吳 磊,陸 超

(1. 南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 藥學部，江蘇 南京 210029； 2. 南京中醫(yī)藥大學 藥學院，江蘇 南京 210046)

金蓮花為毛茛科植物金蓮花(TrolliichinensisFlos)的干燥花，具有清熱降火、滋陰解毒等功效[1-4]。始載于晚清吳其所著《植物實名圖考》，后作為藥用被清代趙學敏所著《本草綱目拾遺》收錄，據(jù)稱：金蓮花出自五臺山，又名旱地蓮，一名金芙蓉，色深黃，味苦，無毒，性寒，可治口瘡喉腫，浮熱牙宣，耳痛目痛[5]。金蓮花曾在2003年被選為預防嚴重急性呼吸道綜合征(SARS)疾病中的復合處方藥物之一，近年來，以金蓮花為君藥的中藥制劑越來越多，如：《上海市中藥材標準》1994年版、《黑龍江省中藥材標準》2001年版和《山西省中藥材標準》2014年版等地方中藥材標準都收載了金蓮花，但均缺少對其藥效成分進行定性和定量檢測方法的介紹。2015年版《中國藥典》目前也尚未收載，嚴重影響了金蓮花臨床使用的安全性和有效性。因此，對金蓮花質(zhì)量標準的完善將非常必要。

金蓮花的主要成分為黃酮類物質(zhì)，是其抗菌、抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛、解熱和抗氧化的重要活性成分[6]。其中黃酮類糖苷，包括牡荊素和葒草苷，占到金蓮花總黃酮類成分的2/3，具有很強的抗菌與抗病毒活性[7-8]。本研究選擇了牡荊素和葒草苷作為對照，建立了金蓮花的薄層鑒別(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)為檢測方法，同時對多個產(chǎn)地的金蓮花進行分析，為其質(zhì)量標準的研究提供依據(jù)，后期將對其藥理作用進行進一步的深入研究，以期使其在抗擊新冠肺炎的戰(zhàn)役中發(fā)揮一定的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters-2695型高效液相色譜儀、Waters-2998型二極管陣列檢測器，美國Waters公司; BP-211D型萬分之一天平，德國賽多利斯公司；KQ-1000E型醫(yī)用超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；CAMAG(TLC XISUALIZER2)型薄層色譜成像系統(tǒng)，WD-9413A型凝膠成像分析儀，北京市六一儀器廠。

1.2 試劑與藥材

葒草苷對照品(批號：111777-201302)和金蓮花對照藥材(批號：121089-201204)，中國食品藥品檢定研究院; 牡荊素對照品(批號：160324，含量≥98%),南京寧歧醫(yī)藥科技有限公司; 甲醇和乙腈均為色譜純，乙酸乙酯和磷酸均為分析純，水為超純水；聚酰胺薄膜(批號：20160906)，上海國藥集團化學試劑有限公司；8個不同來源的金蓮花樣品由江蘇省藥學會提供，詳見表1，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥學部鑒定為正品，按所規(guī)定的炮制方法和要求，進行了凈制加工，去除了雜質(zhì)，得到符合要求的金蓮花飲片。

表1 金蓮花樣品信息

1.3 實驗方法

1.3.1 顯微鑒別方法

對金蓮花粉末的顯微特征進行觀察，增訂粉末顯微鑒別。分別取1～8號樣品制片，觀察其顯微特征。

1.3.2 薄層鑒別方法

取各批金蓮花樣品粉末0.25 g，加體積分數(shù)70%乙醇溶液25 mL，超聲30 min，過濾后蒸干，殘渣加水20 mL，正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并提取液，蒸干，加入1 mL甲醇溶解，制備供試品溶液。精密稱定牡荊素和葒草苷對照品，加甲醇制成對照品溶液; 對照藥材溶液同對照品溶液方法進行制備。

吸取上述對照藥材、供試品和對照品溶液各5 μL，于聚酰胺薄膜板上點樣，展開劑使用二氯甲烷-甲醇-丙酮-冰乙酸(體積比為4∶ 2∶ 3∶ 3)，體積分數(shù)1%AlCl3乙醇試液進行顯色，烘箱內(nèi)加熱(105 ℃)至斑點清晰，于365 nm紫外光燈下檢視。

1.3.3 含量測定方法

1.3.3.1 對照品溶液的制備

精密稱取葒草苷和牡荊素對照品 11.59和10.49 mg，置于25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得對照品儲備液; 分別精密吸取上述儲備液各 1 mL，搖勻，即得混合對照品溶液。

1.3.3.2 供試品溶液的制備

精密稱定供試品0.3 g，加入體積分數(shù)80%乙醇溶液50 mL至錐形瓶中，稱質(zhì)量，水浴鍋上回流2 h，靜置至室溫，補質(zhì)量，濾過沉淀，精密量取續(xù)濾液 25 mL，水浴鍋上蒸干，殘渣加水 25 mL溶解，30 mL乙酸乙酯萃取2次,合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至10 mL 量瓶中，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得供試樣品。

1.3.3.3 色譜條件

色譜柱：HederaC18 ODS-2型(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相：乙腈(A)和體積分數(shù)0.4%磷酸(B)溶液，體積比為17∶ 83，流速為1.0 mL/min，檢測波長為340 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL，理論塔板數(shù)按葒草苷峰計算，應(yīng)不低于 6 000。

圖1 金蓮花粉末顯微特征Fig.1 Microscopic characteristics of the powder of Trollii chinensis Flos

1.3.3.4 含量測定

精密稱取不同產(chǎn)地的金蓮花藥材粉末約 0.3 g，按照供試品溶液制備方法，計算各樣品中葒草苷及牡荊素的含量。

1.3.3.5 精密度試驗

取混合對照品溶液連續(xù)進樣6次，計算峰面積積分值，根據(jù)葒草苷、牡荊素的相對標準偏差(RSD)值計算精密度。

1.3.3.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液靜置至室溫，于 0、1、2、4、6、8、10、24和48 h分別進樣 10 μL，測定葒草苷、牡荊素的峰面積，計算葒草苷、牡荊素峰面積的 RSD 值。

1.3.3.7 重復性試驗

取1號金蓮花樣品 0.3 g，精密稱定平行樣品6 份，制備供試品溶液，計算葒草苷、牡荊素含量平均值與RSD值。

1.3.3.8 回收率試驗

取已知含量的1號金蓮花樣品粉末0.15 g，精密稱定6份,置于具塞錐形瓶中，加入葒草苷、牡荊素混合對照品溶液適量，制備供試品溶液，進樣10 μL，測定，計算葒草苷及牡荊素的平均回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 顯微鑒別結(jié)果

參考文獻[9-10]，分別取1～8號樣品制片，對金蓮花粉末顯微特征進行觀察，結(jié)果見圖1。由圖1可知：本品花粉粒呈類球形，無色至淡黃色，直徑20～30 μm,外壁光滑，有的可見3孔溝?；ǚ勰覂?nèi)壁細胞碎塊淡黃色，完整細胞呈類長方形，長40～70 μm，寬約10 μm，細胞壁呈連珠狀增厚。 花瓣表皮細胞淡黃色，呈乳突狀或非腺毛狀隆起，直徑15～25 μm，有的胞腔內(nèi)含有紅棕色或黃棕色顆粒狀物?；ü诒砥饪诪椴欢ㄊ剑瑱E圓形，直徑25～35 μm，副衛(wèi)細胞4～5個，垂周壁彎曲，螺紋導管多成束存在，直徑5～9 μm。

2.2 薄層色譜鑒別結(jié)果

對正丁醇、二氯甲烷-甲醇-丙酮-冰乙酸(體積比為4∶ 2∶ 3∶ 3)2種不同展開條件進行考察，結(jié)果表明：二氯甲烷-甲醇-丙酮-冰乙酸展開效果好，斑點清晰，分離度好，比移值(Rf)適宜。對正丁醇和二氯甲烷-甲醇-丙酮-冰乙酸2種不同提取溶劑進行考察，結(jié)果表明：正丁醇萃取的供試品溶液，主斑點更清晰，所以選取正丁醇萃取的供試品為提取樣品。

通過對8批金蓮花藥材進行薄層檢查可知，來源不同的金蓮花樣品薄層色譜無明顯差異，供試品色譜在與牡荊素、葒草苷對照品相應(yīng)位置上均顯出相同顏色的綠色熒光斑點(圖2)。

注：1為葒草苷對照品；2為牡荊素對照品； 3為金蓮花對照藥材；4～11為金蓮花1～8號樣品圖2 金蓮花薄層色譜Fig.2 TLC of Trollii chinensis Flos

2.3 含量測定結(jié)果

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果

參考文獻[11-13]，按1.3.3.3項下的液相色譜條件，得到金蓮花的HPLC色譜圖(圖3)，由圖3可知：金蓮花樣品分離效果好，葒草苷、牡荊素與其他成分均達到基線分離。

圖3 金蓮花HPLC色譜Fig.3 HPLC chromatograms of Trollii chinensis Flos

2.3.2 線性關(guān)系考察結(jié)果

精密稱取葒草苷、牡荊素對照品11.59、10.49 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解，靜置至室溫，甲醇定容。吸取葒草苷和牡荊素溶液各1 mL制備混合對照品母液。 再用甲醇稀釋至1 mL分別含葒草苷0.231 8、0.115 9、0.058 0、0.029 0、0.014 5、0.007 2 mg，牡荊素0.209 8、0.104 9、0.052 5、0.026 2、0.013 1、0.006 6 mg的混合對照品溶液。

取上述溶液各10 μL 進樣進行線性回歸，得到葒草苷、牡荊素的回歸方程(n=6)分別為葒草苷Y=25 491X-126.87(r=0.999 8)，牡荊素Y=17 729X-90.507(r=0.999 7)。結(jié)果表明：葒草苷質(zhì)量濃度在0.0 072～0.2 318 mg/mL范圍內(nèi)，牡荊素質(zhì)量濃度在0.0 066～0.2 098 mg/mL范圍內(nèi)，與峰面積積分值具有良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗結(jié)果

葒草苷、牡荊素的RSD值分別為0.50%和0.92%，表明精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

葒草苷、牡荊素峰面積的 RSD值分別為1. 83%和2.21%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復性試驗結(jié)果

葒草苷、牡荊素含量平均值分別為0.491%和0.192%，RSD值分別為1.33%和1.53%，表明重復性良好。

2.3.6 回收率試驗結(jié)果

葒草苷及牡荊素的回收率試驗結(jié)果見表2。由表2可知：葒草苷及牡荊素平均回收率分別為95.00%與90.27% ，RSD值分別為2.19%與2.88%，該方法的準確性良好，符合含量測定的要求。

表2 加樣回收率試驗考察結(jié)果(n=6)

2.3.7 葒草苷及牡荊素含量測定結(jié)果

葒草苷及牡荊素含量測定結(jié)果見表3。由表3可知：8批次的金蓮花樣品中，葒草苷含量的均值為0.686%，牡荊素含量的均值為0.231%，且8批樣品中葒草苷含量差異較大，最高可達0.933%，最低為0.463%；牡荊素含量最高可達0.283%,最低為0.192%。采收時間也許是影響葒草苷含量差異大的主要原因。

表3 葒草苷及牡荊素含量測定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

1)在標準的設(shè)置方面，《上海市中藥材標準》1994年版、《黑龍江省中藥材標準》2001年版和《山西省中藥材標準》2014年版等地方中藥材標準收載了金蓮花，但均缺少對其藥效成分進行定性和定量檢測的介紹，本次金蓮花的質(zhì)量標準研究的內(nèi)容已被收載至2020版《江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范》，彌補了無薄層鑒別和含量測定的不足，提高了其臨床使用的安全性和有效性。

2)葒草苷是中藥金蓮花中重要的活性成分，具有保護心血管、抗衰老、抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗菌等藥理活性，目前的研究發(fā)現(xiàn)：不同批次的金蓮花中葒草苷含量差異較大，來自相同產(chǎn)地金蓮花的葒草苷含量亦有高低，說明產(chǎn)地并不是主要的影響因素，采收時間也許是影響葒草苷含量的最主要原因，因此，有待進一步增加樣本量，對不同時間采收的金蓮花進行研究，從而更好地控制飲片質(zhì)量。