熊長輝，徐建民，楊 夢，宗 俊，潘歡弘，劉曉青

江西省疾病預防控制中心,江西南昌 330029

布魯菌病是由于感染布魯菌引起的人獸共患傳染病。我國引起布魯菌病的病原菌以羊種布魯菌居多，其中又以羊種3型布魯菌為主[1]。為了解江西省近年來布魯菌病流行情況，本研究對江西省近幾年分離的布魯菌進行鑒定和基因多態(tài)性分析。

1 材料與方法

1.1菌株來源 近幾年從江西省布魯菌病監(jiān)測點及醫(yī)院送檢標本中分離得到的布魯菌32株。

1.2儀器與試劑

1.2.1主要儀器 生物安全柜(美國Thermo)、培養(yǎng)箱(日本EYELA SLI-1200)、超凈工作臺(江蘇蘇凈)、PCR儀(美國Bio-Rad)、自動凝膠成像儀(美國Bio-Rad)、高速冷凍離心機(德國Sigma 3-18K)、微量高速離心機(德國Eppendorf)。

1.2.2主要試劑及耗材 PCR引物(上海生工公司合成)、布氏瓊脂(BBL公司)、普通瓊脂糖(Geng公司)、細菌DNA提取試劑盒(凱杰生物)、PCR相關試劑均為大連寶生物公司產品。

1.3方法

1.3.1細菌基因組DNA的提取 從平板上挑取純化培養(yǎng)后的布魯菌先滅活，再按照試劑盒說明書操作步驟，提取布魯菌的DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2布魯菌表面蛋白31(BCSP31)PCR鑒定 參考文獻[2],用BCSP31-PCR對布魯菌進行鑒定。

1.3.3AMOS-PCR鑒定 參考文獻[2]，用AMOS-PCRρ[A、M、O、S分別為牛(Abortus)、羊(Melitensis)、綿羊(Ovis)、豬(Suits)首字母的縮寫]進行布魯菌菌種的鑒定。

1.3.4rpoB基因檢測 布魯菌rpoB基因的PCR擴增，上、下游引物分別為rpoB-F：5′-ATGGCTCAGACCCATTCTTTC-3′，rpoB-R：5′-TTATTCTGCCGCGTCCGGAA-3′。反應體系(25 μL)：10×緩沖液2.5 μL，脫氧核苷三磷酸(dNTPs)2 μL，rpoB上、下游引物各1 μL，Taq酶(5 U/μL)0.5 μL，去離子超純水17 μL，模板1 μL。PCR條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.3.5rpoB-PCR產物測序 PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，獲得特異性目的條帶，并且送上海生工測序。測序結果用MEGA6.0軟件分析。

2 結 果

2.1BCSP31-PCR鑒定 所有菌株DNA的BCSP31-PCR產物經電泳，均顯示出布魯菌特異性條帶，部分菌株的BCSP31-PCR產物電泳結果見圖1。

注：M為分子標準帶；1～13為布魯菌BCSP31-PCR產物；+為陽性對照；-為陰性對照。

2.2AMOS-PCR鑒定 所有菌株DNA AMOS-PCR產物經電泳，均顯示出731 bp的羊種布魯菌特異性條帶，部分菌株的AMOS-PCR產物電泳結果見圖2。

注：M為分子標準帶；1～13為布魯菌AMOS-PCR產物；+為陽性對照；-為陰性對照。

2.3rpoB基因檢測 所有菌株DNA的rpoB基因PCR產物經電泳，均顯示出4 300 bp的特異性條帶，部分菌株的rpoB基因PCR產物的電泳結果見圖3。

注：M為分子標準帶；1～16為布魯菌rpoB基因PCR產物。

2.4rpoB-PCR擴增產物測序 通過MEGA6.0軟件分析其序列，N-J法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，參數設置為“bootrap=500”“cutoff=90%”，羊種布魯菌rpoB基因高度同源，見圖4。

圖4 羊種布魯菌rpoB基因的系統(tǒng)進化樹

3 討 論

布魯菌病是全球范圍的動物源性人獸共患傳染病[3]，據統(tǒng)計全球每年約有50萬布魯菌病新增病例[4-6]。并且布魯菌病感染早期癥狀與其他發(fā)熱性疾病癥狀非常相似，許多患者在發(fā)病早期極易被誤診為其他發(fā)熱性疾病，因此，探討布魯菌病患者早期快速診斷的方法對患者的治療和預后有積極的意義。盡管目前布魯菌病的診斷技術有了較大的提升，但仍存在診斷技術原因導致的誤診和延遲診斷[7]。隨著分子生物學的不斷發(fā)展，PCR檢測技術廣泛應用于布魯菌的診斷，目前文獻報道的PCR方法很多，布魯菌屬水平的檢測一般用普通PCR，其中主要是以BCSP31(B4/B5)、16S rRNA、Virb8，外膜蛋omp25、omp31、LSP pgm等基因為依據設計引物[8-10]，而種水平的鑒定則用多重PCR方法，比如AMOS-PCR[11]。BCSP31是布魯菌中的一種免疫原性膜蛋白，存在于布魯菌的各種型菌株中，根據BCSP31蛋白的基因設計B4-B5引物進行PCR，各種型菌株均可出現特異性擴增產物[12]。AMOS-PCR檢測方法可從屬的水平上鑒定布魯菌，但不能區(qū)分具體種型。有文獻報道顯示，羊種菌依然是當前主要流行種型，牛種菌次之，由此可見AMOS-PCR檢測方法可以涵蓋國內的流行菌株，有較高的應用價值[13]。本研究采用BCSP31基因對近年江西省分離的布魯菌菌株進行鑒定，采取AMOS-PCR進行布魯菌菌種的鑒定，結果顯示江西省近年人感染的布魯菌均為羊種布魯菌。rpoB基因編碼DNA依賴的RNA聚合酶β亞單位，是一個高度保守的管家基因，也常被用作細菌鑒定的標志基因和系統(tǒng)發(fā)育分析的位點[14-15]?；?6S rRNA的分析被普遍認為能鑒定細菌至屬水平，而不能解決近緣種之間的分類問題[16-17]。rpoB基因表現出比16S rRNA更大的優(yōu)越性。李旦等[18]通過對布魯菌rpoB基因的研究，認為rpoB基因能用于鑒定所有的布魯菌種及大部分的生物變種。ADEKAMBI等[19]認為，rpoB基因測序能準確反映細菌的鳥嘌呤加胞嘧啶的百分含量，DNA-DNA雜交水平及平均核苷酸同源性(2個菌株共享的全基因組序列的比例)，能在種和亞種水平反映細菌系統(tǒng)發(fā)育關系，可作為一個強有力的微生物鑒定工具。本研究對近年江西省分離的布魯菌菌株rpoB基因序列進行了同源分析，結果表明與江西省近年人感染的羊種布魯菌rpoB基因序列高度同源。本研究利用BCSP31-PCR和AMOS-PCR對江西省分離的布魯菌進行了鑒定和分型，利用rpoB基因序列進行同源分析，建立了用于布魯菌實驗室鑒定和分型的方法，為布魯菌病的監(jiān)測和疫情的處置提供了更快捷的實驗室檢測手段。