咖啡酸苯乙酯對肝星狀細(xì)胞的作用及機(jī)制分析

楊 寧， 鄧 江， 王怡愷， 常 莎， 高 寧， 王文俊， 黨雙鎖， 石娟娟

1 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤醫(yī)院， 陜西 咸陽 712000；2 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 感染科， 西安 710004

蜂膠性甘平，具有清熱解毒、補(bǔ)中潤燥、止痛之功效，是日常保肝養(yǎng)生的保健食品之一?？Х人岜揭阴?caffeic acid phenethyl ester，CAPE)是蜂膠提取物黃酮類中最具活力的單體成分之一，目前已被證明其具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎等多種生物活性[1-2]。本課題組前期動物實(shí)驗(yàn)[3-4]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CAPE具有明顯的保護(hù)肝損傷及抗肝纖維化作用，但其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。本研究通過體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC)-T6，初步探討CAPE體外抑制HSC的作用及可能的作用機(jī)制，以期為CAPE治療肝纖維化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 大鼠HSC-T6購自南京凱基生物公司，HSC-T6細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM高糖溶液中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 藥物與試劑 CAPE純度≥97% (HPLC)購自美國Sigma公司(批號：24278341)。真核表達(dá)重組質(zhì)粒GFP-LC3由西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院科研實(shí)驗(yàn)平臺贈予。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)液、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素雙抗溶液均購自美國Hyclone公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、E.Z.N.A?Total RNA試劑盒均購自美國Omega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT Master Mix、熒光定量PCR試劑盒SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ均購自日本TAKARA公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、ECL發(fā)光試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司；LC3 Ⅰ/Ⅱ、p-mTOR、AKT、p-AKT、Atg7均購自美國Cell Signaling公司，Beclin1購自美國Proteintech公司，β-actin購自SANTA CRUZ公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及MTT實(shí)驗(yàn) 從液氮中取出保種凍存的HSC-T6細(xì)胞，常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng)細(xì)胞。取對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞，以每孔6×105細(xì)胞接種于6孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。根據(jù)前期MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果[4]，其顯示CAPE抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，并呈劑量依賴性，因此最終選擇3種不同濃度的CAPE(5、10、15 μmol/L)作用于HSC-T6細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以不加CAPE的空白組為對照組。

1.2.2 透射電子顯微鏡檢測 CAPE作用于HSC-T6細(xì)胞24 h后，(1)取材：取1×106個(gè)細(xì)胞置于2.5%戊二醛固定液中4 ℃固定2 h；(2)固定：用1%四氧化鋨固定液于4 ℃固定2 h，磷酸緩沖液浸洗；(3)脫水：室溫下乙醇梯度脫水，即30%乙醇10 min，50%乙醇10 min，70%乙醇10 min，70%的乙醇醋酸雙氧鈾塊染色2 h或者過夜，90%乙醇10 min×2次，100%乙醇10 min×3次；(4)浸透：于環(huán)氧丙烷中置換10 min，環(huán)氧樹脂(Epon812)浸透；(5)包埋：吸取混合包埋劑滴于膠囊模塊孔的底部并注滿，放于60 ℃烤箱烘烤2 h；(6)修塊：顯微鏡下修整并去除表面包埋劑；(7)切片：制作半超薄切片1～2 μm，然后進(jìn)行美蘭染色，于超薄切片機(jī)下切片50～70 nm；(8)電子染色：檸檬酸鉛、醋酸鈾染色后，透射式電子顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.3 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞，以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于30 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，同時(shí)將無菌蓋玻片放至其中使細(xì)胞開始爬片，細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)，CAPE作用于HSC-T6細(xì)胞24 h；4%多聚甲醛固定；TBST，20 min；5% BSA封閉1 h；一抗4 ℃過夜；二抗FITC，室溫避光孵育1 h；PBS洗滌10 min×4次；DAPI，2 min；取出玻片，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片；熒光顯微鏡高倍視野下觀察、拍照；采用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 GFP-LC3轉(zhuǎn)染 根據(jù)去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒步驟進(jìn)行，提取GFP-LC3質(zhì)粒；取對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞，以5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使得細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%。參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，反復(fù)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)而優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，具體步驟：(1)分別用50 μL無血清DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋4.0 μg GFP-LC3質(zhì)粒DNA和稀釋10 μL Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，室溫靜置5 min；(2)將稀釋的DNA和脂質(zhì)體輕輕混合，室溫放置25 min，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物；(3)每孔中加入100 μL DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，在培養(yǎng)箱孵育4 h，再更換為DMEM高糖完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h；同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染對照組。采用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，證實(shí)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。CAPE繼續(xù)作用于HSC-T6細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以不加CAPE的空白組為對照組，同時(shí)給予自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素和自噬抑制劑3-MA進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)行熒光染色，采用熒光顯微鏡高倍視野下觀察、拍照，采用Image J 軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 熒光定量PCR檢測 CAPE作用于HSC-T6細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，按照E.Z.N.A?Total RNA試劑盒步驟提取總RNA。利用PrimeScript?RT Master Mix試劑盒步驟，于冰上配制20 μL反應(yīng)體系，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用qPrimer Depot軟件設(shè)計(jì)目的基因Real-time PCR擴(kuò)增引物，由上海生工合成，引物序列見表1。采用Bio-Rad PCR儀進(jìn)行目的基因表達(dá)水平的檢測，根據(jù)熒光定量PCR試劑盒SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ步驟，于冰上配制10 μL反應(yīng)體系，預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)6次，Ct值被用作實(shí)時(shí)熒光定量的結(jié)果，△△Ct計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參對照，用2-△△Ct計(jì)算干預(yù)組相對于對照組的倍數(shù)變化。

1.2.6 Western-Blot檢測 CAPE作用于HSC-T6細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，RIPA裂解液提取總蛋白；根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒步驟測定細(xì)胞總蛋白含量。具體步驟：(1)配制SDS-PAGE：凝膠根據(jù)待測目的蛋白分子量大小選擇相應(yīng)濃度的SDS-PAGE凝膠電泳；(2)上樣：按每泳道150 μg目的蛋白分別加入到SDS-PAGE凝膠中，至溴芬蘭抵達(dá)凝膠底部；(3)轉(zhuǎn)膜：在Transfer Buffer中進(jìn)行濕轉(zhuǎn)，按蛋白分子量大小不同，40 V恒壓轉(zhuǎn)膜1～2 h；(4)封閉：取出PVDF膜置于5% BSA-TBST封閉液中室溫輕搖封閉1 h；(5)一抗孵育：一抗稀釋至合適的濃度，4 ℃孵育過夜；(6)二抗孵育：TBST洗膜3次，每次10 min，二抗室溫孵育1.5 h；(7)ECL顯色：TBST洗膜3次，每次10 min，PVDF膜放入呈像系統(tǒng)觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 CAPE對HSC-T6細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 不同濃度CAPE(5、10、15 μmol/L )作用于HSC-T6細(xì)胞24 h后，與對照組相比，CAPE干預(yù)組HSC-T6細(xì)胞的增殖明顯受抑制，細(xì)胞體積逐漸下降，表面絨毛結(jié)構(gòu)減少或消失，多核仁較少；有線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)長，在細(xì)胞質(zhì)中觀察到脂滴和盤狀自噬體的散射分布(圖1)。

2.2 CAPE對自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響 不同濃度CAPE作用于HSC-T6細(xì)胞24 h后，與對照組相比，用10或15 μmol/L CAPE處理的HSC-T6細(xì)胞中ATG5、ATG7、ATG12、Beclin1、LC3 mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P值均<0.05)。然而，5 μmol/L CAPE干預(yù)組并未明顯影響ATG5、ATG7、ATG12、Beclin1和LC3 mRNA的表達(dá)(P值均>0.05)(表2)。

注：黑色箭頭，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；黃色箭頭，線粒體；紅色箭頭，自噬體；最上方標(biāo)尺5 μm，中間標(biāo)尺1 μm，最下方標(biāo)尺0.5 μm。

表1 Real-time PCR 引物序列

表2 CAPE對自噬相關(guān)的基因表達(dá)的影響

2.3 CAPE對LC3蛋白表達(dá)的影響 LC3B Ⅱ是自噬體的可靠蛋白質(zhì)標(biāo)志物，其表達(dá)水平與自噬體的數(shù)量呈正相關(guān)。與對照組(13.34%±2.59%)相比，CAPE干預(yù)組細(xì)胞形態(tài)皺縮變圓；且5 μmol/L CAPE(23.68%±3.76%，t=-5.553，P<0.001)、10 μmol/L CAPE(43.47%±3.83%，t=-15.958，P<0.001)、15 μmol/L CAPE(57.25%±2.78%，t=-28.334，P<0.001)LC3熒光染色均顯著增強(qiáng)，且呈正相關(guān)(圖2)。上述結(jié)果提示，隨著CAPE濃度增加自噬體亦隨之增多。

2.4 CAPE下調(diào)AKT/mTOR信號通路誘導(dǎo)自噬形成 為了進(jìn)一步明確CAPE對自噬形成的影響，筆者團(tuán)隊(duì)將GFP-LC3轉(zhuǎn)染至HSC-T6細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)CAPE干預(yù)組(79.01%±6.69%)較對照組(67.06%±6.74%)LC3熒光染色明顯增強(qiáng)(t=-3.083，P=0.012)；同時(shí)給予自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(86.88%±5.42%)，LC3表達(dá)較CAPE組明顯增強(qiáng)(t=-2.239，P=0.049)；然而，給予自噬抑制劑3-MA(71.22%±4.29%)，其表達(dá)則明顯減低(t=-2.404，P=0.037)。Western-Blot檢測結(jié)果顯示，ATG7、Beclin1和LC3I/Ⅱ的蛋白表達(dá)水平與GFP-LC3熒光染色結(jié)果相似；然而，AKT/p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平則與之相反(圖3)。上述結(jié)果表明，CAPE可調(diào)節(jié)自噬過程，可能與下調(diào)AKT/mTOR信號通路相關(guān)。

3 討論

自噬是一種維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的溶酶體途徑，在自然界進(jìn)化過程中作為一種保守且有效的內(nèi)部保護(hù)監(jiān)管機(jī)制，有利于生物體維持內(nèi)環(huán)境的“穩(wěn)態(tài)”，在一定程度上也決定著細(xì)胞的存活，同時(shí)過度的自噬也可介導(dǎo)自噬性的細(xì)胞死亡[5]。越來越多的研究表明，自噬在肝臟疾病中，尤其是在抗肝纖維化中發(fā)揮著較為重要的作用[5-7]。

大量的研究[1-2]表明，CAPE對各種肝臟疾病具有保肝作用。同時(shí)，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CAPE可以減輕CCl4復(fù)合因素誘導(dǎo)的肝纖維化[3]，但其具體作用機(jī)制尚不明確。HSC是肝纖維化形成的重要效應(yīng)細(xì)胞，是其發(fā)生的核心環(huán)節(jié)。正常情況下HSC處于靜息狀態(tài)，但任何病因的慢性肝損傷(包括病毒感染、酒精性肝病和非酒精性脂肪肝等)可引發(fā)靜息HSC向其激活表型轉(zhuǎn)化，如細(xì)胞增殖、收縮、纖維生成、基質(zhì)降解能力減弱、趨化性和炎癥信號等，使細(xì)胞外基質(zhì)過度增生和沉積，從而促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)程[8-9]。因此，本研究以大鼠HSC-T6為研究對象，初步探討CAPE抑制肝纖維化進(jìn)程的作用機(jī)制。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電鏡超微結(jié)構(gòu)可直接觀察到在CAPE干預(yù)組中，HSC-T6細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，且在細(xì)胞質(zhì)中觀察到脂滴和盤狀自噬體的散射分布，進(jìn)而證實(shí)了CAPE抑制HSC-T6細(xì)胞生長與自噬之間的相關(guān)性。由此，筆者團(tuán)隊(duì)以CAPE抗肝纖維化與自噬的關(guān)系為切入點(diǎn)進(jìn)行研究。

注：a,LC3蛋白螢光染色情況；b,LC3蛋白螢光的定量分析。

眾所周知，LC3B Ⅱ是自噬體的可靠蛋白質(zhì)標(biāo)志物，ATG蛋白家族是自噬吞噬過程中自噬體組形成所必需的，且Beclin1作為通過與Bcl-2相互作用的自噬蛋白家族關(guān)鍵調(diào)解蛋白，上述基因表達(dá)水平均與自噬體的數(shù)量呈正相關(guān)[10]。本研究結(jié)果顯示，在CAPE干預(yù)組LC3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均較對照組顯著升高，且發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因ATG5、ATG7、ATG12、Beclin1亦顯著升高，進(jìn)而證實(shí)CAPE可通過誘導(dǎo)自噬發(fā)揮抗肝纖維化作用。因此，筆者團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探究該作用機(jī)制途徑。

既往研究[11]已證實(shí)，AKT/mTOR信號通路與自噬發(fā)生密切相關(guān)，抑制AKT和mTOR的磷酸化可以顯著減輕肝纖維化。Lee等[12]發(fā)現(xiàn)蘆丁和姜黃素等天然化合物可能通過mTOR依賴性途徑誘導(dǎo)HSC發(fā)生自噬，進(jìn)一步提出這些天然化合物對減輕肝纖維化有益處。Park等[13]進(jìn)一步證明了間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過誘導(dǎo)自噬而改善CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，并抑制TGFβ表達(dá)。由此，筆者團(tuán)隊(duì)將GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HSC-T6細(xì)胞中，構(gòu)建了LC3高表達(dá)的細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)給予CAPE干預(yù)后，LC3表達(dá)明顯增強(qiáng)，同時(shí)給予自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素后LC3

注：a,不同干預(yù)情況下，LC3蛋白熒光染色情況；b，LC3蛋白熒光的定量分析；c，不同濃度CAPE對AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

表達(dá)亦顯著增強(qiáng)，然而給予自噬抑制劑3-MA后顯著減低。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)蛋白ATG7、Beclin1和LC3I/Ⅱ表達(dá)水平與LC3表達(dá)相似，而AKT/p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平則與之相反。上述結(jié)果均表明，CAPE可能通過下調(diào)AKT/mTOR信號通路誘導(dǎo)自噬發(fā)生，從而達(dá)到抗肝纖維化的治療目的本研究僅僅從大鼠HSC株HSC-T6方面進(jìn)行研究，認(rèn)為CAPE可能通過抑制HSC-T6細(xì)胞增殖及可能的作用機(jī)制，從而為其抗肝纖維化作用提供有限的理論依據(jù)。而有關(guān)肝纖維化指標(biāo)未在本研究提及，后續(xù)筆者團(tuán)隊(duì)將補(bǔ)充該方面的研究證據(jù)。同時(shí)，大鼠HSC株與人原代HSC又相差較遠(yuǎn)，在后續(xù)研究中宜補(bǔ)充人原代HSC、人肝纖維化組織及肝纖維化動物模型等方面研究，進(jìn)一步闡明CAPE的抗纖維化作用。

綜上所述，CAPE可抑制HSC的增殖，其作用可能是通過誘導(dǎo)HSC發(fā)生自噬，下調(diào)AKT/mTOR信號通路，使其處于新的“穩(wěn)態(tài)”，進(jìn)而有效地降低和延緩細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，抑制肝纖維化進(jìn)程。由此可知，CAPE有可能成為一種新型治潛在治療和預(yù)防肝纖維化的藥物，進(jìn)而為CAPE治療肝纖維化提供理論依據(jù)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：楊寧、石娟娟、黨雙鎖負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；鄧江、王怡愷、王文俊參與收集數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析；楊寧、鄧江、王怡愷、常莎、高寧負(fù)責(zé)課題實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析；楊寧、石娟娟、黨雙鎖負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。