伏馬毒素是鐮刀菌在環(huán)境條件影響下產(chǎn)生的水溶性有毒次級(jí)代謝物,已發(fā)現(xiàn)的伏馬毒素有30多種,包括FB1、FB2、FB3等,毒性最大的是FB1[1]。玉米在種植、收獲、加工、運(yùn)輸和儲(chǔ)存等過(guò)程易發(fā)生伏馬毒素感染現(xiàn)象。范楷等[2]對(duì)長(zhǎng)三角地區(qū)農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)FB1、FB2、FB3的檢出率為49.0%、35.7%、29.3%。伏馬毒素污染的糧食進(jìn)入食物鏈后,會(huì)對(duì)人的身體健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響[3]。許多國(guó)家和組織制定了食品中多種伏馬毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)[4]。我國(guó)食品中伏馬毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)還未正式頒布,因而對(duì)伏馬毒素的研究具有重要意義[5]。本研究實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法基于同位素稀釋的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,能夠快速提取伏馬毒素,提取效率和靈敏度高。
檢測(cè)方法的測(cè)量不確定度是對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性的評(píng)估,受到各類實(shí)驗(yàn)室的廣泛重視[6]。測(cè)量不確定度是指由于測(cè)量誤差的存在,對(duì)被測(cè)量值不能確定的程度,其對(duì)于評(píng)判檢測(cè)方法的科學(xué)性及準(zhǔn)確性具有重要意義[7]。有研究基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)玉米粉中伏馬毒素B1的不確定度評(píng)定,但檢測(cè)方法缺少FB2和FB3,因此不確定度的評(píng)定不夠完全。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的評(píng)估方法和程序,對(duì)同位素稀釋高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定玉米中FB1、FB2、FB3進(jìn)行不確定度的評(píng)定,以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制提供嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)依據(jù)。
實(shí)驗(yàn)用玉米樣品購(gòu)于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng);甲醇、乙腈,色譜純,sigma公司;甲酸,色譜純,霍尼韋爾公司;甲酸98%,國(guó)藥化學(xué)試劑公司;伏馬毒素B1(50 μg·mL-1)、伏馬毒素 B2(50 μg·mL-1)、伏馬毒素B3(50 μg·mL-1)、13C伏馬毒素混合標(biāo)準(zhǔn)液(U-[13C34]-FB1、U-[13C34]-FB2,均為 5 μg·mL-1)、13C 伏馬毒素B3(U-[13C34]-FB3,10.02 μg·mL-1),Romer公司。
LC-30AD高效液相色譜儀,島津公司;AB Sciex QTRAP 5500三重四極桿質(zhì)譜儀,AB Sciex公司;Allegra 64R臺(tái)式高速離心機(jī),貝克曼公司;TTL-DCⅡ型氮吹儀,同泰聯(lián)公司;Mili-Q超純水機(jī),Millipore公司;Dragon Lab QL902渦旋振蕩器,Dragon Lab公司;SB-3200DTDN超聲波清洗器,新芝生物科技公司。
實(shí)驗(yàn)方法及儀器條件均為實(shí)驗(yàn)室自建,符合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)要求。
1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
(1)外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。分別移取伏馬毒素儲(chǔ)備液 100 μL加 900 μL乙腈∶水(80∶ 20,V/V)稀釋成5 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間工作液;分別移取40 μL伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)中間工作液于5 mL容量瓶中,加入適量乙腈∶水(80∶20,V/V)溶液定容,配制成質(zhì)量濃度均為40 μg·L-1的混合外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液,利用逐級(jí)稀釋的方法,用流動(dòng)相稀釋得到一系列濃度為2 μg·L-1、4 μg·L-1、8 μg·L-1、20 μg·L-1、40 μg·L-1和80 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
(2)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。分別移取40 μL(U-[13C34]-FB1、U-[13C34]-FB2)伏馬毒素混合標(biāo)準(zhǔn)液和20 μL U-[13C34]-FB3溶液于5 mL容量瓶中,加入適量乙腈∶水(80∶20,V/V)溶液,配制成質(zhì)量濃度為40 μg·L-1穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間工作液。
1.2.2 樣品前處理
準(zhǔn)確稱取2.00 g樣品(精確至0.1 mg)于50 mL離心管中,加入50 μL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間工作液渦旋1 min,再加入10 mL乙腈∶水∶甲酸(80∶18∶2,V∶V∶V)溶液,渦旋振蕩1 min,超聲提取20 min;在 4 ℃下 8 000 r·min-1離心 10 min;取 5 mL 上清液在40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL甲醇∶水∶甲酸(30∶70∶0.1,V∶V∶V)溶液,渦旋振蕩1 min,超聲 5 min,12 000 r·min-1離心 10 min,取上層清液上機(jī)待測(cè)。
1.2.3 儀器條件
(1)液相條件。色譜柱:Shiseido-C18(100 mm×2.0 mm×3 μm);進(jìn)樣體積為 10 μL;流速 0.3 mL·min-1;流動(dòng)相A:0.1%甲酸/水溶液,流動(dòng)相B;甲醇溶液;梯度洗脫程序:0~1 min 30% B,1.0~6.5 min 30%→55% B,6.5~8.5 min 55% B,8.5~10.0 min 55%→80% B,10~12 min 80% B,12.0~12.1 min 80%→30% B,12.1~16.0 min 30% B。
(2)質(zhì)譜條件。電噴霧離子源(ESI);離子源溫度:550 ℃;離子噴霧電壓:5 500 V(正模式);氣簾氣:35 psi;氣體1:50 psi;氣體2:55 psi;采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行檢測(cè),質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。
表1 質(zhì)譜條件參數(shù)表
1.2.4 含量計(jì)算
伏馬毒素含量計(jì)算公式為
式中:Xi為樣品中伏馬毒素的含量,μg·kg-1;Ci為從標(biāo)準(zhǔn)曲線所得測(cè)定液中伏馬毒素的濃度,μg·L-1;V為試樣的定容體積,mL;m為試樣的稱樣量,g;D為稀釋倍數(shù),D=2;為回收率校正因子。
在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,測(cè)量不確定度的來(lái)源主要有標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、前處理實(shí)驗(yàn)過(guò)程、標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。
2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液純度引入的不確定度
伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液純度引入的不確定度結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液純度引入的不確定度表
2.1.2 配制標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的不確定度
將 50 μg·mL-1伏 馬 毒 素 混 合 儲(chǔ) 備 液 稀 釋 到5 μg·mL-1。依據(jù)檢定規(guī)程,配制過(guò)程中使用5 mL單標(biāo)線容量瓶2次(矩形分布);5 mL移液槍3次,1 mL移液槍3次,100 μL移液槍6次(三角分布),引入的不確定度見(jiàn)表3。
由于同位素內(nèi)標(biāo)濃度不參與結(jié)果計(jì)算。因此,配制標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為
表3 使用器具引入的不確定度表
2.1.3 溫度引入的不確定度
實(shí)驗(yàn)室溫度為(20±5)℃。標(biāo)準(zhǔn)中間工作液用乙腈定容,室溫20 ℃其膨脹系數(shù)為1.37×10-3/℃。依據(jù)矩形分布,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為
2.2.1 稱量引入的不確定度
天平校準(zhǔn)鑒定證書給定誤差0.5 mg,準(zhǔn)確稱量2.00 g時(shí),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為
2.2.2 量取提取液引入的不確定度
樣品提取時(shí),使用10 mL移液槍準(zhǔn)確量取乙腈∶水∶甲酸=80∶18∶2溶液,根據(jù)校準(zhǔn)證書,20 ℃時(shí)允差為0.14%,標(biāo)準(zhǔn)不確定度(三角分布)為樣品提取后,5 mL移液槍量取5 mL上清液氮吹,20 ℃時(shí)允差為0.15%,標(biāo)準(zhǔn)不確定度(三角分布)為則量取提取液時(shí)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為
配制濃度為 2 μg·L-1、4 μg·L-1、8 μg·L-1、20 μg·L-1、40 μg·L-1和 80 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以濃度為橫坐標(biāo),峰面積比為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和線性相關(guān)系數(shù)r2由最小二乘法線性擬合得到,具體結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線表
擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為定量標(biāo)準(zhǔn)。儀器測(cè)量值與理論計(jì)算值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為
標(biāo)準(zhǔn)溶液殘差平方和為
標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度為
式中:SR為標(biāo)準(zhǔn)曲線Y與相應(yīng)Yi的回歸剩余標(biāo)準(zhǔn)差;p為樣品溶液測(cè)定總次數(shù),p=6;m為標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定總次數(shù),m=6;a為回歸系數(shù);X為樣品中含伏馬毒素含量,μg·L-1;c-為標(biāo)準(zhǔn)溶液中伏馬毒素平均值,μg·L-1;ci為各標(biāo)準(zhǔn)溶液中伏馬毒素量,μg·L-1;yi為標(biāo)準(zhǔn)溶液各點(diǎn)峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積;y為標(biāo)準(zhǔn)溶液各點(diǎn)峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積的回歸值;b為回歸系數(shù)。
表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度結(jié)果表
表6 樣品重復(fù)測(cè)定檢測(cè)及不確定度結(jié)果表
空白玉米樣品加入4 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行6次加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。加標(biāo)回收引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為對(duì)平均加標(biāo)回收率進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),確定平均加標(biāo)回收率與期望值1是否存在顯著性差異,并用t檢驗(yàn)表示。自由度f(wàn)=n-1=5,查t值臨界值分布表,t值均大于雙側(cè)臨界值t(0.05,5)=2.571,表示結(jié)果存在顯著性差異,用回收率校正因子修正。伏馬毒素的回收率和不確定度結(jié)果見(jiàn)表7。
表7 伏馬毒素的回收率和不確定度結(jié)果表
合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為
根據(jù)JJF 1059.1—2012,置信水平為95%時(shí),包含因子k=2,擴(kuò)展不確定度為U(X)=k×X×urel(X),3種伏馬毒素的擴(kuò)展不確定度及檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表8。
表8 伏馬毒素的檢測(cè)結(jié)果表
本實(shí)驗(yàn)綜合考慮各因素,發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)過(guò)程中,標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)不確定度最小,標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程中引入的相對(duì)不確定度最大。因此在實(shí)驗(yàn)中,配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)需遵守操作步驟,移液槍、液相色譜、質(zhì)譜等設(shè)備進(jìn)行定期維護(hù)檢修,保持高靈敏度,定期檢定校準(zhǔn),提高準(zhǔn)確性。