研究將野生型豬(未行基因編輯的豬)的肝臟移植至靈長類動物體內(nèi)，但物種之間的不相容性導(dǎo)致嚴(yán)重的超急性排斥反應(yīng)(hyperacute rejection, HAR)以及彌漫性的血管內(nèi)凝血，受體很快死亡[6-7]。

現(xiàn)代基因工程技術(shù)(CRISPR-Cas9技術(shù)等)通過敲除供體豬體內(nèi)與受體天然抗體結(jié)合抗原的基因，以及植入人的補(bǔ)體相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白抑制受體體內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，并配合新型免疫抑制劑的應(yīng)用，避免了HAR的發(fā)生，HAR在一定程度上得到了較好的控制，從而使動物異種肝移植研究取得進(jìn)一步的發(fā)展[4,8-9]，受體最長生存期延長至29 d(表1)。

野生型豬的肝移植入人體或非人靈長類動物體內(nèi)后，隨著受體體內(nèi)大量的針對移植物表面抗原的先天性抗體的結(jié)合，誘發(fā)抗體介導(dǎo)的HAR，導(dǎo)致移植物血管內(nèi)血栓形成、出血性壞死、內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及IgM、IgG、C3沉積[19]，外觀出現(xiàn)明顯的壞死性改變(圖1)，受體通常在30h內(nèi)死亡[18]。豬體內(nèi)的半乳糖-α1,3-半乳糖是誘發(fā)HAR的主要靶抗原，其在人類、猩猩和舊世界猴的體內(nèi)不表達(dá)，而這些靈長類動物體內(nèi)通常存有大量針對該抗原的抗體(抗-Gal抗體)[20]。通過將野生型豬細(xì)胞內(nèi)的α1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因敲除，并表達(dá)人的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白(如CD46、CD55、CD59)的基因工程豬作為異種肝移植供體，以及免疫抑制劑的應(yīng)用，可防止HAR的發(fā)生，受體生存期得到了一定時(shí)間的延長，但血小板持續(xù)減少、血栓性微血管病、消耗性的凝血異常成為了受體死亡的主要原因[12, 16-17, 21]。

表1 基因工程豬-非人靈長類動物異種肝移植受體存活時(shí)間

圖1異種肝移植術(shù)后發(fā)生超急性排斥反應(yīng)(野生型豬肝供體移植到恒河猴)

雖然在原位肝移植模型移植物內(nèi)或者異位輔助性肝移植術(shù)后短期尚未發(fā)現(xiàn)明顯排斥反應(yīng)證據(jù)，但是在存活26 d的異位輔助性肝移植模型的有13種基因編輯的移植物中出現(xiàn)了明顯的急性體液性排斥反應(yīng)，并伴有炎癥損傷、間質(zhì)出血和血栓性微血管病[18]。因此，隨著受體時(shí)間的延長，急性體液性排斥反應(yīng)將很可能是導(dǎo)致異種肝移植物失功的主要因素之一。明確異種肝移植急性體液性排斥反應(yīng)的機(jī)制，了解其防治策略，對我國開展異種肝移植研究具有重要的意義。

1 急性體液性排斥反應(yīng)的機(jī)制

急性體液性排斥反應(yīng)是由受體體內(nèi)抗體結(jié)合異種抗原后通過激活補(bǔ)體系統(tǒng)和固有免疫細(xì)胞[巨噬細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等]反應(yīng)，導(dǎo)致異種移植物血管內(nèi)皮細(xì)胞被激活和損傷，并在數(shù)天或數(shù)周的時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)局灶性缺血、彌漫性血管內(nèi)凝血，最終出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能破壞的過程[20]。

1.1 抗-Gal和抗-非Gal抗體 受體體內(nèi)的抗-Gal抗體、抗-非Gal抗體結(jié)合異種移植物細(xì)胞表面的Gal或非Gal抗原，激活受體補(bǔ)體系統(tǒng)級聯(lián)反應(yīng)，是誘發(fā)急性體液性排斥反應(yīng)破壞異種移植物的主要原因[18]。通過將非人靈長類動物受體體內(nèi)的Gal抗體去除，可有效抑制CD55和CD59異種移植物內(nèi)急性體液性排斥反應(yīng)的發(fā)生[22]，但即使是使用GTKO豬作為移植物，急性體液性排斥反應(yīng)仍然會發(fā)生[23]，這表明抗-Gal和抗-非Gal抗體均可以誘發(fā)急性體液性排斥反應(yīng)。胞苷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化物(N-glycolyl neuraminic sialic acid，Neu5Gc)是胞苷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶(cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH)編碼基因的產(chǎn)物，是在2002年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要的非Gal抗原，由于Neu5Gc在人體內(nèi)不表達(dá)，人類體內(nèi)逐漸形成高滴度的抗-Neu5Gc抗體[24]。另一個(gè)重要的非Gal抗原為聚多糖SDa，為β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶2(Beta-1,4-N-acetylgalactosaminyltransferase2，β4GALNT2)編碼基因的產(chǎn)物[25]。SDa抗原的去除可明顯降低供體豬的抗原性，從而減輕靈長類動物針對異種抗原的非-Gal抗體的作用[26]。人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)和豬白細(xì)胞抗原Ⅰ類(SLA-Ⅰ)具有的共同表位可能導(dǎo)致人和豬之間的交叉免疫反應(yīng)。同時(shí)，人體內(nèi)抗-HLA-Ⅱ抗體可交叉結(jié)合SLA-Ⅱ抗原。因此，HLA和SLA相關(guān)抗原抗體同樣可能介導(dǎo)急性體液性排斥反應(yīng)[27-28]。然而，如果肝臟移植物或者受體的生存期比較短，血小板持續(xù)減少、血栓性微血管病、消耗性凝血異常等問題可以掩蓋抗非-Gal抗體介導(dǎo)的急性體液性排斥反應(yīng)對移植物或受體的影響[29]。

1.2 固有免疫細(xì)胞 固有免疫細(xì)胞通過抗體依賴性細(xì)胞毒性作用激活、損傷移植物內(nèi)皮細(xì)胞，同樣可以誘發(fā)異種移植急性體液性排斥反應(yīng)，但其重要性目前暫未明確[20, 29]。

巨噬細(xì)胞可以被受體體內(nèi)的抗異種移植物抗體(如抗Gal或抗非-Gal等天然抗體)的Fc以及補(bǔ)體受體激活，活化的巨噬細(xì)胞通過分泌各種促炎細(xì)胞因子、活性氧等，參與針對移植物的抗體及補(bǔ)體依賴性的急性體液性排斥反應(yīng)[30-31]。

NK細(xì)胞可通過抗體依賴性細(xì)胞毒性機(jī)制參與異種體液性排斥反應(yīng)，移植物內(nèi)皮細(xì)胞表面沉積的抗體被NK細(xì)胞上的FcγRⅢ識別，通過導(dǎo)致異種移植物內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子表達(dá)增加，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞浸潤及炎癥因子釋放，促使異種移植物細(xì)胞凋亡[32]。NK細(xì)胞還可以通過CD40-CD154途徑與受體脾臟邊緣區(qū)B淋巴細(xì)胞相互作用，促進(jìn)抗體介導(dǎo)的急性體液性排斥反應(yīng)[33]。

在異種移植中,中性粒細(xì)胞最早浸潤到移植物內(nèi)，移植物內(nèi)存在抗體及補(bǔ)體的沉積促進(jìn)中性粒細(xì)胞粘附并激活內(nèi)皮細(xì)胞，通過抗體依賴性的體液性免疫反應(yīng)介導(dǎo)異種移植物損傷[34-35]。

2 急性體液性排斥反應(yīng)的防治

2.1 供受體移植前嚴(yán)格配型 前期研究[18-36]表明，抗非-Gal抗體仍然是誘導(dǎo)異種肝移植術(shù)后急性體液性排斥反應(yīng)的主要原因，且Gal、Neu5Gc、Sda抗原均敲除的基因工程豬作為供體，抗非-Gal抗體介導(dǎo)的急性體液性排斥反應(yīng)仍然無法完全避免。

因此，嚴(yán)格的移植前供受體交叉配型(包括針對供體的抗原抗體結(jié)合試驗(yàn)以及補(bǔ)體依賴性的供體細(xì)胞殺傷試驗(yàn))，篩選最佳匹配的供受體組合，可以盡量減少異種肝移植術(shù)后抗Gal或非Gal抗體介導(dǎo)的急性體液性排斥反應(yīng)的發(fā)生。

2.2 基因工程技術(shù) 通過基因工程技術(shù)敲除豬移植物內(nèi)的相關(guān)抗原并修飾補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白等，是防止或減輕異種肝移植體液性排斥反應(yīng)的主要手段。Gal基因的敲除以及CD46、CD55、CD59等補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白修飾的基因工程豬的肝移植物，可以防止HAR的發(fā)生，有效控制急性體液性排斥反應(yīng)[11, 34]。GTKO/CD46基因型豬肝移植物在非人靈長類動物體內(nèi)維持基本的肝功能7 d，移植物內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯移植排斥反應(yīng)[11]。GTKO基因型豬肝移植物作為異位輔助性供體，最長可在非人靈長類動物體內(nèi)存活15 d，不出現(xiàn)嚴(yán)重的急性體液性排斥反應(yīng)[14]。在異種原位肝移植模型中，GTKO基因型豬肝移植物可維持受體存活時(shí)間達(dá)29 d，且無明顯移植排斥反應(yīng)[17]。然而，13個(gè)基因編輯(PERV-KO/3-KO/9-TG)的基因型豬肝移植物在術(shù)后26 d的病理檢查中發(fā)現(xiàn)了明顯的體液性排斥反應(yīng)[18]。

通過基因工程技術(shù)敲除抗原、修飾相關(guān)蛋白可顯著防止異種肝移植急性體液性排斥反應(yīng)的發(fā)生，但并不是基因的敲除及修飾的基因數(shù)量越多，急性體液性排斥反應(yīng)發(fā)生的概率越小。因此，通過實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)一步明確不同基因編輯組合供體(包括針對固有免疫細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的基因編輯)在防止肝移植急性體液性排斥反應(yīng)中的作用，更精準(zhǔn)地進(jìn)行基因敲除或修飾，優(yōu)化供體的基因編輯組合，是預(yù)防異種肝移植急性體液性排斥反應(yīng)的關(guān)鍵所在。

2.3 藥物處理 異種肝移植受體接受免疫抑制及相關(guān)輔助藥物的足量處理，是減少移植術(shù)后體液和細(xì)胞性排斥反應(yīng)，減輕移植物損傷的主要方法。其中，眼鏡蛇毒因子和激素分別通過作用于補(bǔ)體系統(tǒng)激活和移植術(shù)后炎性反應(yīng)、炎癥因子風(fēng)暴，抑制急性體液性免疫反應(yīng)的發(fā)生[36]。此外，針對B淋巴細(xì)胞的抗CD20單克隆抗體(aCD20mAb，Rituxan)在減輕異種肝移植術(shù)后急性體液性排斥反應(yīng)方面也具有一定的作用[37]，但其重要性有待進(jìn)一步明確。

3小結(jié)

抗體介導(dǎo)和固有免疫細(xì)胞參與的急性液性排斥反應(yīng)是基因工程豬-非人靈長類動物異種肝移植研究中需要特別注意的問題。急性體液性排斥反應(yīng)可以快速導(dǎo)致異種移植物失功，并可能是阻礙進(jìn)一步延長異種肝移植受體存活時(shí)間的關(guān)鍵因素。通過移植術(shù)前嚴(yán)格的供受體交叉配型、選擇合適的基因工程豬供體基因型以及眼鏡蛇毒因子和激素等藥物的規(guī)范足量使用，是目前減輕或避免基因工程豬-非人靈長類動物異種肝移植術(shù)后急性體液性排斥反應(yīng)的主要方法。然而，受體固有免疫細(xì)胞參與的異種肝移植急性體液性排斥反應(yīng)的機(jī)制以及防治策略，亟需更深入的研究探索。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：章忠強(qiáng)、梁碩洲負(fù)責(zé)撰寫論文；司中洲、齊海智負(fù)責(zé)寫作思路，指導(dǎo)撰寫、修改文章并最后定稿。