鄧立康,袁潤鵬,于子涵,吳又多,劉曉峰,薛 闖
(1. 國投生物能源(鐵嶺)有限公司,遼寧 鐵嶺 112700;2.大連理工大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連 116024)
我國石油資源匱乏,2018年石油凈進(jìn)口4.619億t,石油對外依賴度為70.9%,相比2017年增加了10.1%[1]。與此同時,我國農(nóng)業(yè)秸稈年產(chǎn)生量超過9億t,能源化利用潛力十分巨大。因而,利用這些廢棄生物質(zhì)資源生產(chǎn)可再生能源,是我國解決資源和能源瓶頸制約、轉(zhuǎn)變經(jīng)濟(jì)增長模式、保障循環(huán)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的重要能源戰(zhàn)略。事實上,纖維素乙醇是以農(nóng)業(yè)廢棄物、木材等生物質(zhì)中的纖維素為主要原料,通過微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化的燃料乙醇產(chǎn)品,一般包括原料預(yù)處理、纖維素酶水解、微生物發(fā)酵等工藝流程,該生產(chǎn)工藝提高了廢棄物資源能源化利用率。盡管我國秸稈等木質(zhì)纖維素生物質(zhì)資源儲備豐富,但纖維素乙醇起步較晚,與國外生產(chǎn)技術(shù)及產(chǎn)業(yè)化水平差距較大,纖維素乙醇生產(chǎn)工藝成本居高不下,在原料預(yù)處理、纖維素酶水解、發(fā)酵等工藝環(huán)節(jié)存在著一些技術(shù)難題亟待解決,如預(yù)處理工藝復(fù)雜、能耗較高且收率較低、纖維素酶使用成本高、野生或選育菌株生產(chǎn)性能不足等,這些嚴(yán)重制約了我國纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化發(fā)展?;诖耍疚膶⒅攸c圍繞近年來纖維素乙醇的生物煉制工藝及研究進(jìn)展展開分析與討論,以期為科研人員提供必要的研究依據(jù)與參考。
化石燃料的使用導(dǎo)致全球CO2含量升高,溫室效應(yīng)加劇,自1813年至2019年,大氣中CO2含量由220增至411 mg/L[2],而利用可再生生物質(zhì)能有助于減緩CO2排放[3],其中,乙醇由于具有較高的辛烷值、良好的抗爆性和低污染性,被認(rèn)為是理想的可再生替代能源之一[4]。生物乙醇根據(jù)其原料來源的不同可分為第一代淀粉基燃料乙醇和第二代纖維素燃料乙醇[5]。纖維素乙醇是通過纖維素酶降解后再進(jìn)行發(fā)酵所獲得的乙醇,與汽油相比,玉米乙醇可減少 39%~52%的溫室氣體排放,而纖維素乙醇可減少86%的溫室氣體排放[6-7]。事實上,世界各國積極采取新的能源舉措并出臺相關(guān)政策,在減少化石燃料使用的同時,加大扶持可再生能源產(chǎn)業(yè)[8],全球燃料乙醇需求與產(chǎn)量激增,2019年高達(dá)8 800萬t,比2000年提升了731%[9]。
巴西是最早使用燃料乙醇的國家,2015年巴西政府規(guī)定汽油混合無水乙醇的體積分?jǐn)?shù)為27%[10],2016年其生物乙醇總產(chǎn)量約為2 100萬t[11],同時,巴西正逐步推動纖維素乙醇替代淀粉質(zhì)乙醇。美國是世界上最大的燃料乙醇生產(chǎn)國,自1995年的《清潔空氣修正法案》以及美國可再生燃料標(biāo)準(zhǔn)頒布后,其燃料乙醇產(chǎn)量不斷攀升,2018年總產(chǎn)量已達(dá)到4 800萬t[12-13]。由于相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展較晚,所以我國生物乙醇生產(chǎn)規(guī)模較小,僅占世界產(chǎn)量的4%。2017年,國家發(fā)改委、國家能源局、財政部等十五部門聯(lián)合印發(fā)了《關(guān)于擴(kuò)大生物燃料乙醇生產(chǎn)和推廣使用車用乙醇汽油的實施方案》,進(jìn)一步推進(jìn)燃料乙醇和纖維素乙醇的生產(chǎn)[14-16]。根據(jù)該方案,到2025年,力爭纖維素乙醇實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn),先進(jìn)生物液體燃料技術(shù)、裝備和產(chǎn)業(yè)整體達(dá)到國際領(lǐng)先水平。
事實上,全球生物乙醇仍以淀粉質(zhì)、糖類為主要原料,以纖維素生物質(zhì)為原料的燃料乙醇生產(chǎn)占比很低。截至2018年,美國年產(chǎn)纖維素乙醇1.9萬t,占其燃料乙醇生產(chǎn)總量的0.003 9%,全球纖維素乙醇產(chǎn)量在生物乙醇產(chǎn)量中的占比低于3%[13,16-17]。因此,纖維素乙醇仍具有較大的市場空間,全世界各地都逐漸建立起生產(chǎn)纖維素乙醇的工廠。如,在羅馬尼亞,科萊恩公司計劃建成占地面積 0.1 km2、年處理秸稈25萬t、年產(chǎn)5萬t纖維素乙醇的工藝生產(chǎn)線[18]。科萊恩、安徽國禎集團(tuán)與康泰斯聯(lián)合聲明,計劃投入使用年產(chǎn)5萬t纖維素乙醇的生產(chǎn)設(shè)備[19]。事實上,Raízen公司作為全球知名能源企業(yè),投資約1.3億美元,已于2014年開始建立年產(chǎn)3.2萬t纖維素乙醇的生產(chǎn)工藝[20]。
纖維素乙醇主要通過菌株發(fā)酵纖維素水解糖(葡萄糖、木糖)生產(chǎn)乙醇,如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)和樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)等[21-24]。以葡萄糖為例,菌株攝取葡萄糖后,經(jīng)過丙酮酸途徑將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸,丙酮酸經(jīng)過裂解生成乙醛以及CO2,在乙醇脫氫酶作用下,以NADH為底物將乙醛還原為乙醇。由于含有木質(zhì)纖維素的生物質(zhì)原料具有較強(qiáng)的力學(xué)強(qiáng)度和較為復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)[25-26],須經(jīng)過預(yù)處理,通過纖維素酶水解獲得發(fā)酵單糖,再進(jìn)行乙醇發(fā)酵。
第一代生物乙醇多以玉米、甘蔗、甜菜和甜高粱等糧食作物為原料[27-30],這導(dǎo)致在減少糧食供應(yīng)的同時,也不利于緩解全球碳排放及溫室效應(yīng)[28,31]。另一方面,以農(nóng)業(yè)廢棄物為代表的木質(zhì)纖維素生物質(zhì),富含葡萄糖、木糖和阿拉伯糖等單糖組分[32-33],可被微生物利用并轉(zhuǎn)化為乙醇,這些原料包括玉米秸稈、小麥秸稈、水稻秸稈、玉米芯、甘蔗渣、酒糟及農(nóng)產(chǎn)品加工廢料等[34-41],利用這些原料生產(chǎn)纖維素乙醇,可提高廢棄物資源化、能源化利用綜合效益,也有助于減少碳排放[42-43]。如Tinco等[44]以甜高粱秸稈為原料,經(jīng)酸堿預(yù)處理、纖維素酶水解后,再利用馬克斯克魯維酵母發(fā)酵,乙醇產(chǎn)量、產(chǎn)率分別為17.83 g/L與0.74 g/(L·h)。Perrone等[45]也以甘蔗渣為原料,依次經(jīng)臭氧、稀酸預(yù)處理及纖維素酶水解后,利用釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇,產(chǎn)量為2.2 g/L。事實上,木質(zhì)素、纖維素和半纖維素所形成的致密結(jié)構(gòu)使得這些原料難以被生產(chǎn)菌株直接利用,為了打破這一特殊屏障,必須通過物理、生物、化學(xué)或聯(lián)合預(yù)處理方法對原料進(jìn)行處理,提高原料水解釋放葡萄糖、木糖和阿拉伯糖等總發(fā)酵糖的得率,還要兼顧減少預(yù)處理過程中產(chǎn)生的毒性副產(chǎn)物,為生產(chǎn)菌株提供良好的乙醇發(fā)酵微環(huán)境[46]。
物理法旨在利用機(jī)械等非化學(xué)手段來對木質(zhì)纖維素進(jìn)行處理,利用力或者其他方式所產(chǎn)生的能量等來破壞木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)[47],主要有機(jī)械破碎法、水熱法以及蒸汽爆破法。機(jī)械破碎法是通過機(jī)器對含有高纖維素的物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)破壞,增大表面積以增強(qiáng)酶解效果[48]。Qu等[49]利用氧化鋯為填充介質(zhì)的震動球磨機(jī)對玉米秸稈進(jìn)行干式球磨,再用NaOH溶液進(jìn)行預(yù)處理,酶解超過72 h后葡萄糖轉(zhuǎn)化率為100%。蒸汽爆破法是利用高壓作用破壞分子間共價鍵,達(dá)到分散纖維素等組分結(jié)構(gòu)的目的[50]。Huang等[51]對酸解處理后的棉稈在225 ℃條件下蒸汽爆破3 min,己糖得率可達(dá)到0.16 g/g。Barros等[52]對斯卑爾脫小麥進(jìn)行稀酸預(yù)處理后,再使用180 ℃高溫蒸汽處理10 min,獲得葡萄糖得率為0.28 g/g,而糠醛得率僅為3.35 mg/g。此外,微波法也可以在短時間內(nèi)破壞原料晶體結(jié)構(gòu),有利于纖維素組分的水解糖化[53-54],超聲法則利用液體中的空泡破裂所產(chǎn)生的剪切力來對纖維素進(jìn)行破壞[55]。其他處理方法還包括輻射法、電子束處理、等離子氣體處理方法以及紫外線處理法等[26,44,56-58]。值得注意的是,微波法與超聲法只能部分破壞纖維素結(jié)構(gòu),所以常作為預(yù)處理輔助手段[59-60]。
生物預(yù)處理法主要利用細(xì)菌以及真菌,如白腐真菌(white-rot fungi)、棕腐真菌(brown-rot fungi)、軟腐真菌(soft-rot fungi)、里氏木霉(Trichodermareesei)和黑曲霉(Aspergillusniger)等實現(xiàn)對木質(zhì)纖維素原料的初步降解[46,61-62]。Hermosilla等[62]利用密赫褶菌(Gloeophyllumtrabeum)在25 ℃下對小麥秸稈處理10 d后,再用層疊樹舌(Ganodermalobatum)處理20 d,最終酶解的葡萄糖得率為0.192 g/g。
化學(xué)法預(yù)處理是利用酸、堿、離子液體以及有機(jī)溶劑等化學(xué)試劑對木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞[63]。Tang等[64]利用4% H2SO4和腐殖酸,以1∶ 10固液比在60 ℃下先處理小麥秸稈30 min,再升溫至180 ℃處理40 min,酶解的葡萄糖得率為0.52 g/g。然而,在高溫條件下,酸預(yù)處理易產(chǎn)生糠醛以及羥甲基糠醛等毒性副產(chǎn)物,嚴(yán)重影響乙醇發(fā)酵[65]。相對應(yīng)的,堿預(yù)處理可破壞纖維素內(nèi)部酯鍵,造成斷裂,同時改變其表面積與結(jié)晶度[66]。Mota等[67]以甘蔗渣為原料,利用0.25 mol/L NaOH溶液,以1∶ 4固液比在202 ℃下處理40 min,酶解得到25.8 g/L葡萄糖,得率為0.423 g/g。有機(jī)溶劑預(yù)處理則通過解離纖維素與半纖維素,降低纖維素結(jié)構(gòu),這些溶劑包括甲醇、丙酮和乙醇等[68],但同時溶劑具有較高毒性,可能造成環(huán)境污染。離子液體法是一種綠色、高效的預(yù)處理方法,利用有機(jī)鹽斷裂β-O-4化學(xué)鍵,破壞纖維素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[69]。Asim等[70]利用吡啶與硫酸制成[PyH][HSO4·(H2SO4)]離子溶液,在100 ℃下預(yù)處理50 g/L小麥秸稈2 h,酶解葡萄糖得率為0.442 g/g。但離子液體同樣具有一定毒性,難以回收而且昂貴,對于規(guī)?;I(yè)使用來說有一定挑戰(zhàn)和難度[71]。
綜合來看,以機(jī)械破碎法、水熱法以及蒸汽爆破法為代表的物理預(yù)處理方法,能夠有效增加原料比表面積和孔徑尺寸、降低纖維素結(jié)晶度和聚合程度、并產(chǎn)生極少毒性的副產(chǎn)物,但存在著能耗大、無法脫除木質(zhì)素、后續(xù)酶解受木質(zhì)素嚴(yán)重抑制的問題。以酸堿化學(xué)試劑為代表的化學(xué)預(yù)處理方法,能夠高效脫除部分木質(zhì)素及半纖維素,降解半纖維素為單糖,因而具有良好的經(jīng)濟(jì)性及工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用前景,但也存在著反應(yīng)條件劇烈、腐蝕損耗反應(yīng)設(shè)備、產(chǎn)生復(fù)雜毒性副產(chǎn)物且嚴(yán)重抑制酶解、發(fā)酵的問題。以細(xì)菌及真菌為代表的生物預(yù)處理方法,能夠在溫和反應(yīng)條件下降解木質(zhì)素和半纖維素,降低纖維素聚合程度,但微生物處理效率較低,現(xiàn)階段并不適用大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。因而,針對不同種類的木質(zhì)纖維素原料組分和結(jié)構(gòu)特征,聯(lián)合物理、化學(xué)及生物預(yù)處理方法的優(yōu)勢,降低預(yù)處理能耗,減少毒性副產(chǎn)物生成,提升半纖維素、木質(zhì)素脫除率,最大限度保留纖維素組分,是提高原料預(yù)處理效率、原料適用性及利用率的有效途徑。
預(yù)處理過程可將纖維素組分剝離,使得纖維素酶更易于降解纖維素為發(fā)酵單糖,有利于纖維素乙醇生產(chǎn)菌株的利用轉(zhuǎn)化。纖維素酶是由葡聚糖酶和葡萄糖苷酶所形成的混合物,破壞纖維素的β-1,4糖苷鍵從而生成葡萄糖[72]。事實上,纖維素酶水解是纖維素乙醇生產(chǎn)工藝中成本最高的單元操作:一方面,由于纖維素酶活性易受溫度、pH、底物及水解產(chǎn)物影響;另一方面,預(yù)處理殘余木質(zhì)素組分等物質(zhì)形成的環(huán)境因素會引起組分基質(zhì)效應(yīng)、纖維素酶吸附效應(yīng)、水束縛效應(yīng)、抑制物效應(yīng)等,影響體系傳質(zhì)、傳熱和反應(yīng)特性,造成纖維素酶活下降、水解反應(yīng)效率及原料利用率降低,必須提高或補(bǔ)充纖維素酶用量,這導(dǎo)致纖維素乙醇生產(chǎn)成本居高不下。因而,通過開發(fā)纖維素酶高產(chǎn)菌株、優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)酶工藝、進(jìn)行纖維素酶就地生產(chǎn),可以有效降低纖維素酶使用成本。Shen等[73]在里氏木霉生產(chǎn)的纖維素酶(30 FPU/g)基礎(chǔ)上,復(fù)配黑曲霉生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶(50 FPU/g),在檸檬酸緩沖液中,50 ℃、150 r/min條件下酶解NaOH預(yù)處理后的玉米秸稈,纖維素轉(zhuǎn)化率達(dá)70%以上,該混合酶在相同濃度下的酶促作用與諾維信公司的Cellic Ctec2相同,有助于降低成本。齊慧等[74]利用NaOH和輻照預(yù)處理稻草后,再以10 FPU/g纖維素酶添加量,在50 ℃、130 r/min條件下酶解24 h,纖維素的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到78.5%。Ding等[75]研究證實,牛血清蛋白(BSA)可有效解除木質(zhì)素對纖維素酶的吸附作用,按10 FPU/g添加纖維素酶于醋酸鈉緩沖體系中,48 ℃下酶解堿處理后的楊木72 h后,可得27.36 g/L葡萄糖,得率為0.394 g/g。表面活性劑(如吐溫80)有助于緩解木質(zhì)素對纖維素酶的吸附作用,同時降低反應(yīng)體系黏度,進(jìn)而促進(jìn)酶解效率[76]。Zhang等[77]按20 FPU/g添加纖維素酶,同時混合150 mg/g吐溫80,在180 ℃下對乙醇-NaOH預(yù)處理后的甘蔗渣進(jìn)行酶解24 h后,葡萄糖產(chǎn)率可達(dá)到93%。
現(xiàn)階段纖維素乙醇發(fā)酵工藝主要包括分步水解發(fā)酵(SHF)、同步糖化發(fā)酵(SSF)、同步糖化共發(fā)酵(SSCF)以及聯(lián)合生物加工(CBP)工藝[78-79]。
SHF工藝是將酶解及發(fā)酵兩個過程作為兩個獨(dú)立的單元進(jìn)行操作,纖維素底物先經(jīng)過纖維素酶水解,降解為葡萄糖可發(fā)酵單糖,然后再經(jīng)酵母發(fā)酵將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇,即在各自最佳溫度等條件下,分別進(jìn)行原料水解與乙醇發(fā)酵過程[80]。Song等[81]利用30% H2O2和乙酸,在85 ℃條件下預(yù)處理竹子2 h后充分水洗,按30 FPU/g纖維素酶用量,45 ℃、200 r/min酶解獲得水解液,釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) KCTC 7906發(fā)酵最高獲得13.2 g/L乙醇,乙醇產(chǎn)率及得率分別為0.135 g/(L·h)與0.144 g/g。Chen等[82]利用亞臨界水對小麥秸稈進(jìn)行預(yù)處理,再按30 FPU/g纖維素酶和1 U/gβ-葡萄糖苷酶于50 ℃、120 r/min充分酶解,最終釀酒酵母NX11424發(fā)酵獲得37 g/L乙醇,乙醇產(chǎn)率及得率分別為0.192 g/(L·h)與0.193 g/g。Trinh等[83]利用0.25%HCl和70%甘油混合液,在190 ℃下預(yù)處理水稻秸稈3 h,充分水洗脫毒與酶解后,利用樹干畢赤酵母CBS 6054進(jìn)行SHF,乙醇產(chǎn)量、產(chǎn)率及得率分別為9.66 g/L、0.101 g/(L·h)及0.193 g/g。
SSF工藝是將酶解及發(fā)酵兩個過程在一個容器中同時進(jìn)行,使纖維素底物水解得到的葡萄糖立即被發(fā)酵微生物代謝轉(zhuǎn)化為乙醇[84]。Huang等[85]首先利用堿性H2O2溶液預(yù)處理竹子60 min,再充分水洗后,以300 g/L固液比、25 FPU/g纖維素酶及150 U/g木聚糖酶添加量,于36 ℃、150 r/min接種酵母進(jìn)行SSF,全程控制pH 4.8,發(fā)酵228 h后檢測得到81.47 g/L乙醇,產(chǎn)率與得率分別達(dá)到0.36 g/(L·h)與0.272 g/g。Sewsynker-Sukai等[86]利用鹽和稀酸于121 ℃下預(yù)處理玉米芯15 min,再充分水洗與干燥后,按200 g/L固液比、30 FPU/g纖維素酶用量,于檸檬酸鹽緩沖液中50 ℃下預(yù)水解24 h,再調(diào)整至35 ℃后接種釀酒酵母BY4743進(jìn)行SSF,最終發(fā)酵乙醇產(chǎn)量及產(chǎn)率分別為42.24 g/L與0.59 g/(L·h),乙醇得率為0.212 g/g。Qiu等[87]利用85%H3PO4與30%H2O2混合溶液預(yù)處理玉米秸稈,然后用乙醇和蒸餾水清洗并充分酶解,釀酒酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)量、產(chǎn)率及得率分別為69.9 g/L、0.569 g/(L·h)及0.155 g/g。
SSCF工藝是利用能夠代謝戊糖的發(fā)酵微生物,將木質(zhì)纖維原料中半纖維素降解產(chǎn)生的戊糖(木糖、阿拉伯糖)和纖維素降解產(chǎn)生的葡萄糖,在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)乙醇[88-89]。Du等[90]利用H2SO4-H3PO4于128 ℃預(yù)處理玉米芯1 h后,將馬克斯克魯維酵母、20 FPU/g纖維素酶接入12.5%毒性混合料液中,在40 ℃、200 r/min條件下進(jìn)行SSCF,最終發(fā)酵乙醇最大產(chǎn)量、產(chǎn)率以及得率分別為12.23 g/L、0.1 g/(L·h)及0.098 g/g。Bu等[91]利用濃度為175 mmol/L的過一硫酸氫鉀(PMS)溶液對甘蔗渣預(yù)處理10 h后充分水洗烘干,再按1∶ 3固液比、15 FPU/g纖維素酶添加量,在30 ℃,利用釀酒酵母SHY07-1進(jìn)行SSCF,發(fā)酵216 h后乙醇產(chǎn)量為120.77 g/L,乙醇產(chǎn)率及得率分別為0.53 g/(L·h)及0.36 g/g。
CBP工藝是在同一個生物反應(yīng)器中,利用單一或多種微生物,完成纖維素酶生產(chǎn)、木質(zhì)纖維素水解以及乙醇發(fā)酵的全過程,該工藝也衍生出了協(xié)同處理(CT)以及聯(lián)合生物糖化(CBS)等分支工藝[17,92-93]。Khatun等[94]先利用20 g/L NaOH溶液預(yù)處理菊芋莖,再接種產(chǎn)纖維素酶釀酒酵母MNII-AZEP,于37 ℃下發(fā)酵60 h后乙醇最高產(chǎn)量及產(chǎn)率可達(dá)28.2 g/L與0.392 g/(L·h),乙醇得率0.141 g/g。Xiao等[95]利用硝酸-乙醇混合溶液,于76 ℃對玉米秸稈預(yù)處理3 h后,在28 ℃下培養(yǎng)釀酒酵母INVSc1-CBH-TS,發(fā)酵終點獲得最高乙醇產(chǎn)量、產(chǎn)率及得率分別為1.9 g/L、0.015 g/(L·h)及0.076 g/g(以每克秸稈計算)。不同纖維素乙醇發(fā)酵生產(chǎn)工藝及性能比較如表1所示。
表1 不同纖維素乙醇發(fā)酵生產(chǎn)工藝及性能比較
總體來說,SHF工藝的優(yōu)點是可以分別在酶解和發(fā)酵的最適溫度進(jìn)行,能夠獲得理想的酶解效率以及乙醇發(fā)酵效率,可降低高原料負(fù)荷的黏度,獲得較高的乙醇產(chǎn)量。SHF工藝的主要缺點是水解產(chǎn)物葡萄糖和纖維二糖會反饋抑制纖維素酶對底物的水解過程,影響后續(xù)酶解效率與原料利用率,因而需要補(bǔ)充使用纖維素酶制劑。此外,SHF工藝步驟連續(xù)性差,操作相對繁瑣,也影響乙醇發(fā)酵產(chǎn)率。SSF工藝是基于SHF工藝進(jìn)行優(yōu)化,其優(yōu)點是可降低水解產(chǎn)物對纖維素酶的反饋抑制作用,減少纖維素酶用量,縮短生產(chǎn)周期,減少生物反應(yīng)器使用數(shù)量及投入成本。SSF工藝的主要缺點是酶解和發(fā)酵的溫度不協(xié)調(diào),無法同時滿足二者反應(yīng)的最佳溫度條件,影響酶解效率及原料利用,還需要補(bǔ)充使用纖維素酶制劑,進(jìn)而影響發(fā)酵經(jīng)濟(jì)性。SSCF工藝的優(yōu)點是降低水解產(chǎn)物對纖維素酶的反饋抑制作用,有效提高底物中戊糖的利用率和乙醇發(fā)酵產(chǎn)量。SHF工藝的主要缺點與SSF工藝相似,在于酶解和發(fā)酵的溫度不協(xié)調(diào),需要補(bǔ)充使用大量纖維素酶制劑,影響工藝的經(jīng)濟(jì)性。相比之下,CBP工藝流程簡單、操作方便,將底物通過一步法轉(zhuǎn)化乙醇,是實現(xiàn)廉價纖維素酶的生產(chǎn)、利用以及降低纖維素乙醇生產(chǎn)成本的有效途徑。然而,目前CBP工藝研究面臨的主要問題在于通過基因工程、代謝工程策略,選育適宜的微生物或微生物菌群,一方面可引入乙醇合成途徑改造纖維素酶生產(chǎn)菌株,使其降解纖維素后直接發(fā)酵碳源合成乙醇;另一方面可引入纖維素酶合成通路改造乙醇生產(chǎn)菌株,賦予其分泌纖維素酶降解纖維素的能力。
由于生產(chǎn)菌株自身及外部環(huán)境影響,導(dǎo)致纖維素乙醇產(chǎn)量不穩(wěn)定。首先,在木質(zhì)纖維素原料預(yù)處理過程中,伴隨產(chǎn)生毒性副產(chǎn)物,如糠醛、5-羥甲基糠醛(5-HMF)、呋喃類化合物、酚類化合物等[96-99]。其次,由于木質(zhì)纖維素水解糖主要為葡萄糖和木糖,而大多數(shù)釀酒酵母等野生菌株無法利用或高效利用木糖[100-101]。最后,生物乙醇合成途徑往往伴隨甘油、乙酸等副產(chǎn)物形成。這些因素綜合影響利用木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量、產(chǎn)率及得率,導(dǎo)致纖維素乙醇發(fā)酵生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)性往往不理想。因此,作為纖維素乙醇生產(chǎn)工藝核心,通過基因工程改造策略開發(fā)優(yōu)良重組菌株,是有效克服上述問題、提高纖維素乙醇產(chǎn)能的關(guān)鍵。
原料預(yù)處理產(chǎn)生的毒性副產(chǎn)物(如糠醛和5-HMF)會抑制釀酒酵母等細(xì)胞活性,尤其對碳源轉(zhuǎn)運(yùn)、能量代謝、胞內(nèi)輔因子再生以及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能完整性造成嚴(yán)重破壞,從而影響纖維素水解糖利用與乙醇合成[102-103]。通常使用改造或馴化菌株加強(qiáng)對抑制物的抗性來提高產(chǎn)量,因此,增強(qiáng)生產(chǎn)菌株抑制物脅迫耐性是提高纖維素乙醇發(fā)酵性能的有效策略之一。Qu等[104]通過敲除嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacteriumaotearoense)SCUT27的伴侶蛋白負(fù)調(diào)節(jié)基因argR1864,增強(qiáng)了突變菌株抑制物耐性,在55 ℃、150 r/min條件下厭氧發(fā)酵小麥秸稈毒性酸解液,乙醇產(chǎn)量、產(chǎn)率及得率可達(dá)到4.99 g/L、0.18 g/(L·h)及0.37 g/g。Yan等[105]將運(yùn)動發(fā)酵單胞菌8b進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化獲得突變菌株z198,有效增強(qiáng)了其對酚醛類抑制物的耐受性,通過H2SO4-蒸汽預(yù)處理玉米秸稈,再經(jīng)50 ℃預(yù)酶解12 h,直接利用該菌株進(jìn)行SSCF,發(fā)酵乙醇產(chǎn)量可達(dá)到65.52 g/L,乙醇產(chǎn)率也達(dá)到了0.91 g/(L·h)。Van Dijk等[106]利用小麥秸稈酸解液對釀酒酵母CR01進(jìn)行馴化培養(yǎng),以提升對抑制物耐受性,所獲得的馴化菌株能夠耐受毒性料液(1.3 g/L甲酸、4.2 g/L乙酸、0.1 g/L乙酰丙酸、0.4 g/L 5-HMF和4.3 g/L糠醛),在30 ℃、150 r/min條件下乙醇的產(chǎn)量為43 g/L,乙醇產(chǎn)率為0.9 g/(L·h)。相似地,他們后續(xù)研究也構(gòu)建了一株抗性釀酒酵母,能夠耐受小麥水解液中0.8 g/L甲酸、7.7 g/L乙酸、0.3 g/L HMF和4.2 g/L糠醛,厭氧發(fā)酵得乙醇為38.3 g/L,乙醇產(chǎn)率及得率分別為0.80 g/(L·h)與0.48 g/g[107]。Cunha等[108]研究發(fā)現(xiàn),PRS3、RPB4和ZWF1基因與抑制物脅迫耐性相關(guān),在釀酒酵母CCUG53310和PE-2中分別過表達(dá)這些基因,在1.95 g/L糠醛脅迫條件下,利用112 g/L葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵,獲得的重組菌株中最高可生產(chǎn)47.8 g/L乙醇,乙醇得率達(dá)到0.43 g/g。事實上,調(diào)節(jié)胞內(nèi)NADH/NADH+水平也可以顯著調(diào)控細(xì)胞脅迫耐性、生物脫毒和乙醇產(chǎn)量。聞遠(yuǎn)[109]在運(yùn)動發(fā)酵單胞菌ZM4中過表達(dá)ZMO1885、ZMO1113、ZMO1116、ZMO1117、ZMO1211和ZMO1335等NADH合成相關(guān)基因,以提高胞內(nèi)NADH周轉(zhuǎn)再生,結(jié)果發(fā)現(xiàn),ZMO1885過表達(dá)菌株在0.53 g/L糠醛、0.36 g/L 5-HMF、0.34 g/L甲酸、4.33 g/L乙酸的脅迫環(huán)境下,于30 ℃、150 r/min發(fā)酵,乙醇產(chǎn)量為25 g/L,乙醇產(chǎn)率與得率分別為0.42 g/(L·h)與0.42 g/g。Pacheco等[110]利用纖維素水解液對SpathasporapassalidarumNRRL Y-27907進(jìn)行馴化培養(yǎng),馴化菌株能夠耐受5.82 g/L乙酸、0.2 g/L糠醛和0.02 g/L HMF毒性料液,最高乙醇產(chǎn)量、產(chǎn)率及得率分別為19.64 g/L、0.357 g/(L·h)及0.41 g/g??傮w來說,圍繞脅迫響應(yīng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及輔因子再生挖掘功能基因,針對甲酸、乙酸、糠醛及5-HMF等單一或復(fù)合抑制物,馴化工程、基因敲除和過表達(dá)或聯(lián)合調(diào)控策略依然是增強(qiáng)生產(chǎn)菌株抑制物脅迫耐性的有效手段。上述研究工作一定程度上提高了纖維素乙醇發(fā)酵性能,但在抑制物脅迫環(huán)境下,這些馴化或重組酵母菌株利用葡萄糖或水解液發(fā)酵乙醇產(chǎn)量大多維持在30~70 g/L水平,同時乙醇產(chǎn)率及得率仍有較大的提升空間。
代謝通路關(guān)鍵酶:HK—己糖激酶;GPD—葡萄糖-6-磷酸脫氫酶;PGL—6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶;PGD—6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶;RPI—5-磷酸核酮糖異構(gòu)酶;RPE—5-磷酸核酮糖異構(gòu)酶;TKL—轉(zhuǎn)酮醇酶;TAL—轉(zhuǎn)醛醇酶;XR—木糖還原酶;XI—木糖異構(gòu)酶;XDH—木糖脫氫酶;xylulokinase—木酮糖激酶圖1 基因工程重組酵母利用木糖合成乙醇的代謝通路Fig.1 Metabolic pathway of ethanol synthesis from xylose byby genetically engineered recombinant yeast
近年來,以纖維素乙醇生產(chǎn)菌株酵母為代表(圖1),在提高木糖轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)化、混合碳源共利用等方面也取得了重要的研究進(jìn)展。Sharma等[111]使用釀酒酵母LNITCC 8246與樹干畢赤酵母NCIM 3498進(jìn)行原生質(zhì)體融合,融合菌株可發(fā)酵20 g/L木糖獲得1.99 g/L乙醇,乙醇產(chǎn)率及得率分別為0.028 g/(L·h)與0.238 g/g。Kim等[112]敲除了釀酒酵母ATCC 4124中堿性磷酸酶、乙醛脫氫酶等功能基因HO、PHO13和ALD6,異源表達(dá)大腸桿菌的醇醛脫氫酶基因adhE,重組菌株利用芒草水解液進(jìn)行厭氧發(fā)酵,終點乙醇產(chǎn)量、產(chǎn)率及得率分別為27.72 g/L、0.77 g/(L·h)及0.40 g/g。Liu等[113]在單倍體釀酒酵母F106中過表達(dá)木糖還原酶XR,并篩選獲得了二倍體,重組菌株利用40 g/L木糖發(fā)酵48 h后,乙醇產(chǎn)率及得率分別為1.19 g/(L·h)、0.477 g/g。Zhu等[114]在釀酒酵母WXY70中過表達(dá)乙醇脫氫酶和甲醛脫氫酶基因SFA1并進(jìn)行馴化培養(yǎng),重組菌株可有效利用木糖發(fā)酵,乙醇產(chǎn)量、產(chǎn)率及得率分別為53.20 g/L、1.11 g/(L·h)及0.492 g/g。Sarkar等[115]在運(yùn)動發(fā)酵單胞菌AD50中異源表達(dá)大腸桿菌的H+同向轉(zhuǎn)運(yùn)功能基因xylE以及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)功能基因xylFGH,重組菌株可利用50 g/L木糖發(fā)酵,乙醇產(chǎn)量、產(chǎn)率及得率分別為47.4 g/L、2 g/(L·h)及 0.47 g/g。Roksolana等[116]考察不同己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控作用,分別在耐熱甲基營養(yǎng)酵母(Ogataeapolymorpha)BEP cat8Δ中同源表達(dá)Hxt1的基因、異源表達(dá)釀酒酵母Gal2和Hxt7基因,利用葡萄糖與木糖混合碳源培養(yǎng)基,于45 ℃高溫條件發(fā)酵48 h后,終點乙醇產(chǎn)量為27.56 g/L,乙醇產(chǎn)率及得率分別為0.574 g/(L·h)及0.347 g/g。許瓊丹等[117]在大腸桿菌中進(jìn)行碳源轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ptsG和mglB的雙敲除,突變菌株以葡萄糖與木糖混合碳源為底物發(fā)酵,乙醇產(chǎn)量為23.25 g/L,乙醇產(chǎn)率及得率分別達(dá)到0.43 g/(L·h)及0.40 g/g。Xie等[118]在釀酒酵母KF-7中強(qiáng)化表達(dá)木糖還原酶XYL1、木糖醇脫氫酶XYL2以及木酮糖激酶XKS1,并篩選獲得了一株二倍體改造菌株,利用該重組菌株發(fā)酵40 g/L木糖,24 h內(nèi)乙醇產(chǎn)量與得率可達(dá)12.95 g/L與0.35 g/g??傮w來說,上述研究工作主要是在單基因或多基因水平上,通過基因工程、代謝工程調(diào)節(jié)木糖或葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)化功能基因表達(dá),有效提高纖維素乙醇生產(chǎn)菌株木糖利用率或混合碳源同步利用能力。但是,這些研究工作主要利用木糖或混合糖為碳源的合成培養(yǎng)基,與葡萄糖底物發(fā)酵相比,木糖利用率及乙醇合成效率仍存在不足,且在抑制物脅迫環(huán)境下的纖維素水解液發(fā)酵可行性有待驗證。因此,提高重組菌株的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)化能力、混合碳源共利用能力,兼顧增強(qiáng)重組菌株的抑制物脅迫耐受性,對于持續(xù)提升纖維素乙醇發(fā)酵性能來說,顯得尤為重要。
通過調(diào)節(jié)細(xì)胞中心碳流通量,優(yōu)化代謝網(wǎng)絡(luò)節(jié)點,重構(gòu)代謝合成通路,可以有效強(qiáng)化生產(chǎn)菌株的乙醇合成能力,進(jìn)而提高乙醇發(fā)酵產(chǎn)量及產(chǎn)率。Fu等[119]敲除了嗜熱厭氧桿菌SCUT27/Δldh 內(nèi)丙酮酸甲酸裂解酶基因pflA,利用該突變菌株在55 ℃下進(jìn)行葡萄糖分批補(bǔ)料發(fā)酵,110 h內(nèi)乙醇產(chǎn)量可達(dá)38.82 g/L,乙醇產(chǎn)率及得率分別為0.35 g/(L·h)及0.38 g/g。Carreón-Rodríguez等[120]研究去折疊蛋白、分子伴侶蛋白等功能基因clpP、clpB、spoT/relA在運(yùn)動發(fā)酵單胞菌ZM4中的調(diào)控作用,重組菌株利用150 g/L葡萄糖發(fā)酵48 h后,乙醇產(chǎn)量最高可達(dá)72.36 g/L,乙醇產(chǎn)率及得率分別為1.51 g/(L·h)及0.48 g/g。Qin等[121]通過代謝工程改造釀酒酵母SyBE005,異源表達(dá)釀酒酵母超氧化物歧化酶(SOD1)、GSH合成酶(GSH1)、GSSG還原酶GLR1、葡萄糖6-磷酸脫氫酶(ZWF1)、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(GND2)、異檸檬酸脫氫酶(IDP3)和乙酰輔酶A合酶(ACS1),敲除醛糖還原酶GRE3、堿性磷酸酶(PHO13)等基因,重組菌株以玉米秸稈為原料進(jìn)行SSCF,在預(yù)水解24 h后,重組菌株發(fā)酵乙醇產(chǎn)量、產(chǎn)率及得率分別達(dá)到了90.7 g/L、0.63 g/(L·h)及0.36 g/g。Claes等[122]分別在釀酒酵母中異源表達(dá)β-葡萄糖苷酶(BG1和xln)、木聚糖酶(xlnB)、纖維二糖水解酶(IIcbh2b)、纖維二糖水解酶(IxyA)、乙酰木聚糖酯酶(celB)等基因,獲得重組菌株能夠明顯改善玉米芯發(fā)酵生產(chǎn)乙醇性能。Yi等[123]在運(yùn)動發(fā)酵單胞菌ZM4中異源表達(dá)惡臭假單胞菌醛脫氫酶基因PP_2680,以干酸預(yù)處理150 g/L玉米秸稈為底物,重組菌株可發(fā)酵生產(chǎn)約23 g/L乙醇,乙醇產(chǎn)率及得率分別0.48 g/(L·h)及0.15 g/g。Lee等[124]分別在釀酒酵母中異源表達(dá)纖維二糖水解酶(CtCBH1和ClCBH2)、內(nèi)切葡聚糖酶(TrEGL2)以及β-葡萄糖苷酶(SfBGL1)等基因,利用構(gòu)建的酵母混菌發(fā)酵水稻秸稈水解液,乙醇產(chǎn)量、產(chǎn)率及得率分別為14 g/L、0.39 g/(L·h)及0.40 g/g。Qu等[125]敲除嗜熱厭氧桿菌內(nèi)伴侶蛋白負(fù)調(diào)節(jié)基因argR1864,突變菌株可在55 ℃高溫條件下發(fā)酵,終點乙醇產(chǎn)量為2.99 g/L,乙醇產(chǎn)率及得率分別為0.1 g/(L·h)與0.3 g/g。
總體來說,上述研究工作主要針對乙醇代謝合成通路中的關(guān)鍵基因進(jìn)行敲除或過表達(dá),針對分子伴侶及降解酶系等功能蛋白元件進(jìn)行異源表達(dá),以優(yōu)化重構(gòu)中心代謝通路,提高乙醇產(chǎn)量、產(chǎn)率及得率(表2)。事實上,以上研究工作大多圍繞生產(chǎn)菌株脅迫耐性、碳源利用及乙醇合成3個方面分別開展,協(xié)同強(qiáng)化研究仍較少,因而兼顧提高生產(chǎn)菌株對復(fù)雜、復(fù)合抑制物的脅迫耐性、高溫脅迫耐性以及混合碳源高效轉(zhuǎn)化乙醇的能力,開發(fā)高強(qiáng)度、高濃度纖維素乙醇發(fā)酵工藝是未來研究工作的重點。
表2 乙醇發(fā)酵重組菌株的選育及性能比較
為保障可持續(xù)發(fā)展、能源安全以及環(huán)境友好的低碳經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)型要求,國務(wù)院發(fā)布《關(guān)于加快建立健全綠色低碳循環(huán)發(fā)展經(jīng)濟(jì)體系的指導(dǎo)意見》,提出加快推動能源體系綠色低碳轉(zhuǎn)型,提升纖維素乙醇等可再生能源利用比例,建立健全綠色低碳循環(huán)發(fā)展的經(jīng)濟(jì)體系,確保實現(xiàn)“2030碳達(dá)峰、2060碳中和”目標(biāo)。隨后,國家能源局關(guān)于印發(fā)了《2021年能源工作指導(dǎo)意見》,提出要持續(xù)優(yōu)化能源結(jié)構(gòu),推進(jìn)發(fā)展纖維素燃料乙醇等可再生生物質(zhì)能的開發(fā)利用,推進(jìn)纖維素等非糧生物燃料乙醇的產(chǎn)業(yè)示范,推動能源低碳轉(zhuǎn)型和高質(zhì)量發(fā)展。事實上,據(jù)國際能源署(IEA)預(yù)測,2050年纖維素燃料乙醇年消耗量將增長到11億t,替代27%的交通運(yùn)輸燃料,其與化石汽油相比,碳減排可達(dá)76%~124%,每噸纖維乙醇減排 CO22.67 t,因而纖維素燃料乙醇能量收益和碳減排效果顯著,未來發(fā)展前景極為廣闊。由此可見,未來纖維素乙醇生物煉制的研究重點在于開發(fā)成套集成技術(shù),包括:低耗、高效、清潔的原料預(yù)處理技術(shù),可以減少中和、脫毒化學(xué)品及水源的用量,降低固廢、液廢產(chǎn)生;低成本、高效率的纖維素酶生產(chǎn)與水解技術(shù),可以提高纖維素糖得率,節(jié)約原料成本;相匹配的高效生產(chǎn)菌株及工程改造技術(shù),可以提高重組菌株抑制物及高溫脅迫耐性、戊糖和己糖(同步)轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)化能力以及產(chǎn)物乙醇代謝合成能力。通過上述技術(shù)的優(yōu)化集成,可以從根本上降低纖維素乙醇的資本投入和運(yùn)營成本,助推以纖維素燃料乙醇為代表的能源低碳轉(zhuǎn)型和高質(zhì)量發(fā)展,為全面建設(shè)社會主義現(xiàn)代化國家提供穩(wěn)定可靠的能源保障。