肝纖維化發(fā)生機(jī)制及其中藥逆轉(zhuǎn)治療的研究進(jìn)展

劉世恒， 趙素賢， 張玉果

河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合肝病科， 石家莊 050051

肝纖維化是指在各種病因作用下，肝細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的異常分布和彌漫性沉積，位于肝竇間隙的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)在肝纖維化的過程中扮演著重要的角色；當(dāng)肝臟持續(xù)損傷時(shí)，HSC被誘導(dǎo)激活轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞(myofibroblast，MFB)，并大量增殖，分泌α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、Ⅰ型膠原蛋白等膠原物質(zhì)構(gòu)成ECM，ECM生成與降解的失衡，造成正常肝功能的損傷，最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[1-3]。肝纖維化是影響慢性肝病患者預(yù)后的重要環(huán)節(jié)和各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展過程中的關(guān)鍵步驟，因此早期干預(yù)并逆轉(zhuǎn)肝纖維化可避免失代償性肝硬化或肝癌的發(fā)生。目前西醫(yī)尚無療效確切的抗纖維化藥物，而越來越多的臨床試驗(yàn)、動(dòng)物及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究證據(jù)表明：一些中藥復(fù)方、中藥單體、單味中藥、中成藥具有顯著的抗肝纖維化作用，在應(yīng)對(duì)肝纖維化這一復(fù)雜的病理過程時(shí)，能夠體現(xiàn)出更加明顯的優(yōu)勢(shì)，更好地阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進(jìn)展。肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)、Notch信號(hào)通路、YAP/TAZ信號(hào)通路、細(xì)胞自噬分別可通過不同的機(jī)制影響HSC的活化，發(fā)揮逆轉(zhuǎn)或促進(jìn)肝纖維化的作用，本文介紹上述機(jī)制在肝纖維化中的作用及其對(duì)應(yīng)的中醫(yī)藥逆轉(zhuǎn)肝纖維化的研究進(jìn)展，以期為發(fā)現(xiàn)新的抗纖維化研究方向及臨床治療提供思路。

1 LSEC去分化促進(jìn)肝纖維化

LSEC是一種高度分化的薄層扁平狀內(nèi)皮細(xì)胞，LSEC在慢性肝病的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，當(dāng)肝臟受損時(shí)，LSEC窗孔消失，即發(fā)生內(nèi)皮細(xì)胞的毛細(xì)血管化，也稱去分化，發(fā)生去分化的LSEC過濾和內(nèi)吞功能降低，有研究[4-5]表明，LSEC的去分化早于HSC、巨噬細(xì)胞的激活及肝纖維化的發(fā)生，提示LSEC的去分化可能是肝纖維化發(fā)展的初始階段。Wang等[6]的研究表明，LSEC可通過含有鞘氨醇激酶-1及其產(chǎn)物鞘氨醇-1-磷酸的外泌體，促進(jìn)HSC的活化和遷移，正常分化狀態(tài)的LSEC是維持HSC非增殖狀態(tài)的關(guān)鍵，而LSEC的去分化則會(huì)促使HSC的激活[7]；另一方面，活化后的HSC可通過多條途徑進(jìn)一步促進(jìn)LSEC的去分化，如活化的HSC通過分泌血管內(nèi)皮生長因子和大量的ECM作用于LSEC，并誘導(dǎo)血栓反應(yīng)蛋白-1的產(chǎn)生，血栓反應(yīng)蛋白-1可阻斷一氧化氮依賴途徑增強(qiáng)LSEC的去分化[8]，此外，有研究[9]表明，HSC可通過hedgehog信號(hào)通路進(jìn)一步誘導(dǎo)LSEC的去分化；LSEC和HSC的相互作用則進(jìn)一步加重了肝纖維化的發(fā)生和進(jìn)展。

一些中草藥具有抑制LSEC去分化的作用，杏仁苷是中藥苦杏仁中的有效成分，Xiao等[10]的研究表明杏仁苷可以降低肝纖維化小鼠及體外培養(yǎng)的HSC中Col-Ⅰ及α-SMA的表達(dá)，并使LSEC去分化標(biāo)志物CD31表達(dá)減少，抑制LSEC的去分化，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用；一項(xiàng)動(dòng)物試驗(yàn)研究[9]表明，典型的hedgehog信號(hào)通路可通過激活低氧誘導(dǎo)因子-1α和熱休克蛋白90調(diào)控HSC介導(dǎo)的肝血管生成，中藥單體川芎嗪可以抑制HSC中的經(jīng)典hedgehog信號(hào)通路，從而阻止HSC介導(dǎo)的血管生成和LSEC的去分化；此外，Yang等[11]發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇同樣可通過hedgehog途徑改善CCl4誘導(dǎo)小鼠的肝纖維化程度和LSEC去分化；在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，桃紅四物湯(THSWD)幾百年來一直用于治療慢性肝病患者，有研究[12]發(fā)現(xiàn)THSWD可能通過抑制血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)及影響其下游信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而延緩LSEC去分化的速度，減輕了慢性肝病小鼠模型中肝臟炎癥性壞死和纖維化程度，因此，開發(fā)可抑制LSEC去分化或阻斷其下游信號(hào)通路的中草藥可作為一種逆轉(zhuǎn)肝纖維化的潛在途徑和方法。

2 阻斷Notch信號(hào)通路抑制肝纖維化

Notch蛋白是一類進(jìn)化上高度保守的受體蛋白，廣泛存在于各種細(xì)胞表面，其在組織穩(wěn)態(tài)、生長發(fā)育中起到重要作用[13]，Notch通路中關(guān)鍵信號(hào)組件較少，主要由4個(gè)受體( Notch1～4 )、5個(gè)配體(Jagged1、Jagged2、Delta-like 1、Delta-like 3、Delta-like 4)、轉(zhuǎn)錄因子CSL組成，其核心通路可概括為：Delta/Jagged配體與Notch受體在細(xì)胞表面結(jié)合并激活，導(dǎo)致Notch二聚體與配體結(jié)合的部分進(jìn)入配體細(xì)胞降解；受體的殘余部分被酶解為Notch胞內(nèi)段，Notch胞內(nèi)段轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核與CSL結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄過程[14-15]。

Notch信號(hào)通路在肝纖維化形成過程中發(fā)揮出關(guān)鍵作用，一項(xiàng)研究[16]表明，透明質(zhì)酸合成酶-2通過Notch1受體促進(jìn)HSC活化并釋放大量的透明質(zhì)酸，促使肝纖維化的發(fā)生；Notch通路的激活可導(dǎo)致LSEC窗孔減少和基底膜增加，Duan等[17]在CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型小鼠中發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路可激活eNOS-sGC通路，導(dǎo)致LSEC去分化，加速其肝纖維化的發(fā)生；Aimaiti等[18]發(fā)現(xiàn)阻斷Notch信號(hào)通路后，可以抑制TGFβ1激活的HSC向MFB轉(zhuǎn)變；此外，當(dāng)抑制TGFβ1時(shí)，Notch信號(hào)通路中Notch1 mRNA、Hes1 mRNA、Hes5 mRNA和蛋白的表達(dá)相應(yīng)下調(diào)[19]，表明TGFβ1信號(hào)可能通過調(diào)節(jié)Notch信號(hào)分子的表達(dá)來調(diào)控HSC的活化。

肝臟中未成熟的巨噬細(xì)胞可極化為經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞(M1型)和替代活化型巨噬細(xì)胞(M2型)，M1型巨噬細(xì)胞可通過分泌TNFα、TGFβ、IL-1和PDGF等促進(jìn)HSC活化，而M2型巨噬細(xì)胞能促進(jìn)炎癥消退、溶解ECM，起到抑制肝纖維化的作用；一系列研究表明Notch信號(hào)通路參與了巨噬細(xì)胞的激活，并調(diào)節(jié)其多種生物學(xué)特性，Notch信號(hào)可通過miR-148a-3p促進(jìn)單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞及激活M1型巨噬細(xì)胞，抑制M2型巨噬細(xì)胞極化，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬和殺死細(xì)菌的能力[20]；Notch信號(hào)通路中Delta(1-4)/Notch1軸線可促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞分化并抑制M2型巨噬細(xì)胞分化，從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生[21]；Notch信號(hào)通路還可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子IRF8，進(jìn)而促進(jìn)炎癥型巨噬細(xì)胞極化和典型M1型效應(yīng)分子如IL-12和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)[22]；此外，Kimball等[23]在Notch信號(hào)缺陷的小鼠中發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞數(shù)量及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)減少。因此，如何在體內(nèi)有效阻斷Notch信號(hào)的作用成為未來逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重要方向。

中藥單體辣椒素[24](capsaicin)、槲皮素[25](quercetin)均可通過阻斷Notch信號(hào)通路抑制巨噬細(xì)胞向M1極化，使TNFα分泌減少，減輕肝損傷和纖維化；黃芪多糖是中藥黃芪的提取物，在膽總管結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中，Zhang等[26]發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可以降低大鼠TGFβ1和α-SMA蛋白的表達(dá)，降低Notch信號(hào)通路中靶因子(Notch3和Notch4、Jagged1)的表達(dá)來抑制Notch信號(hào)通路，從而減輕肝纖維化及膽管周圍的膠原沉積；Tanriverdi等[27]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能有效抑制Notch信號(hào)的傳導(dǎo)，降低大鼠脂質(zhì)過氧化，發(fā)揮其抗肝纖維化的功效。

3 YAP/TAZ表達(dá)上調(diào)促進(jìn)肝纖維化

Yes相關(guān)蛋白(yes associated protein，YAP)和TAZ(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif)是同源性轉(zhuǎn)錄共激活蛋白，其具有相似的結(jié)構(gòu)和功能，一般認(rèn)為，YAP/TAZ是Hippo信號(hào)通路中重要的下游效應(yīng)靶因子，其核心通路可概括為：Hippo(激活)→MST1/2(蛋白激酶)+SAV1(調(diào)節(jié)蛋白)→LATS1/2(蛋白激酶)+MOB1A/B(調(diào)節(jié)蛋白)→YAP/TAZ(磷酸化失去活性)滯留在胞質(zhì)內(nèi)→被β-轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)相容蛋白泛素化降解，當(dāng)Hippo(抑制)→YAP(去磷酸化)→入胞核→結(jié)合TEA結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子(TEA domain transcription factor，TEAD)→激活靶基因[28-29]。

Hippo-YAP/TAZ信號(hào)通路在HSC、巨噬細(xì)胞活化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用；有研究[30]表明，Hippo信號(hào)通路及其效應(yīng)體YAP是控制HSC激活的關(guān)鍵途徑，在體內(nèi)及體外的實(shí)驗(yàn)表明HSC可通過YAP的活化而被激活，反之，下調(diào)YAP的表達(dá)或抑制YAP的生物學(xué)作用可在體外阻止HSC的活化。此外，YAP也能激活巨噬細(xì)胞促進(jìn)肝纖維化，Qing等[31]在小鼠肝纖維化模型中發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞表達(dá)的YAP水平增高，當(dāng)巨噬細(xì)胞中YAP信號(hào)缺失時(shí)，分泌促纖維化因子的血管內(nèi)皮細(xì)胞亞群表達(dá)降低，而使用一種多巴胺受體D2 拮抗劑選擇性地阻斷巨噬細(xì)胞中的YAP通路時(shí)，有效的阻斷了肝纖維化并恢復(fù)其正常結(jié)構(gòu)。Hippo-YAP/TAZ信號(hào)通路亦可逆轉(zhuǎn)非酒精性脂肪性肝炎(NASH)造成的肝纖維化，有研究[32]表明，TAZ水平在人和小鼠NASH肝細(xì)胞中明顯高于正常肝細(xì)胞，更重要的是，在NASH小鼠模型中，TAZ的沉默可預(yù)防或逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞的炎癥發(fā)生、死亡或肝纖維化；另有一項(xiàng)研究[33]表明，在NASH患者的肝細(xì)胞中，YAP/TAZ通路被激活，誘導(dǎo)富半胱氨酸血管生成誘導(dǎo)因子61的表達(dá)，而富半胱氨酸血管生成誘導(dǎo)因子61是一種促進(jìn)炎癥和纖維化的趨化因子，其可促進(jìn)NASH患者肝臟慢性纖維化的發(fā)生。

中藥復(fù)方益氣活血方(YQHX)由黃芪、云茯苓、丹參、郁金、白豆蔻組方而成，具有升陽補(bǔ)氣、益衛(wèi)固表等功效。Zhao等[34]的研究發(fā)現(xiàn)，YQHX可顯著抑制CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝臟中YAP/TAZ、TGFβ、結(jié)締組織生長因子表達(dá)的上調(diào)，緩解大鼠肝纖維化程度，此外，慢性乙型肝炎合并肝纖維化的患者經(jīng)YQHX治療后，其肝臟和血漿中YAP水平均顯著降低，表明YXHQ可通過抑制YAP/TAZ信號(hào)通路發(fā)揮其抗肝纖維化作用。大黃素是大黃(Rheum)中的一種主要有效成分，具有抗炎、抗菌和抗過敏的功效，研究[35]表明，大黃素可誘導(dǎo)肝細(xì)胞系(HepG2細(xì)胞)及小鼠肝臟中LATS1和YAP的磷酸化，抑制Hippo通路及ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激，減少肝臟炎癥及纖維化的發(fā)生。中藥單體甘草素可誘導(dǎo)肝纖維化小鼠及體外培養(yǎng)的LX-2細(xì)胞中YAP 蛋白的磷酸化，通過抑制YAP通路，減少肝臟中HSC的活化，并抑制由氧化應(yīng)激引起的肝損傷[36]；二氫丹參酮Ⅰ(dihydrotanshinone Ⅰ, DHI)是中藥丹參的有效成分，研究[37]發(fā)現(xiàn)，DHI通過阻斷YAP的核易位，抑制了YAP/TEAD2及其下游靶因子結(jié)締組織生長因子、survivin等的表達(dá)，減輕了膽總管結(jié)扎大鼠的肝細(xì)胞壞死、膽管增殖和膠原沉積，并降低LX-2細(xì)胞中COL1A1、TGFβ1和α-SMA蛋白水平，具有抗肝纖維化的功效。

4 細(xì)胞自噬對(duì)肝纖維化的影響

自噬是一種細(xì)胞穩(wěn)態(tài)機(jī)制，其主要依賴溶酶體來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)分解代謝過程，在保護(hù)細(xì)胞功能和維持代謝穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，自噬過程受到自噬相關(guān)基因(autophagy related gene，ATG)及其編碼的ATG蛋白分子所介導(dǎo)，包括LC3、PI3K、Beclin1等多個(gè)基因，自噬在肝臟生理調(diào)節(jié)和肝臟代謝平衡中起著重要作用，為HSC的活化提供了能量，促進(jìn)了ECM的形成和肝纖維化的發(fā)生[38-39]；HSC、巨噬細(xì)胞及LSEC的自噬均參與了肝臟纖維化的調(diào)控。

研究[40]發(fā)現(xiàn)，使用成熟的脂肪細(xì)胞作用于HSC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSC中的自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3 Ⅱ顯著增高，產(chǎn)生的α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白明顯增多，HSC自噬后為纖維化的發(fā)生提供了能量，促進(jìn)了肝纖維化的進(jìn)一步發(fā)生、發(fā)展；P62/SQSTM1是一種自噬底物連接蛋白，最終在溶酶體中降解，其與細(xì)胞自噬功能呈負(fù)相關(guān)，p62/SQSTM1可促進(jìn)HSC中維生素D受體的信號(hào)傳導(dǎo)，從而降低TGFβ1水平，阻止HSC的活化，對(duì)肝纖維化和炎癥的發(fā)生起到抑制作用[41-42]；上述研究均表明，抑制HSC的自噬可阻止肝纖維化的發(fā)生。自噬可維持LSEC的穩(wěn)態(tài)，在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型及體外分離培養(yǎng)的LSEC中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)體外和體內(nèi)LSEC發(fā)生毛細(xì)血管化時(shí)，自噬過程均迅速增強(qiáng)，并在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，LSEC的自噬可減輕肝臟纖維化，而沉默小鼠LSEC中ATG7基因后，發(fā)現(xiàn)其清除ROS能力降低，肝內(nèi)一氧化氮生成減少，表明自噬的喪失損害了LSEC處理氧化應(yīng)激的能力，并加劇肝臟纖維化[43]。此外，自噬可抑制巨噬細(xì)胞炎癥發(fā)生，普遍認(rèn)為巨噬細(xì)胞在肝臟炎癥中具有促進(jìn)纖維化發(fā)生的作用，Sun等[44]在Kupffer細(xì)胞ATG5缺失型的大鼠肝損傷模型中發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型膠原蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的mRNA表達(dá)水平高于野生型大鼠組，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，自噬缺陷的Kupffer細(xì)胞可能通過增強(qiáng)線粒體ROS-NF-κB-IL1α/β通路促進(jìn)肝臟炎癥及纖維化的發(fā)生。

由茵陳、柴胡、黃芪、白芍、枳殼、白術(shù)、豬苓、茯苓、澤蘭、薏苡仁、板藍(lán)根按一定比例配制而成的疏肝健脾方具有疏肝理氣、活血化瘀的功效，研究[45]表明，疏肝健脾方能顯著下調(diào)肝纖維化大鼠中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達(dá)，減輕肝臟病理組織學(xué)損傷程度，減少膠原纖維在肝臟的沉積，通過抑制HSC自噬，降低能量生成，發(fā)揮其抗纖維化作用；Xia等[46]的研究表明，巖白菜素(Bergenin)可下調(diào)Beclin-1和LC-3的表達(dá)，阻斷HSC自噬的發(fā)生及其激活所需的能量供應(yīng)，從而減少透明質(zhì)酸、纖連蛋白、層粘連蛋白等ECM的形成，可作為治療肝纖維化的一種新興藥物；MFB的大量生成和激活是肝纖維化發(fā)展的關(guān)鍵，姜黃素可通過激活自噬有效降低肝臟內(nèi)MFB的生成，從而抑制ECM的產(chǎn)生，阻止肝纖維化的發(fā)生[47]；此外，有研究[48]表明，中成藥扶正化瘀膠囊可能通過抑制細(xì)胞自噬并激活Nrf2-Keap1-Are信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)其抗纖維化的功效。

5 小結(jié)和展望

肝纖維化是在各種致病因素作用下，肝組織損傷修復(fù)過度的一種反應(yīng)， HSC的激活是其發(fā)生的核心步驟，LSEC、Notch信號(hào)通路、YAP/TAZ信號(hào)通路、細(xì)胞自噬最終均與HSC的激活相關(guān)，通過上述機(jī)制有效阻斷HSC的激活是實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重要方法。中藥逆轉(zhuǎn)肝纖維化具有多途徑、多靶點(diǎn)和多效性的作用特點(diǎn)，本文基于上述機(jī)制列舉多種抗肝纖維化的藥物，部分已用于肝纖維化患者，且療效確切，但大部分中藥目前仍處于基礎(chǔ)研究階段，隨著肝纖維化研究的不斷深入和中醫(yī)藥的快速發(fā)展，新的發(fā)病機(jī)制研究和相應(yīng)中藥治療靶點(diǎn)將不斷被探索挖掘出來，盡早應(yīng)用于臨床惠及廣大肝病患者。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：劉世恒負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；趙素賢參與修改論文；張玉果負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。