黃芪湯含藥血清對血管內皮生長因子誘導的大鼠肝竇內皮細胞增殖、遷移和成管能力的影響及其作用機制

王浩藝， 麥靜愔， 平 鍵,3， 成 揚,3,4

1 上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院 肝病研究所， 上海 201203； 2 上海市光華中西醫(yī)結合醫(yī)院 治未病科， 上海 200052；3 上海中醫(yī)藥大學肝腎疾病病證教育部重點實驗室， 上海 201203； 4 上海市中醫(yī)臨床重點實驗室， 上海 201203

肝纖維化是肝臟對多種病理刺激的自我修復反應。在該過程中，血管內皮生長因子(VEGF)表達上調，多種細胞因子激活肝星狀細胞，使細胞外基質生成降解失衡、過度沉積。目前多數學者認為肝竇內皮細胞(LSEC)先于肝星狀細胞激活，其持續(xù)去窗孔化、表型改變、形成內皮下基底膜，即肝竇毛細血管化，是肝纖維化、肝硬化的早期特征性病變[1-2]，由此伴隨的內皮功能障礙和血管新生，會進一步加重肝纖維化的進展，并參與門靜脈高壓形成[3-4]。因此，如何抑制LSEC的增殖和血管新生對于肝纖維化、肝硬化的治療具有重要意義[5]。

在肝硬化“虛損生積”理論的指導下[6]，本課題組前期臨床研究[7]發(fā)現，黃芪湯可以改善乙型肝炎肝硬化伴輕、中度食管靜脈曲張患者門靜脈直徑和食管靜脈曲張Palmer評分。動物實驗[8]成功復制膽管結扎大鼠肝硬化門靜脈高壓模型，發(fā)現黃芪湯可以顯著降低門靜脈壓力，減少肝竇毛細血管化標志物的表達?；诖?，本研究體外分離、培養(yǎng)大鼠LESC，進一步觀察黃芪湯對LESC增殖、遷移和成管能力的影響并初步探討其相關機制。

1 材料與方法

1.1 動物 20只雄性SD大鼠，8周齡，體質量180～220 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(滬)2017-0005；實驗動物使用許可證號：XYXK(滬)2020-0009。所有大鼠均飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心清潔級飼養(yǎng)室，飼養(yǎng)環(huán)境：22 ℃，12 h晝夜循環(huán)，自由進食飲水。適應性喂養(yǎng)3 d后進行實驗。

1.2 細胞 分離的雄性SD大鼠原代LSEC。

1.3 藥品 黃芪湯由黃芪30 g和炙甘草5 g組成，委托江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司制作顆粒劑(批號：1212353)，1.2 g黃芪湯顆粒相當于黃芪生藥量6 g、炙甘草生藥量1 g。制備工藝如下：取飲片，加水煎煮二次，合并煎液，過濾。濃縮至一定相對密度的清膏，噴霧干燥，過篩。按照處方取以上提取物，混合30 min使之均勻。將以上混合物干法制粒，制成12～40目顆粒。采用空白鋁箔袋噴印包裝噴碼，按照規(guī)格將顆粒包裝成鋁箔小袋。使用前配置成0.14 g/mL溶液(成人用量為6 g/d，體質量按60 kg計算，大鼠灌胃劑量等效約為人體14倍，因此換算為大鼠每天灌胃劑量1.4 g/kg)。

1.4 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素混合液、RIPA裂解液購于北京索萊寶科技公司，貨號分別為：11995、S9030、P1400、R0010；BCA蛋白檢測試劑盒、噻唑藍(MTT)試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司，貨號分別為：P0012、C0009S、P0018M；重組鼠細胞VEGF購于美國PeproTech公司，貨號：400-31；Matrigel基質膠購于美國Corning公司，貨號：356234；GAPDH抗體、血小板-內皮細胞黏附分子-1(CD31)抗體、內皮性一氧化氮合酶(eNOS)抗體、蛋白激酶B(AKT)抗體、磷酸化(p)-AKT抗體、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗體、磷酸化(p)-mTOR抗體購于英國Abcam公司，貨號分別為：ab9485、ab28364、ab5589、ab126811、ab8805、ab2732、ab63552；內皮素-1(ET-1)抗體購于南京安研生物科技有限公司，貨號：NY-174490M；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗購于英國Abcam公司，貨號：ab97051。5415R型高速低溫離心機(日本Olympus公司)；pectramax M5酶標儀(美國Molecular Devices公司)；DP80倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；041BR127719型電泳儀及轉膜儀(美國Bio-Rad公司)。

1.5 方法

1.5.1 黃芪湯藥物血清制備 隨機選擇SD大鼠10只，按照1.4 g/kg的劑量給予黃芪湯灌胃，另10只大鼠給予相同體積的蒸餾水灌胃。1次/d，連續(xù)3 d。第3天給藥灌胃后2 h，無菌條件下腹主動脈取血10 mL，4 ℃靜置2 h，離心制備血清(3000 r/min、20 min)，56 ℃滅活30 min，過濾，-80 ℃儲存?zhèn)溆?。此藥物血清為高劑量組，1倍比稀釋為中劑量含藥血清，3倍比稀釋為低劑量含藥血清。

1.5.2 大鼠LSEC分離和培養(yǎng) 使用雄性SD大鼠用于分離原代LSEC，分離方法：將前灌流液、膠原酶溶液等置于37 ℃水浴預熱，無菌硅膠管一端通過恒流泵與前灌流液瓶相連，另一端通過氣泡管與穿刺針相連接。大鼠麻醉后，分別用碘酒、酒精消毒皮毛，U型剖腹術分層打開腹腔，暴露內臟。分離門靜脈，在門靜脈近肝門處圍結扎線，門靜脈穿刺，插入留置針，扎緊管口，開啟恒流泵，流量為10～20 mL/min，迅速剪斷下腔靜脈，使肝臟變?yōu)榫鶆虻牡S色。分離肝臟，連同留置針懸掛于放有布氏漏斗的鐵架臺上，待前灌流液灌注約8 min后，開始灌注膠原酶溶液循環(huán)灌注20 min，待肝被膜下肝組織幾乎液化后，快速剪下肝臟，轉移至培養(yǎng)皿，剪碎后放入裝有50 mL膠原酶溶液的硅化三角燒瓶中，加入4 mL DNA酶Ⅰ溶液，加酶配制液至100 mL。將燒瓶放入恒溫水浴振蕩器分散肝組織，200 r/min，37 ℃，20 min。振蕩后將細胞懸液通過二層200目不銹鋼篩濾至2根50 mL離心管中，將細胞懸液離心(900 r/min、5 min)，收集上清。然后將上清離心(1800 r/min、10 min)，收集沉淀；用PBS重懸沉淀后再次離心(1800 r/min、10 min)；再用10 mL PBS混勻沉淀，得到LSEC細胞懸液。沿離心管壁依次加入體積分數50%的percoll 15 mL，體積分數為25%的percoll 20 mL和10 mL細胞懸液，離心(2700 r/min、20 min)。小心吸取50%和25% percoll間的LSEC混濁帶，加等量PBS，混勻，離心(2700 r/min、10 min)；將沉淀懸于10 mL 20% FBS DMEM培養(yǎng)基中，40 min后，收集未貼壁細胞懸液，再培養(yǎng)于另一培養(yǎng)瓶中，并進行細胞計數。LSEC采用含有10% FBS、1%雙抗生素的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃恒溫、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.5.3 LSEC分組和藥物干預處理 LSEC分為6組：空白組，VEGF組，血清對照組，黃芪湯低、中、高劑量組(以下簡稱空白組、VEGF組、血清組、低劑量組、中劑量組、高劑量組)，每組LSEC均采用含有10% FBS、1%雙抗生素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。實驗中各組LSEC藥物干預處理方法如下：(1)空白組，予以上述培養(yǎng)液；(2)VEGF組，予以40 ng/mL的VEGF；(3)血清組，予以VEGF和10%空白血清；(4)低劑量組，予以VEGF和10%低劑量黃芪湯含藥血清；(5)中劑量組，予以VEGF和10%中劑量黃芪湯含藥血清；(6)高劑量組，予以VEGF和10%高劑量黃芪湯含藥血清。

1.5.4 MTT檢測 各組LSEC以1×104個/孔的密度接種于96孔板，予以100 μL上述培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)48 h，然后20 μL/孔加入5 mg/mL MTT溶液，37 ℃恒溫孵育4 h，棄去每孔殘液，150 μL/孔加入二甲基亞砜。將96孔板置于搖床輕微搖動10 min，酶標儀檢測490 nm波長的吸光值，計算細胞活力，細胞活力(%)=處理組細胞吸光值/對照組細胞吸光值×100%。

1.5.5 Transwell實驗 各組LSEC懸浮于無血清培養(yǎng)液，密度為1×106個/mL。在上室(8 μm孔徑)6孔插板上種植500 μL LSEC懸浮液；在下室添加600 μL(10% FBS和1%雙抗生素)DMEM培養(yǎng)液。于37 ℃和5% CO2環(huán)境下孵育24 h，將遷移細胞使用4%多聚甲醛固定15 min，然后使用0.1%結晶紫染色15 min，漂洗，顯微鏡下觀察、計數。

1.5.6 成管實驗 將Corning凝膠基底膜基質(150 μL，10 μg/mL)預包被于24孔板，將密度為1×105個/孔的LSEC種植于24孔板，依照分組加入相應的培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)12 h后，在顯微鏡下觀察LSEC，應用Image J軟件進行血管生成長度測量。血管長度(%)=處理組細胞管長/空白組細胞管長×100%。

1.5.7 Western Blot檢測 各組LSEC培養(yǎng)48 h后收集，使用RIPA裂解液抽提總蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒檢測總蛋白含量，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉膜到PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下1 h進行阻斷封閉，加入CD31(1∶1000)、eNOS(1∶1000)、ET-1(1∶1000)、AKT(1∶1000)、p-AKT(1∶500)、mTOR(1∶1000)、p-mTOR (1∶500)、GAPDH(1∶1000)一抗，4 ℃過夜。加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗(1∶2000)室溫下2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，用ECL發(fā)光液顯影，采用Image J軟件分析。

2 結果

2.1 黃芪湯含藥血清對VEGF誘導大鼠LSEC增殖的影響 MTT檢測結果顯示：與空白組相比，VEGF組、血清組、低劑量組LSEC增殖均顯著增加(P值均<0.05)；VEGF組、血清組、低劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與血清組比較，中、高劑量組的LSEC活性顯著下降(P值均<0.05)，其中高劑量組比中劑量組的細胞活力下降更為明顯(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠LESC活力比較

2.2 黃芪湯含藥血清對大鼠LSEC遷移的影響 Transwell試驗結果顯示：與空白組相比，VEGF組、血清組的LSEC遷移數目顯著增多(P值均<0.05)；血清組與VEGF組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與血清組比較，低劑量組細胞的遷移數目明顯增加(P<0.05)，而中、高劑量組細胞的遷移數目明顯減少(P值均<0.05)(圖1，表2)。

注：a，空白組；b，VEGF組；c，血清組；d，低劑量組；e，中劑量組；f，高劑量組。

表2 各組大鼠LESC遷移細胞數目比較

2.3 黃芪湯含藥血清對大鼠LSEC成管能力的影響 成管實驗結果顯示：空白組LSEC幾乎無管腔結構形成。與空白組相比，VEGF組、血清組能明顯促進LSEC管腔結構形成，其成管節(jié)點數、交叉點數、血管長度均顯著增加(P值均<0.05)；血清組與VEGF組成管能力比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與VEGF組、血清組相比，低劑量組對LSEC成管具有促進作用，可見管腔形成(P值均<0.05)，而中、高劑量組在成管節(jié)點數、交叉點數、血管長度方面均顯著降低，較少有完整管腔形成(P值均<0.05)(圖2，表3)。

2.4 黃芪湯含藥血清對大鼠LSEC表達CD31、eNOS和ET-1的影響 Western blot檢測結果顯示：與空白組比較，VEGF組、血清組LSEC中CD31、eNOS和ET-1蛋白表達顯著升高(P值均<0.05)；VEGF組與血清組蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與VEGF組、血清組比較，低劑量組CD31和eNOS蛋白表達差異不明顯(P>0.05)，ET-1蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與VEGF組、血清組、低劑量組相比，中劑量組CD31、eNOS和ET-1蛋白表達水平均顯著下降(P值均<0.05)；與中劑量組比較，高劑量組CD31、eNOS和ET-1蛋白表達水平均顯著降低(P值均<0.05)(圖3，表4)。

注：a，空白組；b，VEGF組；c，血清組；d，低劑量組；e，中劑量組；f，高劑量組。

表3 各組大鼠LESC成管能力比較

圖3 各組大鼠LSEC中CD31、eNOS、ET-1、GAPDH蛋白表達

2.5 黃芪湯含藥血清對AKT/mTOR信號通路的影響

Western blot檢測結果顯示：與空白組比較，VEGF組、血清組、低劑量組LSEC中p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白表達均明顯增加(P值均<0.05)；VEGF組與血清組之間p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表達的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與低劑量組和血清組相比，中劑量組LSEC的p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白表達水平均明顯下降(P值均<0.05)；與中劑量組比較，高劑量組LSEC的p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白表達水平顯著下降(P值均<0.05)(圖4，表5)。

圖4 各組大鼠LSEC中AKT/mTOR信號通路相關蛋白表達

表5 各組大鼠LESC中AKT/mTOR信號通路蛋白表達比較

3 討論

慢性肝病是全球面臨的主要健康挑戰(zhàn)之一，肝纖維化是慢性肝病進程中重要的病理階段，決定了慢性肝病的發(fā)展和預后。如何控制、逆轉肝纖維化成為慢性肝病治療的關鍵。目前抗肝纖維化治療尚未滿足對預防慢性肝病進展為肝硬化、肝癌的需求[9-10]，在中醫(yī)學整理觀念和辨證論治原則指導下，探索、優(yōu)化中醫(yī)藥抗肝纖維化的治療方案，符合當前肝纖維化治療的主流[11-12]。

表4 各組大鼠LESC中CD31、eNOS、ET-1蛋白表達比較

肝纖維化是肝臟損傷的階段性病理改變，現代醫(yī)學未將其歸屬于一個獨立性的疾病，中醫(yī)古籍亦無肝纖維化的病名記載，現多將其歸屬于“脅痛”“肝積”等范疇，其病因各異，但基本病機可歸納為“虛損生積”，即機體功能損傷，無以化氣，因虛致瘀，因虛生積[13]。治積之要，張元素認為“當先養(yǎng)正則積自除”，強調扶助正氣的重要性。黃芪湯出自北宋《太平惠民和劑局方》，由黃芪、甘草6∶1相虛配伍，黃芪益氣扶正，且能活血生血，甘草緩氣養(yǎng)陰血，且助黃芪益氣補血，與肝纖維化病機相契合，補氣癥自消，養(yǎng)正積自除，虛瘀同治，標本兼顧。

LSEC是肝竇內數目最多的非實質細胞群，在維持肝臟穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要的作用，其結構和功能的改變常常是肝纖維化發(fā)生的初始事件[14]。眾所周知，病理性血管的新生，既伴發(fā)于肝纖維化的發(fā)生，又能加速肝纖維化的進程。肝竇毛細血管化是肝臟微血管生成的主要形式，其發(fā)生能進一步加重肝臟微循環(huán)障礙，促進肝纖維化、肝硬化的發(fā)展及并發(fā)癥的形成，使肝纖維化逆轉更加困難。因此抑制肝竇毛細血管化和LSEC介導的病理性血管新生，可能成為肝纖維化防治的重要策略。生理狀態(tài)下LSEC不表達CD31，隨著肝竇毛細血管化發(fā)生，LSEC表型發(fā)生變化，CD31表達增加，因此CD31被認為是肝竇毛細血管化的標志物[15]。ET-1主要來源于內皮細胞，與內皮素受體結合促進內皮細胞的增殖和遷移，是內皮功能障礙的病理生理學基礎[16]。研究[17]表明LSEC功能障礙和損傷后會合成及分泌豐富的ET-1，引起LSEC窗孔結構改變、縮小，促進肝竇毛細血管化[18]。VEGF是eNOS的激活劑，慢性肝病中VEGF表達升高，促進LSEC表達eNOS，引起內皮細胞增殖和血管通透性改變[19]，有利于長期局部血管的生成[1,20]。AKT是調控細胞增殖、分化和血管生成的重要信號分子，mTOR是其下游信號分子之一，AKT/mTOR信號通路的激活在細胞增殖、血管生成中發(fā)揮重要的作用[21]。

本研究以大鼠LSEC作為研究對象，以VEGF刺激LSEC來模擬肝纖維化發(fā)生時LSEC所處的病理環(huán)境，予以不同劑量的黃芪湯含藥血清干預。結果顯示，血清對照組中在VEGF誘導下可以促進LSEC增殖、遷移和血管新生，促進CD31、eNOS、ET-1蛋白表達和AKT/mTOR信號通路的激活，中、高劑量的黃芪湯含藥血清可以抑制由VEGF誘導的LSEC增殖、遷移和血管新生，抑制CD31、eNOS、ET-1蛋白表達，該作用機制可能與抑制AKT/mTOR信號通路的激活相關。值得注意的是，黃芪湯對LSEC成管能力的影響可能與劑量相關，低劑量時可以促進血管新生，中、高劑量時可以抑制血管新生。關于黃芪湯對LSEC成管能力的影響更深層次的作用機制，本研究團隊將在后續(xù)研究中進一步探索。

倫理學聲明：本研究方案于2019年4月28日經由上海中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審批，批號：PZSHUTCM2019041835，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：王浩藝參與課題設計，收集數據，資料分析，撰寫論文；麥靜愔、平鍵參與課題設計，收集數據，修改論文；成揚負責課題設計，擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。