潘玉寧，林 慧，薛 瑾，孫彥敏，陶 飛，顏春榮，徐春祥

(江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，江蘇 南京 210008)

孔雀石綠(malachite green,MG)是有毒的、人工合成的三苯甲烷類化合物，既是染料也是殺滅真菌、細菌、寄生蟲等的藥物[1]，因其價格低、抗菌廣、藥效穩(wěn)等特點曾被廣泛應用于水產品養(yǎng)殖和運輸過程中[2-7]?？兹甘G在動物體內被吸收后可迅速代謝成隱色孔雀石綠(leucomalachite green,LMG)，且在動物體內代謝消除速率低，并長期富集殘留于組織中[8]，人類長期食用可產生致癌、致畸、致突變等副作用[9-10]，目前已被國家明令禁止添加[11]，但仍有少部分不法商販在違規(guī)使用[12]。

目前MG、LMG的實驗室檢測方法主要有液相色譜法或者液相色譜-串聯(lián)質譜法等[13-17]，雖然可用精確定量檢測，但前處理時間較長、過程較為繁瑣、檢測成本較高，所以無法滿足水產品流通市場的監(jiān)管需求。國家食品藥品監(jiān)督管理總局(以下簡稱國家食藥總局)發(fā)布了快檢方法《水產品中孔雀石綠的快速檢測膠體金免疫層析法(KJ201701)》[18]，該方法比儀器方法更簡單，成本也低。但相關的快檢試劑盒產品的監(jiān)管和應用仍處于初級階段，在實際使用過程中仍存在很多問題。

國家食藥總局發(fā)布了《關于規(guī)范食品快速檢測方法使用管理的意見》(食藥監(jiān)科〔2017〕49號)[19]及《食品快速檢測方法評價技術規(guī)范》(食藥監(jiān)辦科[2017]43號)[20]，強調應嚴格控制快檢產品質量，對快檢產品的評價指標(靈敏度、特異性、假陰性率和假陽性率、與參比方法一致性分析)、評價方法、評價步驟、評價結果及報告出具等方面提出了具體要求?；诖?，筆者所在單位正式調研各地市使用孔雀石綠快檢產品的使用情況，結合我省實際情況，主要針對國家已發(fā)布的《水產品中孔雀石綠的快速檢測膠體金免疫層析法(KJ201701)》[18]中的相關產品，通過使用單位、經銷單位以及邀請部分地區(qū)擬采購相關快檢廠家提供產品的方式，獲得了5個廠家的快檢產品，對產品的靈敏度、特異性、假陰性率和假陽性率、與參比方法一致性分析等方面作出評價，以期為食品快速檢測產品的評價工作提供技術參考，為全面支撐食品監(jiān)管和服務快檢高質量發(fā)展打下堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LCMS-8050型三重四級桿液質譜聯(lián)用儀，日本島津公司；XS-205DU型電子分析天平，美國梅特勒-托利多公司；MILLI Q型超純水儀，美國Millipore公司；Beckman Avanti JXN-6型離心機，美國Beckman公司；IKA VORTEX4型渦旋混合器，德國IKA公司。

孔雀石綠、隱色孔雀石綠標準品(純度≥99.0%)，德國DR.E公司；同位素內標氘代孔雀石綠(D5-MG)、氘代隱色孔雀石綠(D6-LMG)(純度≥99.0%)，德國WITEGA公司；乙腈、甲醇(色譜純)，美國Thermo Fisher公司；無水乙酸銨、冰乙酸、二氯甲烷(分析純),美國Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

準確稱取適量的孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氘代孔雀石綠、氘代隱色孔雀石綠標準品，用乙腈分別配制成100 μg/mL的標準儲備液，-18 ℃避光保存，臨用現(xiàn)配。

1.2.2 評價用樣品制備

1)空白(陰性)樣品的制備。市場上購置青魚，去鱗去皮后沿脊背取肉，按照文獻[21]液相色譜-串聯(lián)質譜法確定孔雀石綠和隱色孔雀石綠為未檢出后，確定為空白(陰性)樣品，-18 ℃保存。

2)評價用盲樣的制備。按照文獻[20]提出的要求，本評價設置4個水平(0、1、2和4 μg/kg)的樣品，涵蓋孔雀石綠快檢產品方法標稱檢出限(2 μg/kg)的0、0.5、1和2倍的4個水平的盲樣，每個水平樣品數(shù)量為50份。

1.2.3 孔雀石綠穩(wěn)定性實驗

有研究[22-23]表明孔雀石綠在無催化劑的條件下有光降解特性，且光照能促進孔雀石綠降解。本次評價實驗前期，配制了10 μg/L的孔雀石綠溶液于透明三角燒瓶中。在晴天時，從早上8時開始，在自然日照條件下室外直射(室外氣溫為23～28 ℃)，光照時間0、2、4、6和8 h，按照文獻[21]中液相色譜-串聯(lián)質譜法分別檢測其中孔雀石綠和隱色孔雀石綠含量。選取不含孔雀石綠和隱色孔雀石綠的魚肉為基質，制成6個樣品，在其中添加10 μg/kg 的孔雀石綠溶液，按照同樣的光照時間、同樣的檢測方法檢測其中孔雀石綠和隱色孔雀石綠含量。

1.2.4 隱色孔雀石綠添加回收實驗

本次評價采用不含孔雀石綠和隱色孔雀石綠的魚肉為基質，每3個樣品為一組，每組樣品中分別添加1、2和4 μg/kg 3個水平的隱性孔雀石綠，參照文獻[21]方法，對上述9個樣品進行檢測，計算隱色孔雀石綠在魚肉基質中的添加回收率。

1.2.5 盲樣的均勻性和穩(wěn)定性試驗

對于盲樣均勻性考察，從前述的1、2和4 μg/kg 3個水平樣品中分別隨機抽取10個樣品，每份樣品稱取2份樣，采用液相色譜-串聯(lián)質譜法進行檢測，采用單因子方差計算F值，分析驗證樣品的均勻性。根據(jù)文獻[22]中要求，若F0.05(9,10)<3.02(臨界值)，表明在0.05顯著水平時，樣品內和樣品間無顯著性差異，樣品是均勻的。對于盲樣的穩(wěn)定性考察，在各水平的樣品中選取6個樣品，每個樣品分成2份樣品：第1份樣品按照液相色譜-串聯(lián)質譜法進行檢測(n1，第1次檢驗測量的測量次數(shù)為6)，第2份樣品在-20 ℃放置5 d后用同樣的方法進行檢測(n2，第2次檢驗測量的測量次數(shù)為6)。根據(jù)GB/T 15000.5—1994要求，采用t檢驗[23]對2次測定的平均值進行分析，若t

1.2.6 快檢產品評價

本次評價采用的快檢產品來自A、B、C、D和E這5個廠家。參照文獻[20]，將0、 1、2和4 μg/kg 4個水平的樣品各50批按照1～200隨機數(shù)排布編碼。不同組給予A～Z組號，每組隨機號隨機產生，形成不同組的盲樣。樣品測試前，不同廠家采用抽簽形式抽取相應組別。保證雙盲實驗。按照文獻[20]的要求進行各個廠家產品的評價實驗，從產品的性能指標(靈敏度、特異性、假陰性率和假陽性率)、與參比方法一致性分析對產品做出評價，按照規(guī)定中的快檢產品性能指標計算表得出各個廠家產品的性能指標，考察各產品的樣品前處理操作難易程度、檢測時間與檢測成本、輔助儀器設備、結果判定、適用性等。

1.3 液相色譜-串聯(lián)質譜法儀器條件

色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18 (2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；流動相為流動相A 10 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水和流動相B乙腈，梯度洗脫程序見表1；流速為0.3 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL；離子源為電噴霧電離(ESI)；掃描模式為正離子；掃描方式為多反應監(jiān)測(MRM)；噴霧電壓為3 500 V；質量分析器為三重串聯(lián)四級桿質譜(QQQ)；輔助氣流速為 3 L/min；加熱氣流速為10 L/min；干燥氣流速為10 L/min；接口溫度為300 ℃；脫溶劑管溫度為250 ℃；加熱模塊溫度為400 ℃。監(jiān)測離子對信息見表2。

表1 梯度洗脫程序

表2 監(jiān)測離子對信息

2 結果與討論

2.1 產品外觀及檢測步驟對比分析

各個廠家快檢產品的包裝、說明書、標簽標識、配套試劑等查驗，結果如表3所示。由表3可知：所有產品外包裝完整，所有產品標簽和說明書完好。各廠家稱樣量略有差異，3～5 g不等。廠家D和E快檢產品標稱檢測時間均為40 min，廠家A、B、C均為60 min。5個廠家產品的操作步驟均分為提取、氧化、濃縮、復溶及滴卡判定5個步驟。在判讀時，D采用的是試紙條顯色，其余A、B、C、E均為檢測卡。判讀方式上，A、C采用機器判讀方式，其余3個廠家采用人眼判讀方式。5個廠家的標稱檢出限均為2 μg/kg。這5個廠家產品標稱的操作時間、操作簡便性、檢出限滿足市場監(jiān)管及實際使用時對快速檢測產品的實驗操作要求。

表3 試劑盒產品外觀及標示情況

2.2 孔雀石綠穩(wěn)定性

孔雀石綠的穩(wěn)定性實驗結果如圖1所示。由圖1可知：隨著光照時間的處長，孔雀石綠溶液中孔雀石綠的含量逐漸降低，隱色孔雀石綠的含量逐漸增加；在光照4 h時，孔雀石綠含量為4.35 μg/kg，含量下降56.6%，且實驗發(fā)現(xiàn)部分孔雀石綠轉化為隱色孔雀石綠。在光照條件下，魚肉基質中的孔雀石綠也出現(xiàn)了類似的降解趨勢，最終光照8 h后樣品中的孔雀石綠含量僅為2.1 μg/kg。張彤晴等[24]的研究結果同樣表明太陽光有降解孔雀石綠的作用，且孔雀石綠有部分轉變?yōu)殡[色孔雀石綠。為確保評價實驗的有效性，本次評價實驗僅使用添加隱色孔雀石綠的樣品為盲樣。

圖1 不同光照時間的孔雀石綠溶液中孔雀石綠和隱色孔雀石綠含量變化Fig.1 Changes of malachite green and leucomalachite green content in malachite green solution with different sunshine time

2.3 加標回收率

本次評價參照文獻[21]方法，驗證隱色孔雀石綠在魚肉基質中的添加回收率，儀器條件參照1.3節(jié)。各水平的添加回收率結果見表4。由表4可知，結果符合評價要求。

表4 魚肉基質隱色孔雀石綠添加回收實驗結果

2.4 盲樣的均勻性實驗結果

根據(jù)文獻[22]要求測定盲樣中隱色孔雀石綠的含量后，添加1、2和4 μg/kg水平的盲樣中隱色孔雀石綠的F0.05(9,10)分別為1.982、0.973和0.738，均小于3.02，表明在0.05顯著水平時樣品內和樣品間無顯著性差異，樣品是均勻的。

2.5 盲樣的穩(wěn)定性實驗結果

通過查得文獻[23]附錄，t0.05(10)=2.23，孔雀石綠在添加水平為1、2和4 μg/kg計算的t值分別為3.941、4.032和3.017，均大于t0.05(10)(2.23)，顯示孔雀石綠在樣品中不穩(wěn)定，無法滿足本次評價實驗要求。而隱色孔雀石綠在添加水平為1、2和4 μg/kg計算的t值分別為1.121、0.837和0.671，均小于t0.05(10)(2.23)，表明制備的隱色孔雀石綠盲樣在-20 ℃放置5 d后，盲樣是穩(wěn)定的，因此在盲樣制備后5 d內完成評價實驗。

2.6 評價結果

2.6.1 試劑盒實際檢測完成時間及操作情況

在實際操作過程中，10批次檢測情況如表5所示。由表5可知：C廠家操作用時最短，10批次用時約27 min，A廠家次之，約31 min，B、D廠家用時約36 min，E廠家用時最長，約40 min。操作簡便程度上，C與E廠家在樣品前處理操作步驟上最為簡便，僅需三步提取一次離心，比其他4個廠家產品簡便一些，A廠家次之，D最為復雜，需4步提取、2次離心。A、B、C、E均在處理中吸取上清液進行檢測，操作較為簡便，D廠家需吸取下清液，操作難度略大。

2.6.2 靈敏度

評價結果分析統(tǒng)計計算公式參照文獻[18，20]進行。規(guī)定中要求孔雀石綠快速檢測試劑盒的性能指標的靈敏度應≥99%，結果總結在表6中。由表6可知：A、C兩個廠家的產品與文獻[18，20]規(guī)定的標準要求最接近。B、D、E這3個廠家的產品靈敏度與≥99%指標要求還有一定距離。

表5 試劑盒實際檢測完成時間及操作情況

2.6.3 特異性

對5個廠家的孔雀石綠快速檢測試劑盒的特異性進行分析，結果如表6所示。由表6可知：A、C、D這3個廠家的試劑盒的特異性大于90%，其中A、C這2個廠家的試劑盒的特異性均為100%，滿足文獻[18,20]中規(guī)定的特異性應≥85%的要求，B廠家的特異性與規(guī)定的標準要求接近，差1%。

2.6.4 假陰性率與假陽性率

根據(jù)文獻[18,20]中的規(guī)定，孔雀石綠快速檢測試劑盒的假陰性率應≤1%，假陽性率應≤15%。從本次評價的結果(表6)上可知，僅A、C、D這3個廠家的試劑盒滿足假陽性率指標的要求，C廠家的假陰性率指標與標準要求接近(差1%)，B、E廠家均不符合要求。

表6 5個廠家快檢產品性能指標

2.6.5 與參比方法一致性分析

參照文獻[18，20]中的方法，用卡方(χ2)檢驗分析試劑盒快速檢測方法與參比方法是否存在統(tǒng)計學差異，結果見表7。由表7可知：C廠家試劑盒的χ2<3.84，表明該試劑盒的檢測結果與參比方法實際狀態(tài)的陽性確證比率在95%的置信區(qū)間內沒有顯著差異；A、B、D、E廠家的χ2≥3.84，表明該試劑盒的檢測結果與參比方法實際狀態(tài)的陽性確證比率在95%的置信區(qū)間內有顯著性差異；C廠家試劑盒的檢測結果的相對準確度最高，接近100%，其次為A，這兩個產品的方法與現(xiàn)有方法的一致性要求最接近。

表7 5個廠家試劑盒測試結果

3 結論與建議

本次研究不僅從產品的性能指標(靈敏度、特異性、假陰性率和假陽性率)對產品做出評價，同時也考察了各產品的樣品前處理操作難易程度、檢測時間與檢測成本、輔助儀器設備、結果判定、適用性等。通過本次評價可以看到，在用的孔雀石綠快檢產品的特異性總體較好，但質量參差不齊，有3個廠家假陽性率≤15%。建議必須建立出廠評價驗收制度，在市售水產品中孔雀石綠的快速檢測產品采購前，對產品做出綜合有效評價，確保產品質量。

對快速檢測產品做出公平公正的評價應綜合性評判，不僅要參考國家評價標準，還需要綜合評價其他因素。根據(jù)實際檢驗結果，在用的這5個廠家的產品在所有4項指標上沒有一家達到國家標準的要求，但不代表所有廠家的產品質量都不合要求。在所有200個樣品中，C廠家產品僅1個樣品檢測錯誤。A、C、D廠家產品，其特異性與假陽性率達到國家食品藥品監(jiān)督管理總局規(guī)定的指標，靈敏度與假陰性率距離快檢標準指標差距較小。

濃度水平設置也是影響評價結果水平的關鍵要素。本次孔雀石綠快速檢測方法為膠體金免疫層析法，該方法靈敏度高、特異性強，但該方法以定性檢測為主，不能準確定量，檢測結果容易對一定范圍的濃度變化不敏感，濃度接近檢出限水平的樣品極有可能檢測出假陰性。因此，設置不同水平樣品(尤其是介于空白和檢出限水平以及檢出限附近水平的樣品)評價同—快檢產品會造成性能指標的差異，特別是不同機構出具的評價結果報告也會彼此矛盾，易造成市場混亂。

評價實驗工作環(huán)境不能達到暗室環(huán)境的要求，且快速檢測試劑盒實際使用過程中不能達到無光環(huán)境的要求，考慮到實際應用情況，本次評價實驗僅使用添加隱色孔雀石綠的樣品為盲樣，以消除孔雀石綠在自然環(huán)境下的降解干擾，避免因孔雀石綠降解而造成的濃度水平差異而導致評價結果的偏差。

本次孔雀石綠的快速檢測法前處理過程需經過提取、氮吹濃縮等步驟，這些操作相對其他快速檢測法仍相對繁瑣，如若在實驗室進行，則需要很多大型儀器，占地空間較大。鑒于此，有些廠家提供了可以同時進行提取、濃縮、離心等步驟的可移動式全自動提取儀，但該儀器操作通量小，一次只能完成幾個樣品的檢測，在實際現(xiàn)場應用時還有很多限制，有些廠家在完成這些前處理步驟時仍需借助實驗室儀器，給實際推廣應用帶來困難。

快檢產品的結果判斷與檢驗人員的經驗相關度較大，特別是對弱陽性和弱陰性樣品的判斷。本次評價時，其中一家公司對一組弱陽性的樣品全部判定為陰性，使評價結果總體相差較大。建議國家出臺快檢人員的定期考核制度，以保證快檢結果的準確性。判讀方式需進一步標準統(tǒng)一化。該方法最后的判讀時通過比較T線(檢測線)與C線(控制線)的顏色深淺來判定陽性/陰性結果。在評價實驗工作中，有些廠家的檢測試劑盒的顏色深淺比較僅憑肉眼識別極易造成人為判斷誤差，對結果判定造成影響，因此亟須建立統(tǒng)一的數(shù)字化判讀標準。