黃少隆，張翠惠，黃冬枚，郭文婷，鄭慶茹，周 湧

廣東省東莞市濱海灣中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞 523903

對(duì)自然界中的細(xì)菌而言，金黃色葡萄球菌(以下簡(jiǎn)稱為金葡菌)是最普通最廣泛的存在，其對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較低，耐受性強(qiáng)[1]，并能產(chǎn)生多種毒素，其中血漿凝固酶、溶血素、腸毒素、毒性休克綜合征毒素等對(duì)感染人群威脅巨大[2-3]?；?、嘔吐、腹瀉、腸炎及休克是感染金葡菌的患者常出現(xiàn)的臨床癥狀，更嚴(yán)重的是，當(dāng)感染進(jìn)一步發(fā)展成全身性敗血癥時(shí)，患者死亡的概率極高[4-5]。然而由于抗菌藥物的濫用，金葡菌耐藥性增加的趨勢(shì)變得越發(fā)難以控制，近些年甚至出現(xiàn)對(duì)萬古霉素敏感性下降的耐甲氧西林金葡菌(MRSA)菌株[6-7]。采用傳統(tǒng)抗菌藥物治療已經(jīng)面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，這迫使研究人員必須積極尋求新型抗菌藥物。毒力因子就像金葡菌的武器，決定著其殺傷力的大小[8]，因此如何奪取和削弱“武器”是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

山豆根，在中國(guó)有著悠久的運(yùn)用歷史，來自越南槐的干燥根及根莖[9]，據(jù)記載這味中藥材性寒、味苦，可用于清熱、消腫、抗菌等[10]。作為一味中藥材卻含有多種生物堿，多糖及有機(jī)酸，藥用價(jià)值較高，但與此同時(shí)也有一定的毒性效應(yīng)，這吸引著人們不斷對(duì)其進(jìn)行探索和研究[11]。近代研究更證實(shí)了山豆根醇提取物，在實(shí)驗(yàn)條件下具有抗病毒、抑菌、抗氧化的作用[12-13]。但是，山豆根是否對(duì)金葡菌毒力表達(dá)有影響，迄今為止，尚未見關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬測(cè)定山豆根對(duì)金葡菌的最低抑菌濃度(MIC)，細(xì)胞膜通透性、菌體形態(tài)變化、溶血活性和外毒素的影響，旨在為山豆根削弱毒力的機(jī)制研究及臨床上山豆根在抗菌治療中的應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1菌株來源 金葡菌菌株ATCC29213來自廣東省臨床檢驗(yàn)中心。MRSA分離于臨床患者標(biāo)本。

1.2儀器與試劑 主要試劑包括β-半乳糖苷酶、脫纖維兔血(Solarbio公司)，α-溶血素多克隆抗體和溶葡萄球菌素、金黃色葡萄球菌A型腸毒素(SEA)和金黃色葡萄球菌B型腸毒素(SEB)多克隆抗體、氮酪蛋白(Sigma公司)，HRP標(biāo)記的羊抗兔(Solarbio公司)。主要儀器包括Phenom G6 pure型掃描電鏡、菲勒D-7型分光光度計(jì)、EPS 600型電泳儀(Tanon公司)、Microfuge5804R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)、iQ5型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)、HM-96A型酶標(biāo)儀(恒美科創(chuàng)公司)、Nano-600型超微量核酸分析儀(上海嘉鵬公司)、Tanon 5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(Tanon公司)。

1.3方法

1.3.1山豆根 用40目篩將粗粉過篩后取1.5 g于索氏提取器進(jìn)行提取，為其濕潤(rùn)滴加2 mL無水乙醇-濃氨試液(3∶2)。放置0.5 h，再加80 mL三氯甲烷后進(jìn)行4 h加熱回流提取。提取液濃縮剩藥渣后用甲醇溶解，移至容量瓶，混勻過濾，得到1.5 g提純藥粉，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2山豆根對(duì)金葡菌的MIC及金葡菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定[14]實(shí)驗(yàn)根據(jù)美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法來測(cè)定山豆根對(duì)金葡菌的MIC。使用紫外分光光度計(jì)調(diào)定菌液濃度為A600=0.4。用MH培養(yǎng)基將該菌液再次稀釋100倍，使得待測(cè)菌液的濃度達(dá)到5×106CFU/mL。量取上述提取1.5 g的山豆根藥粉裝入1.5 mL離心管中，將1.5 g/mL溶液稀釋至0.96 g/mL，后續(xù)再二倍稀釋依次為0.960 0、0.480 0、0.240 0、0.120 0、0.060 0、0.030 0、0.015 0、0.007 5 g/mL。配制完畢，每實(shí)驗(yàn)孔不同梯度濃度的100 μL山豆根加上100 μL菌懸液溶液，肉眼觀察結(jié)果。生長(zhǎng)曲線測(cè)定，調(diào)定菌液濃度A600=0.4，加入不同山豆根的量使得30 mL的溶液最終濃度調(diào)整為0、0.015、0.030、0.060 g/mL。12 h內(nèi)每過1 h檢測(cè)A600并記錄。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程錐形瓶均在搖床中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3金葡菌內(nèi)膜滲性實(shí)驗(yàn)[14]調(diào)整菌液使A600=0.4，加入不同山豆根的量使得30 mL的溶液最終濃度調(diào)整為0、0.015、0.030、0.060 g/mL。0～8 h內(nèi)每隔2 h從搖床上的不同培養(yǎng)液中各取出20 mL，離心，去沉淀，往上清液中加入鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)進(jìn)行反應(yīng)，其濃度為0.05 mol/L。底物反應(yīng)于水浴箱中進(jìn)行，反應(yīng)環(huán)境為37 ℃，40 min。加入8 mL濃度為0.5 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，充分溶解，檢測(cè)A420(反映β-半乳糖苷酶的活性，β-半乳糖苷酶的活性越高，金葡菌內(nèi)膜滲性就越高，表明細(xì)胞膜完整性受到破壞)。

1.3.4掃描電鏡實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)[14]按照要求制備玻片。調(diào)整菌液使A600=0.4，將菌液加入24孔板中37 ℃培養(yǎng)過夜。次日，將0.03 g/mL山豆根加入到菌懸液中作用0、1.5、3.0 h。磷酸鹽緩沖液(PBS)緩慢地沖洗24孔板底部3次，每次15 min，戊二醛進(jìn)行固定2 h。沖洗后再用鋨酸固定30 min，使用50%，70%，80%、90%、100%的乙醇沖洗。最后使用叔丁醇置換乙醇，真空干燥，離子噴金，進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.3.5山豆根對(duì)金葡菌的溶血能力的影響 按上述方法配制山豆根濃度為0 g/mL(作對(duì)照)及0.015、0.030、0.060 g/mL，并與陰性對(duì)照(未加入金葡菌)進(jìn)行比對(duì)。金葡菌菌液離心棄沉淀，取100 μL上清液，800 μL緩沖液，25 μL脫纖維兔血混勻。放置37 ℃溫箱30 min后離心，檢測(cè)A543。

1.3.6測(cè)定山豆根作用后金葡菌外毒素的表達(dá) 調(diào)整菌液使A600=0.3，加入不同山豆根的量使得30 mL的溶液最終濃度為0、0.015、0.030、0.060 g/mL。當(dāng)加有藥液的菌液A600=2.5時(shí)，每個(gè)梯度取2 mL菌懸液進(jìn)行離心，分離上清液，沉淀蛋白。次日重復(fù)一次，保留沉淀，用冰乙醇進(jìn)行反復(fù)洗滌3次風(fēng)干。最后加入1 μL苯甲基磺酰氟(PMSF)和10 μL 0.1 mol/L的Tris緩沖液將沉淀溶解后進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1山豆根的MIC及其對(duì)金葡菌生長(zhǎng)的影響 對(duì)于金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC29213，山豆根的MIC為0.06 g/mL。對(duì)于MRSA菌株觀察得到抑菌作用略差，MIC為0.12 g/mL。不同濃度山豆根作用下金葡菌的生長(zhǎng)曲線見表1、圖1，在同一時(shí)間點(diǎn)上山豆根濃度越高，對(duì)生長(zhǎng)的抑制越明顯。

表1 不同濃度山豆根作用下金葡菌菌液A600的檢測(cè)值

續(xù)表1 不同濃度山豆根作用下金葡菌菌液A600的檢測(cè)值

圖1 不同濃度山豆根作用下金葡菌的生長(zhǎng)曲線

2.2山豆根作用不同時(shí)間點(diǎn)的金葡菌內(nèi)膜通透性的變化 隨著山豆根濃度的升高，β-半乳糖苷酶的活性也逐漸增加，見表2、圖2。

圖2 山豆根作用后金葡菌β-半乳糖苷酶的活力變化

表2 不同濃度山豆根作用下MRSA菌株菌液在A420的檢測(cè)值

2.3掃描電鏡下細(xì)菌的形態(tài)分析 在0.03 g/mL山豆根刺激作用下，0、1.5、3.0 h不同時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生著顯著的改變。對(duì)照組中，菌體形態(tài)正常呈現(xiàn)圓形均勻，細(xì)胞膜完整，表面平滑沒有粘連。山豆根作用1.5或3.0 h時(shí)細(xì)胞均有不同程度的變化，菌體形態(tài)不再是完整的球狀，1.5 h時(shí)的細(xì)菌已破裂，發(fā)生扭曲，凹陷，但有少數(shù)菌體仍處于完整的狀態(tài)。3.0 h時(shí)，菌體破裂程度進(jìn)一步加深，周圍出現(xiàn)碎片，菌體數(shù)量減。見圖3。

注：A為對(duì)照組；B為山豆根作用1.5 h時(shí)；C為山豆根作用3.0 h時(shí)。

2.4山豆根對(duì)金葡菌溶血活力的影響 在0、0.015、0.030、0.060 g/mL濃度的山豆根作用下，金葡菌溶血能力呈逐漸下降趨勢(shì)，溶液顏色逐漸由紅色變成無色，溶血活力分別為100.00%、67.80%、37.13%、9.11%、9.01%,見圖4。

注：A為溶液顏色觀察；B為菌株溶血活力隨山豆根作用濃度的變化情況；**表示與未標(biāo)記組比較P<0.05。

2.5Western blot檢測(cè)山豆根對(duì)毒力蛋白的影響 隨著山豆根濃度增加，蛋白條帶寬度變窄，說明山豆根對(duì)金葡菌這3種毒素表達(dá)量的影響隨作用濃度的增加而增加。山豆根作用濃度為0.060 g/mL時(shí)，SEA和SEB的條帶顏色幾乎看不見，即此濃度下可以完全抑制SEA和SEB的分泌。因此，MIC的山豆根對(duì)金葡菌所分泌的有著顯著的抑制作用，且作用效果有劑量依賴性。見圖5。

圖5 亞抑菌濃度的山豆根對(duì)MRSA菌株分泌的α-溶血素、SEA以及SEB蛋白的western blot分析

3 討 論

控制細(xì)菌感染的治療中，抗菌藥物的使用無疑是人類手中的殺手锏，然而細(xì)菌耐藥性的發(fā)展正是為躲避“追殺”而演化出的特殊技能，人類對(duì)此無能為力。研究表明，金葡菌可以通過群體感應(yīng)系統(tǒng)來感知外部感染環(huán)境及菌群的密度的變化，從而調(diào)節(jié)菌群的速度及多種毒力因子包括α-溶血素、SEA以及SEB等的表達(dá)[15]，使菌群群體行為更有利于生存。如果控制細(xì)菌毒力的表達(dá)同時(shí)又不對(duì)細(xì)菌生存產(chǎn)生選擇性的壓力，這可能是阻止細(xì)菌耐藥發(fā)展進(jìn)程的最佳手段。同時(shí)，當(dāng)細(xì)菌失去了毒力因子后，攻擊力大幅度下降，此時(shí)機(jī)體的免疫系統(tǒng)則可以發(fā)揮更全面更有效的清除作用[16]。因此，許多研究者把目光轉(zhuǎn)向天然的中草藥抑菌研究中，以期從中分離出此類抗菌抑制物。研究表明，山豆根中含有黃酮類、生物堿類、酚類、皂苷類、有機(jī)酸、多糖、微量元素等多種化學(xué)成分[17]，清熱解毒的特性可用于臨床上咽喉腫痛、牙齦發(fā)炎、肝炎、黃疸等病癥。近年來，其在抗菌及抗病毒方面的作用的研究也備受關(guān)注。苦參堿類為山豆根根狀莖中主要的活性成分之一，研究表明其對(duì)H3N2流感病毒及柯薩奇B3病毒有著明顯的抑制作用[18]，而乙型肝炎病毒則對(duì)喹諾里西啶類生物堿敏感[19]。山豆根中含有的眾多種生物堿對(duì)多種細(xì)菌也具有抑制作用，呈現(xiàn)量效關(guān)系[20]。但山豆根對(duì)金葡菌抑制作用研究甚少，基于此本實(shí)驗(yàn)從金葡菌的生長(zhǎng)、細(xì)胞膜完整性、溶血能力及外毒素的表達(dá)等方面進(jìn)行研究，現(xiàn)分析如下。

山豆根對(duì)金葡菌的生長(zhǎng)抑制作用較差，對(duì)于金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC29213，山豆根的MIC為0.060 g/mL。同時(shí)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，其對(duì)于MRSA菌株抑制作用更弱，MIC為0.120 g/mL，提高了1倍。隨著作用時(shí)間增加，每個(gè)濃度梯度的金葡菌均有所增殖，但速率卻不盡相同。無山豆根組曲線反映的是在正常不受任何外界環(huán)境的刺激下的生長(zhǎng)情況，金葡菌在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的菌液吸光度始終呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在0.015 g/mL山豆根作用后，生長(zhǎng)曲線略低于正常生長(zhǎng)曲線，在0.030 g/mL山豆根的作用下，金葡菌的增殖更加緩慢；在0.60 g/mL山豆根作用下，9 h后金葡菌的生長(zhǎng)曲線明顯受到抑制。

金葡菌正常的生長(zhǎng)狀態(tài)下，β-半乳糖苷酶存在于細(xì)胞膜內(nèi)，并不會(huì)分泌到外界。但如果當(dāng)細(xì)胞膜完整性受到破壞，β-半乳糖苷酶便會(huì)通過膜滲透到懸液中，使A值發(fā)生改變。所以，可通過檢測(cè)β-半乳糖苷酶的活力來研究山豆根對(duì)金葡菌細(xì)胞內(nèi)膜的破壞程度。實(shí)驗(yàn)表明，山豆根可破壞金葡菌細(xì)胞膜通透性，增加山豆根的濃度，可升高溶液的A420值，兩者存在正相關(guān)性，這表明山豆根對(duì)金葡菌細(xì)胞膜通透性破壞能力呈劑量依賴性。隨著山豆根濃度的升高，β-半乳糖苷酶的活性也逐漸增加。山豆根破壞了細(xì)胞膜的完整性，濃度越高破壞力越強(qiáng)，細(xì)胞膜的內(nèi)膜通透性增大，β-半乳糖苷酶從胞內(nèi)流入胞外。在本次研究中，當(dāng)山豆根濃度為0.060 g/mL時(shí)，其能夠持續(xù)作用于金葡菌細(xì)胞膜，而0.015 g/mL和0.030 g/mL的時(shí)間線均呈現(xiàn)出拋物線，分別在2 h和4 h達(dá)到高峰。這表明，山豆根濃度為0.060 g/mL時(shí)對(duì)金葡菌感染治療有較理想的藥用價(jià)值。為了更直觀地證明山豆根主要作用于金葡菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，本實(shí)驗(yàn)利用掃描電鏡從形態(tài)上判斷菌體細(xì)胞是否受到山豆根的損害。從圖中可以看出，在山豆根作用下的金葡菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)均受到不同程度的破壞，特別是作用3 h后可以明顯觀察到菌體周圍出現(xiàn)碎片，細(xì)菌數(shù)量減少等現(xiàn)象。根據(jù)以往研究報(bào)導(dǎo)，可以推斷出在山豆根作用下，它可以首先作用于蛋白質(zhì)，脂質(zhì)等細(xì)胞外膜，隨著時(shí)間的增加，它可以穿過肽聚糖進(jìn)入細(xì)胞膜，使得細(xì)胞膜發(fā)生顯著的彎曲和畸形。

金葡菌的溶血素有著很強(qiáng)大的溶血能力，對(duì)人類細(xì)胞破結(jié)構(gòu)壞力巨大，并在細(xì)胞膜表面形成多聚體通道，造成細(xì)胞內(nèi)信號(hào)肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽、酶等生物分子流失。溶血素還可以引起血管抽搐，造成血流不暢，導(dǎo)致組織缺血壞死。如果大量的溶血素進(jìn)入大腦血管，可以使人腦生物電驟停，使生命體死亡。本實(shí)驗(yàn)主要通過測(cè)定不同濃度下的山豆根對(duì)金葡菌溶血活力的抑制作用，分別從定性以及定量?jī)蓚€(gè)方面來加以說明。實(shí)驗(yàn)可以直觀地反映出有山豆根作用的金葡菌的溶血能力比無山豆根組弱，當(dāng)濃度足夠大時(shí)，溶液顏色達(dá)到最淺接近空白組。從定量的實(shí)驗(yàn)分析，在0.015、0.030、0.060 g/mL的山豆根作用下，金葡萄溶血能力分別為67.80%、37.13%、9.11%，逐漸下降到與空白組的9.01%相近。由以上可以得出結(jié)論，亞抑菌濃度下的隨著山豆根作用濃度增加金葡菌的溶血能力下降。

Western blot從蛋白質(zhì)水平分析了在0、0.015、0.030、0.060 g/mL的山豆根對(duì)3種金葡菌毒力蛋白α-溶血素、SEA和SEB的抑制情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：相較于無山豆根組，加了山豆根的實(shí)驗(yàn)組隨著山豆根濃度增大，條帶寬度也越來越窄，表明這3種毒力蛋白表達(dá)減少。在0.06 g/mL的山豆根作用下，抑制的作用最明顯。由此得出，亞抑菌濃度下的山豆根對(duì)金葡菌所分泌的α-溶血素、SEA和SEB有著明顯的抑制作用，且作用效果呈劑量依賴性。

綜上所述，提純后山豆根粉對(duì)金葡菌的生長(zhǎng)抑制作用不明顯，對(duì)于MRSA菌株更是提高了一倍。但在在亞抑菌濃度下可使菌體胞膜的完整性被破壞使菌體形態(tài)發(fā)生改變，同時(shí)溶血活性下降，α-溶血素、SEA和SEB表達(dá)減少。鑒于各種毒素因子在金葡菌致病過程中的關(guān)鍵作用，山豆根具有成為抗金葡菌感染藥物的潛力。