馬 錚，姜雨佳，于 洋，李 春

(北京理工大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 生物化工研究所 醫(yī)藥分子科學(xué)與制劑工程工信部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

圖1 D/L-1,2,4-丁三醇[7]及間苯三酚的生物合成[9]Fig.1 Biosynthesis of D/L-1,2,4-butanetriol[7] and phloroglucinol[9]

含能化合物的合成反應(yīng)包括骨架的合成和修飾兩個(gè)部分，其中核心反應(yīng)為氮雜環(huán)和含能基團(tuán)的合成。傳統(tǒng)化學(xué)方法合成含能化合物普遍使用酸、堿、貴金屬及重金屬催化劑[3]，導(dǎo)致環(huán)境污染嚴(yán)重，更重要的是反應(yīng)過程比較劇烈、不易控制、安全性差，特別是化學(xué)催化合成的選擇性差，會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)品。由于環(huán)境問題日益受到重視，近年來(lái)綠色化學(xué)合成引起了廣泛關(guān)注，研究者發(fā)展了五氧化二氮(N2O5)硝化[4-5]等綠色、高效的含能化合物化學(xué)合成工藝，比傳統(tǒng)合成方法更加環(huán)保。

除合成化學(xué)之外，合成生物學(xué)和酶工程的發(fā)展為化學(xué)品的綠色制造提供了新思路。生物合成反應(yīng)是指通過代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在微生物中運(yùn)行的反應(yīng)，或者是在體外由單個(gè)或多個(gè)酶催化的反應(yīng)[6]。生物催化劑在水相、溫和條件下反應(yīng)，多在常溫常壓下進(jìn)行，通常需要更少的單元操作，易于控制，而且可通過各種形式的重復(fù)發(fā)酵過程循環(huán)酶和微生物細(xì)胞，催化反應(yīng)具有高度的區(qū)域選擇性和立體選擇性，副產(chǎn)物少、環(huán)境污染低，符合化學(xué)工藝綠色、安全的發(fā)展趨勢(shì)。目前，在微生物細(xì)胞的代謝工程中，系統(tǒng)地設(shè)計(jì)和構(gòu)建生物合成途徑已經(jīng)成為一項(xiàng)常規(guī)工作，以初步構(gòu)建微生物菌株生產(chǎn)所需的產(chǎn)品。

1 代謝工程改造合成含能化合物前體

利用已知酶合理構(gòu)建生物途徑，能夠合成含能化合物的前驅(qū)體。1,2,4-丁三醇是1,2,4-丁三醇三硝酸鹽的前驅(qū)體。Niu等[7]通過兩種起始物質(zhì)D-木糖和L-阿拉伯糖，開發(fā)了一種微生物選擇性合成D和L型1,2,4-丁三醇的方法(圖1(a))。Feng等[8]為開發(fā)一種分離1,2,4-丁三醇的新方法，構(gòu)建了水溶性差的1,2,4-丁三醇酯的生物合成途徑，產(chǎn)物1,2,4-丁三醇可通過離心耦聯(lián)水解反應(yīng)回收，與傳統(tǒng)的蒸餾、蒸發(fā)等方法相比，該工藝流程簡(jiǎn)單、能耗低，可降低工藝成本。

間苯三酚是一種用于合成1,3,5-三氨基-2,4,6-三硝基苯的前驅(qū)體，Achkar等[9]構(gòu)建了以E.coliJWF1(DE3) pJA3.131A從葡萄糖生產(chǎn)間苯三酚的生物合成途徑(圖1(b))。間苯三酚對(duì)細(xì)菌有毒性，會(huì)導(dǎo)致重組大腸桿菌的細(xì)胞生長(zhǎng)受到顯著抑制，即使在補(bǔ)料發(fā)酵條件下得到的產(chǎn)物產(chǎn)量也較低，無(wú)法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。Zhang等[10]在大腸桿菌中過表達(dá)GroESL以期提高間苯三酚耐受性和產(chǎn)量，利用活細(xì)胞計(jì)數(shù)和間苯三酚產(chǎn)量評(píng)價(jià)菌株耐受性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照菌株相比，GroESL過表達(dá)菌株的細(xì)胞活力增加3.19倍，產(chǎn)物間苯三酚的合成增加39.5%，達(dá)到5.3 g/L。Liu等[11]通過在E.coliBL21 (DE3)中過表達(dá)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶或三磷酸異構(gòu)酶來(lái)增加丙酮酸濃度后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照菌株相比，間苯三酚的產(chǎn)量提高了92%。

2 生物催化含能鍵的合成

雖然生物法合成含能化合物具有巨大的開發(fā)潛力，然而與合成代謝網(wǎng)絡(luò)的理論設(shè)計(jì)取得的巨大進(jìn)展相比，這種合成途徑的實(shí)際實(shí)現(xiàn)仍然滯后。因?yàn)樵擃I(lǐng)域已知酶的種類少、底物譜窄，這都受限于酶的發(fā)現(xiàn)和工程化改造的效率，所以已有的酶無(wú)法滿足構(gòu)建含能化合物合成代謝的需求[12]。目前，可以生物合成的含能化合物前驅(qū)體主要是多元醇或者酚，同時(shí)含能化合物中常出現(xiàn)的硝基、疊氮、偶氮等基團(tuán)本身在自然界少見，但是隨著天然產(chǎn)物的發(fā)掘，在自然界中發(fā)現(xiàn)了含有這些基團(tuán)的分子，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)了催化形成這些基團(tuán)反應(yīng)的酶[13]。在以下部分我們將對(duì)硝基、肼、氧化偶氮和氮雜環(huán)的合成及相關(guān)酶的改造進(jìn)行分類闡述。

2.1 硝化反應(yīng)

生物合成的前驅(qū)體在進(jìn)行硝化反應(yīng)之后才能具備含能化合物的能量特性，生物硝化過程是含能化合物生物合成的首要反應(yīng)。Winkler等[14]綜述了硝基基團(tuán)生物合成的3種機(jī)制：第一種是由一氧化氮合酶參與的催化反應(yīng)；第二種是通過親電子的硝化反應(yīng)直接引入硝基；第三種是由N-加氧酶催化硝化氨基得到，這類反應(yīng)通常由雙核鐵中心或者Rieske鐵硫簇催化[15]，已知的酶包括AurF、Cm1I、PmD、PvbF和SznF，其中對(duì)AurF的研究較為詳細(xì)。AurF是金鏈菌素(aureothin)生物合成途徑中的酶，對(duì)其底物譜的研究發(fā)現(xiàn)，AurF可以將對(duì)位是羧酸的芳香胺氧化為硝基[16]。Winkler等[17]提出，從氨基到硝基的六電子氧化分為3個(gè)兩電子氧化的過程實(shí)現(xiàn)，通過同樣的過氧-雙鐵中間體氧化底物，產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的羥胺基、亞硝基中間產(chǎn)物，并提出了AurF催化對(duì)氨基苯甲酸(PABA)為對(duì)硝基苯甲酸(PNBA)的反應(yīng)機(jī)制(圖2(a))[18]。Li等[19]提出氨基到硝基的轉(zhuǎn)化是四電子氧化過程，即羥胺基到硝基的轉(zhuǎn)化只需要1 mol的O2。AurF在依賴O2的氧化過程中需要NADH作為電子和氫供體以實(shí)現(xiàn)O2激活。與其他氧化酶類似[20]，可以通過以H2O2為底物的分流途徑(peroxo-shunt)，以H2O2為氧供體得到過氧-雙鐵中間體，直接氧化氨基，從而降低反應(yīng)成本[21]。

除了將氨基氧化為硝基外，對(duì)C—H的活化和直接硝化可以簡(jiǎn)單化合物為底物，省略轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的中間步驟。P450單加氧酶是一類可以實(shí)現(xiàn)C—H鍵活化的血紅素酶，它也被發(fā)現(xiàn)可以實(shí)現(xiàn)有機(jī)底物的硝化反應(yīng)。Barry等[22]發(fā)現(xiàn)了一種細(xì)胞色素P450酶TxtE可以在植物毒素thaxtomin A的生物合成中直接選擇性催化L -色氨酸的C4位的硝化反應(yīng)。該硝化反應(yīng)以一氧化氮(NO)和O2為共同底物，在體外反應(yīng)中以菠菜鐵氧還蛋白(Fd)和鐵氧還蛋白還原酶(Fr)作為替代電子供體(圖2(b))。Louka等[23]通過停流動(dòng)力學(xué)方法對(duì)TxtE的反應(yīng)過程進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，O2先與NO結(jié)合，生成能夠有效硝化L-色氨酸的活性鐵(Ⅲ)-過氧亞硝酸鹽，隨后產(chǎn)生的NO2自由基直接硝化底物(圖2(c))。同時(shí)，他們還對(duì)活性位點(diǎn)簇的模型進(jìn)行了密度泛函理論(DFT)計(jì)算后發(fā)現(xiàn)，該反應(yīng)過程涉及鐵(Ⅲ)-過氧亞硝酸鹽，其通過小的活化自由能同質(zhì)分裂形成鐵(IV)-氧代血紅素和游離NO2自由基，NO2自由基激活底物上的芳環(huán)，而鐵(IV)-氧代血紅素吸收本位氫以形成產(chǎn)物。

k2表示二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)圖2 AurF催化PABA的硝化反應(yīng)機(jī)制[18] (a)，TxtE催化L-色氨酸的硝化反應(yīng)[22] (b)及TxtE的反應(yīng)機(jī)制[23] (c) Fig.2 Nitration reaction mechanism of AurF[18](a),L-tryptophan nitration reactions catalyzed by TxtE[22](b),and reaction mechanism of TxtE (k2 refers to the 2nd order rate constants)[23] (c)

TxtE蛋白結(jié)構(gòu)用灰色展示，血紅素輔因子用黃色展示，L-色氨酸用綠色展示圖3 TxtE的晶體結(jié)構(gòu)(PDB:4TPN) (a)和TxtE的活性位點(diǎn)與L -色氨酸結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)(PDB:4TPO) (b)以及TxtE可以催化的L-色氨酸結(jié)構(gòu)類似的非天然底物結(jié)構(gòu)(c)[24]Fig.3 Overall fold of TxtE(PDB：4TPN)(a),structure of the TxtE active site with L-tryptophan bound(PDB:4TPO)(b),and TxtE can nitrate unnatural substrates that are structurally similar to L-tryptophan (c)[24]

基于硝化酶的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)機(jī)制的知識(shí)，研究者可以通過理性設(shè)計(jì)拓展硝化反應(yīng)的底物譜。Dodani等[24]為了研究TxtE用于設(shè)計(jì)新的硝化生物催化劑平臺(tái)的潛力，他們先獲得了TxtE無(wú)底物和結(jié)合底物形式的高分辨率結(jié)構(gòu)(圖3(a)和(b))，并通過底物結(jié)合的光譜指示劑和底物類似物庫(kù)的篩選后發(fā)現(xiàn)，野生型TxtE可以通過對(duì)吲哚環(huán)的中度修飾但口袋部位的氨基酸不能被修飾，從而達(dá)到對(duì)L-色氨酸結(jié)構(gòu)類似的非天然底物的硝化(圖3(c))。Dodani等[25]又進(jìn)一步通過分子動(dòng)力學(xué)模擬和Markov模型分析并結(jié)合突變?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了TxtE進(jìn)行硝化反應(yīng)的區(qū)域選擇性開關(guān)，即通過F/G loop的單一突變可以完全將TxtE的區(qū)域選擇性從L -色氨酸的C4位轉(zhuǎn)移到C5位，從而僅催化產(chǎn)生5-硝基-L-色氨酸。這些研究表明，研究者可以通過通用的蛋白質(zhì)工程的方法改造TxtE硝化酶，拓展其底物譜、改變位點(diǎn)選擇性，為其他含能化合物的合成提高了新的選擇。

與化學(xué)硝化反應(yīng)相比，TxtE的酶促硝化以NO、O2為底物，利用NADPH提高驅(qū)動(dòng)力，反應(yīng)條件溫和可控。目前研究中使用的NO來(lái)自偶氮二醇烯鎓鹽類NO供體(NONOate)等小分子NO供體[24]，而下一步的研究可能通過利用一氧化氮合酶、亞硝酸還原酶等以精氨酸、亞硝酸鹽為底物合成NO，通過構(gòu)建體外多酶催化體系，實(shí)現(xiàn)低成本、綠色的硝化反應(yīng)。

自然界通過長(zhǎng)期的選擇進(jìn)化，創(chuàng)造出具有高度特異性和催化能力的蛋白質(zhì)，研究者們通過借鑒來(lái)自原生生物環(huán)境中的與生物硝化相關(guān)的酶(如AurF、TxtE等)，對(duì)其進(jìn)行設(shè)計(jì)改造，使其能夠表現(xiàn)出所需的反應(yīng)活性，并通過定向進(jìn)化的方法提高這些活性。這也體現(xiàn)了定向進(jìn)化和蛋白質(zhì)工程工具在調(diào)節(jié)酶活性、選擇性和穩(wěn)定性以滿足工業(yè)過程要求方面的重要性，也為含能化合物生物合成的工業(yè)級(jí)規(guī)模可操作性提供了條件。

2.2 肼鍵的合成

肼(N2H4)是一種含能物質(zhì)，可用作航天器的液體推進(jìn)劑。由于單質(zhì)肼含能高、化學(xué)性質(zhì)活潑，一直被認(rèn)為不會(huì)出現(xiàn)在生命活動(dòng)中，隨著對(duì)氨分解微生物代謝的深入研究，在21世紀(jì)初，肼才在厭氧氨氧化菌中被發(fā)現(xiàn)并鑒定[28]。腙、酰肼及其衍生物都屬于肼的衍生物，研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了含有腙、酰肼等結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物，進(jìn)而追溯催化N—N鍵合成酶[13]。對(duì)此類天然產(chǎn)物生物合成途徑的解析，尤其是涉及N—N成鍵機(jī)制的探究，有助于推進(jìn)肼及其衍生物的高效生物合成。

2.2.1 肼衍生物的生物合成

2016年，日本東京大學(xué)的Makoto Nishiyama課題組通過探究氨基載體蛋白(Amcp)在微生物中的分布情況，在編碼Amcp的鏈霉菌Streptomycessp.SoC090715LN-17中發(fā)現(xiàn)了具有獨(dú)特腙單元的二肽天然產(chǎn)物s56-p1[29]。在2018年，該課題組的Matsuda等[30]繼續(xù)研究在s56-p1生物合成途徑中肼鍵形成的機(jī)制，并對(duì)其相關(guān)合成基因簇進(jìn)行了分析鑒定，同時(shí)通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)構(gòu)成這種機(jī)制的基因簇廣泛存在于細(xì)菌中，表明細(xì)菌具備合成肼的潛力。然后，采用基因組挖掘的方法確定了其生物合成相關(guān)的基因簇，并將含有spb37～spb50的基因片段導(dǎo)入異源宿主S.lividansTK23中，在培養(yǎng)液的酸水解物中檢測(cè)到肼的產(chǎn)生；再通過基因敲除確定了該化合物生物合成所需的基因?yàn)镹-羥化酶的spb38和由編碼Cupin和methionyl-tRNA合成酶(metRS)樣蛋白結(jié)構(gòu)域組成的spb40。在生物合成路徑中，以L-賴氨酸為初始底物，經(jīng)Spb38催化其中的末端氨基發(fā)生羥化，隨后羥化的N在Spb40的催化下與甘氨酸的氨基發(fā)生反應(yīng)生成肼基；N6—18OH-L-賴氨酸投喂實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，肼鍵中的N—N鍵是通過假定的酯中間體重排得到；同時(shí)，體外活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，Spb38的活性在體外可以得到重建，而Spb40雖可溶性表達(dá)很好，但純化后未表現(xiàn)出活性；在大腸桿菌的體內(nèi)重構(gòu)實(shí)驗(yàn)中，將spb38與spb40一起進(jìn)行表達(dá)，可以在細(xì)胞代謝產(chǎn)物中檢測(cè)到化合物1(圖4)的生成。Spb39與D-氨基酸氧化酶同源，將重組Spb39加入生產(chǎn)化合物1的大腸桿菌過濾培養(yǎng)液中，可以檢測(cè)到肼基乙酸(HAA)的生成，從而得出由Spb38、Spb39和Spb40介導(dǎo)的L -賴氨酸和甘氨酸合成HAA的生物途徑(圖4)。

與HAA的生物合成相似，Du等[31]發(fā)現(xiàn)KtzT在哌嗪酸(piperazic acid)的生物合成過程中催化了肼鍵的合成，在體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，通過重組表達(dá)KtzT和與Spb38同源的L-鳥氨酸N-羥化酶KtzI，并進(jìn)行耦合反應(yīng)后檢測(cè)到新化合物哌嗪酸的產(chǎn)生。該反應(yīng)過程首先是通過KtzI催化伯胺的羥基化，然后哌嗪酸合酶KtzT使用血紅素輔因子催化分子內(nèi)N—N鍵的形成。

圖4 肼基乙酸中N—N鍵的生物合成途徑[30]Fig.4 Biosynthetic pathway of N—N bond formation in hydrazinoacetic acid[30]

吡唑霉素(pyrazomycin)是一種具有天然吡唑環(huán)的C-核苷類抗生素，具有與s56-p1類似的肼基結(jié)構(gòu)。杜藝嶺課題組的Zhao等[32]在2019年鑒定了S.candidusNRRL3601中負(fù)責(zé)吡唑霉素生物合成的基因簇；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，StrR家族調(diào)控因子PyrR是控制吡唑霉素生物合成的轉(zhuǎn)錄激活因子。此外，該研究通過體內(nèi)重建和穩(wěn)定同位素喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明，PyrN是一個(gè)新的N—N鍵形成酶，它催化了L-谷氨酸ε-NH2和L-N6-OH-賴氨酸的α-NH2上的N形成N—N鍵。

Fosfazinomycin是另外一類具有肼基結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物。2015年，van der Donk課題組的Gao等[33]以膦酸酯甲基轉(zhuǎn)移酶DhpI的底物耐受性作為化學(xué)選擇工具，純化得到fosfazinomycin生物合成途徑中的兩個(gè)中間產(chǎn)物，并證實(shí)了其發(fā)掘的基因簇與fosfazinomycin的形成相關(guān)。2016年，Huang等[34]對(duì)fosfazinomycin生物合成路徑中相關(guān)的5種酶進(jìn)行了體外活性驗(yàn)證并提出了其合成途徑的猜想：在這項(xiàng)工作中發(fā)現(xiàn)，fosfazinomycin的N—N鍵似乎是在天冬氨酸(Asp)上生成的，而不是在含氮的生物合成中間體上形成的；此外，通過代謝標(biāo)記研究，他們發(fā)現(xiàn)了這種天然產(chǎn)物的肼基部分中至少有1個(gè)，甚至可能2個(gè)N都來(lái)自Asp。在后續(xù)的工作中，Wang等[35]繼續(xù)對(duì)該路徑進(jìn)行了解析，經(jīng)過同位素追蹤法發(fā)現(xiàn)，在N—N鍵中的1個(gè)N來(lái)自HNO2。此外，他們還發(fā)現(xiàn)在fosfazinomycin生物合成途徑中首先生成了乙酰肼生物合成子，然后通過谷氨?；d體將N—N鍵引入其生物合成途徑。因此，與其他含N—N鍵的天然產(chǎn)物直接從中間體合成N—N鍵的合成途徑不同的是，在fosfazinomycin及共相關(guān)的化合物的合成途徑中，N—N鍵的合成途徑是1個(gè)獨(dú)立的路徑。

2.2.2 肼的生物合成

Dietl等[37]從K.stuttgartiensis中分離得到肼合酶多蛋白復(fù)合物后，成功解析了肼合酶的晶體結(jié)構(gòu)，該晶體結(jié)構(gòu)表明，HZS是由異源三聚體組成的狹長(zhǎng)二聚體(α2β2γ2)蛋白，每個(gè)二聚體都含有2個(gè)c-型血紅素活性位點(diǎn)和1個(gè)氧化還原配體的相互作用點(diǎn)。通過對(duì)晶體結(jié)構(gòu)的分析后得出肼合酶催化肼合成的兩步機(jī)制：首先，NO在γ亞基的活性位點(diǎn)(血紅素γ-Ⅰ)經(jīng)歷3個(gè)三電子的還原反應(yīng)，得到羥胺(NH2OH)，然后，NH2OH通過蛋白內(nèi)的通道系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到α亞基，該通道系統(tǒng)由β亞基內(nèi)延伸的短氨基酸分支調(diào)節(jié)；最后，HZS復(fù)合物的2個(gè)血紅素活性位點(diǎn)(血紅素α-Ⅰ)促進(jìn)氨(NH3)和NH2OH的縮合生成終產(chǎn)物N2H4。值得注意的是，該方案與工業(yè)上使用Raschig法，即氨被氧化為氯胺(NH2Cl)后，再與另1分子氨通過反歧化過程合成肼是類似的。

2.3 氧化偶氮鍵的合成

氧化偶氮鍵是高含能化合物中一種非常重要的合成組件，特別是在高能密度材料(HEDM)的合成中發(fā)揮著重要的作用，它可以通過提高材料的物理密度和能量強(qiáng)度、降低材料的靈敏度以及提高材料的能量水平來(lái)提高存儲(chǔ)安全性。

圖5 氧化偶氮鍵的生物合成機(jī)制[41]Fig.5 Biosynthetic molecular mechanism of azoxy bond formation[41]

Valanimycin是一種含有氧化偶氮鍵的天然產(chǎn)物，于1986年從土壤微生物鏈霉菌S.viridifaciensMG456hF10中分離得到。Garg等[38]通過喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)確定了L-纈氨酸、L-絲氨酸、異丁胺和異丁羥胺是valanimycin生物合成過程中的中間體；在隨后的基因簇鑒定工作中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了相應(yīng)的酶：磷酸吡哆醛(PLP)依賴性的L-纈氨酸脫羧酶VlmD和黃素依賴性的異丁胺N-羥化酶VlmH，為VlmH提供NADPH的黃素還原酶VlmR，同時(shí)，valanimycin的生物合成基因簇中還特別存在1個(gè)編碼絲氨酸- tRNA合成酶的基因(vlmL)。Garg等[39]根據(jù)同源序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，VlmA與賴氨酰磷脂酰甘油合成酶具有弱序列同源性，后者是一種利用L-賴氨酰tRNA催化L-賴氨酸與磷脂酰甘油的羥基發(fā)生?；饔玫拿?。

Guo等[40]于2015年從S.chattanoogensisL10中分離得到一類含氧化偶氮鍵的天然產(chǎn)物，命名為azoxymycins(氧化偶氮霉素)。隨后，Guo等[41]繼續(xù)解析了azoxymycins中氧化偶氮鍵的生物合成機(jī)制后發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵酶AzoC是氧化偶氮鍵生物合成的關(guān)鍵元件。他們以對(duì)氨基芳香化合物為模型，重構(gòu)了氧化偶氮鍵生物合成的過程后發(fā)現(xiàn)，azoxymycins的氧化偶氮鍵生物合成過程是一種酶法和非酶法的級(jí)聯(lián)反應(yīng)：首先非血紅素二鐵氮氧合酶AzoC催化兩步雙電子氧化反應(yīng)將氨基化合物轉(zhuǎn)化為羥胺化合物，并繼續(xù)氧化為亞硝基化合物；隨后反應(yīng)體系中的輔酶氧化還原對(duì)(NAD(P)+/NAD(P)H等)誘導(dǎo)亞硝基/羥胺化合物的快速相互轉(zhuǎn)化，通過非酶促的1+1單電子轉(zhuǎn)化反應(yīng)生成氮原子自由基中間體，并快速二聚為氧化偶氮鍵(圖5)。該研究團(tuán)隊(duì)解析了氧化偶氮鍵的生物分子合成機(jī)制，該研究結(jié)果為氧化偶氮化合物的生物合成提供了可能，從而為高能量密度材料氧化偶氮化合物的規(guī)?；I(yè)生物合成提供技術(shù)基礎(chǔ)。

目前，對(duì)含肼鍵和氧化偶氮鍵化合物的生物合成研究還集中在天然產(chǎn)物合成的途徑解析、相關(guān)基因和酶的挖掘階段，缺乏對(duì)酶機(jī)制的解析和后續(xù)的改造。更多肼鍵和氧化偶氮鍵合成酶的發(fā)現(xiàn)和機(jī)制解析將為后續(xù)的理性改造和含能化合物合成提供基礎(chǔ)。

2.4 氮雜環(huán)化合物的合成

與傳統(tǒng)的含能材料相比，氮雜環(huán)化合物的環(huán)結(jié)構(gòu)中含有更多高能的N—N鍵、C—N鍵和更大的環(huán)張力，具有較高的生成熱、更高的能量以及干凈的燃燒氣體(N2)的優(yōu)勢(shì)。

2.4.1 人工金屬酶催化C—N成鍵

擴(kuò)大蛋白質(zhì)催化劑的范圍，使其超越天然酶所包含的反應(yīng)空間，是生物催化的重要目標(biāo)和挑戰(zhàn)。Arnold團(tuán)隊(duì)的Coelho等[42]和Hartwig團(tuán)隊(duì)的Key等[43]通過定向進(jìn)化、非天然金屬配位化合物引入的方法構(gòu)建了人工金屬酶，實(shí)現(xiàn)了卡賓轉(zhuǎn)移反應(yīng)[42-43]。在此基礎(chǔ)上，Singh等[44]利用細(xì)胞色素P450酶通過分子內(nèi)氮賓C—H插入反應(yīng)，成功促進(jìn)了羰酰疊氮物的活化和環(huán)化，生成惡唑烷酮這一含氮雜環(huán)化合物，這項(xiàng)研究揭示了細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的C—H鍵氨化反應(yīng)的機(jī)制：在催化循環(huán)中，羰酰疊氮化底物與二價(jià)鐵血紅素結(jié)合，形成疊氮-鐵(Ⅱ)復(fù)合物，然后釋放N2產(chǎn)生假定的亞胺-鐵(Ⅳ)中間體；接著，通過逐步的氫原子捕獲/自由基反彈機(jī)制進(jìn)行C—H鍵的活化。該研究結(jié)果表明，原子經(jīng)濟(jì)且易獲得的氮賓供體可以成功應(yīng)用于催化分子內(nèi)C—H鍵氨化的反應(yīng)，也為進(jìn)一步優(yōu)化此類催化劑奠定了基礎(chǔ)。

Farwell等[45]通過對(duì)細(xì)胞色素P450的活性位點(diǎn)進(jìn)行定向進(jìn)化，得到了具有對(duì)映體選擇性產(chǎn)生氮雜環(huán)丙烷功能的新酶，與親本酶相比，酶活性位點(diǎn)的突變導(dǎo)致疊氮化物利用率顯著提高，且選擇性高達(dá)99%。在用該突變酶催化對(duì)甲苯磺酰疊氮和對(duì)甲基苯乙烯生成氮雜環(huán)丙烷的反應(yīng)后發(fā)現(xiàn)，疊氮環(huán)丙烷的形成是通過還原的二價(jià)鐵血紅素與對(duì)甲苯磺酰疊氮反應(yīng)產(chǎn)生鐵-nitrenoid中間體，然后與烯烴反應(yīng)產(chǎn)生氮雜環(huán)丙烷。該研究結(jié)果表明，理性設(shè)計(jì)細(xì)胞色素P450活性位點(diǎn)可以實(shí)現(xiàn)具有挑戰(zhàn)性的非自然反應(yīng)。

Singh等[46]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素P450酶可以作為有效的催化劑，在多種芳基磺酰疊氮化合物中介導(dǎo)分子內(nèi)芐基C—H鍵的胺化反應(yīng)。在后續(xù)研究中，Bordeaux等[47]證明了許多含血紅素的蛋白，特別是肌紅蛋白和辣根過氧化物酶，是芳基磺酰疊氮C—H胺化反應(yīng)的有效催化劑，他們通過對(duì)肌紅蛋白突變體活性位點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，通過蛋白質(zhì)工程可以解決天然肌紅蛋白骨架所提供有限的對(duì)映體選擇性問題，從而產(chǎn)生具有改善立體選擇性和對(duì)映體選擇性的基于肌紅蛋白的催化劑。該研究表明肌紅蛋白為C—H鍵胺化催化劑的設(shè)計(jì)和開發(fā)提供了一個(gè)很有前途的骨架。

目前，催化控制不同的區(qū)域選擇性仍然是小分子催化劑的一個(gè)挑戰(zhàn)，而酶催化劑可以很容易通過誘變和篩選來(lái)獲得所需的選擇性。Arnold團(tuán)隊(duì)的Hyster等[48]設(shè)計(jì)了2種在C—H鍵胺化中具有不同區(qū)域選擇性的P450BM3突變體，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)87位的突變對(duì)于選擇性的控制是重要的，F(xiàn)87V突變體傾向于2,5-雙取代的芳基磺酰疊氮的β-胺化，而F87A突變體更傾向于α-胺化；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，該酶是通過定位1個(gè)靠近鐵-nitrenoid的C—H鍵從而實(shí)現(xiàn)其對(duì)于區(qū)域選擇性的控制。

2.4.2 微生物從頭合成氮雜環(huán)化合物

人工金屬酶雖然可以實(shí)現(xiàn)氮雜環(huán)的一步合成，但是往往需要復(fù)雜前體。利用合成生物學(xué)方法，可以簡(jiǎn)單的底物，通過多步反應(yīng)合成氮雜環(huán)化合物。吳邊團(tuán)隊(duì)的Feng等[49]通過逆合成分析的方法設(shè)計(jì)出一條直接從基礎(chǔ)生物原料葡萄糖到芳香類氮雜環(huán)化合物的新型人工合成途徑，經(jīng)過系統(tǒng)性的工藝優(yōu)化，成功以順次一鍋發(fā)酵的方式，首次實(shí)現(xiàn)了高效的氮雜環(huán)微生物從頭合成方法。為了突破傳統(tǒng)的單細(xì)胞工程帶來(lái)的技術(shù)障礙，他們使用3個(gè)相同物種的細(xì)胞組成了一個(gè)微生物系統(tǒng)，其中，氮雜環(huán)生產(chǎn)菌以蘇氨酸為底物，通過2-氨基乙酰乙酸、1-氨基丙酮和2,5-二甲基二氫吡嗪等中間體合成2,5-二甲基吡嗪(DMP，圖6)，DMP再經(jīng)過側(cè)鏈功能化的生產(chǎn)菌進(jìn)一步合成重要的醫(yī)藥中間體。通過在不同階段依次接種功能細(xì)胞，對(duì)生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行時(shí)空調(diào)整，進(jìn)而模塊化所需要的生物功能，實(shí)現(xiàn)了氮雜環(huán)分子的合成和功能化。

江會(huì)鋒團(tuán)隊(duì)的Peng等[50]在細(xì)胞中引入甲醛酶，通過密碼子優(yōu)化和定向進(jìn)化等方法，將乙醛轉(zhuǎn)化為乙偶姻的效率提高40倍，以1.5 mol/L的乙醛為底物積累了56.7 g/L的乙偶姻；在連續(xù)補(bǔ)料條件下，乙偶姻的質(zhì)量濃度可達(dá)222 g/L，乙醛轉(zhuǎn)化率為85%；在得到乙偶姻后，通過乙偶姻與銨鹽的體外自發(fā)反應(yīng)可以得到94 g/L川芎嗪，乙醛轉(zhuǎn)化率為48%。這一工作也展示了生物-化學(xué)聯(lián)合轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)氮雜環(huán)化合物分子合成的潛力。

圖6 微生物協(xié)同全合成功能性氮雜環(huán)[49]Fig.6 Cooperative microbes for the total biosynthesis of functionalized N-heterocycles[49]

3 設(shè)計(jì)指導(dǎo)含能化合物的生物合成

含能化合物生物合成的研究主要集中于前驅(qū)體合成和生物硝化兩方面，雖然取得了一定的進(jìn)展，但目前還未達(dá)到能夠在生物體內(nèi)從頭合成已知含能化合物的水平。而對(duì)于新的性能良好含能化合物的直接生物合成還處于理論路線設(shè)計(jì)層面。與研發(fā)含能化合物相比，生物合成技術(shù)的挑戰(zhàn)來(lái)源于多方面，如：含能化合物中含有的硝基、疊氮和偶氮等基團(tuán)很難通過生物催化引入；需要考慮到在生物體內(nèi)進(jìn)行合成時(shí)，生物體的耐受能力以及后續(xù)的終產(chǎn)物分離純化過程等。

隨著高性能計(jì)算技術(shù)的迅猛發(fā)展，基于生物平臺(tái)的綠色合成制造技術(shù)朝著更高效、更智能、更具有創(chuàng)造性的方向進(jìn)發(fā)。定向進(jìn)化和新興的計(jì)算設(shè)計(jì)都是含能化合物生物合成的重要研究方法。

酶的生物轉(zhuǎn)化具有非常廣泛的底物范圍和高的反應(yīng)性和選擇性，這種生物催化系統(tǒng)使我們能夠輕易地獲得在自然界中很少見到的多功能分子結(jié)構(gòu)，并擴(kuò)展生物系統(tǒng)可及的化學(xué)空間。高應(yīng)變碳環(huán)是一類高能量化合物，雙環(huán)丁烷折疊的結(jié)構(gòu)形式是張力最大的四元體系之一，應(yīng)變?yōu)?76.3 kJ/mol[51]。Arnold研究團(tuán)隊(duì)的Chen等[52]通過定向進(jìn)化改造P450酶，成功構(gòu)建了用于生產(chǎn)高應(yīng)變雙環(huán)丁烷和環(huán)丁烯的生物催化平臺(tái)。該蛋白通過激活鐵-卡賓體使卡賓加到炔烴上，在雙環(huán)丁烷生成中穩(wěn)定反應(yīng)性的環(huán)丙烯中間體以及卡賓轉(zhuǎn)移過程的精確立體控制，從而實(shí)現(xiàn)了所需的反應(yīng)轉(zhuǎn)化。他們首先發(fā)現(xiàn)絲氨酸配位的P411血紅素蛋白具有卡賓轉(zhuǎn)移炔烴的潛力，然后通過分析設(shè)計(jì)得到突變體P411-E10(P4 A78V A82L F263L)，發(fā)現(xiàn)E10能夠催化產(chǎn)生雙環(huán)丁烷，接著選擇P411-E10突變體作為起始模板用于定向進(jìn)化，成功構(gòu)建出一種更高效且底物譜更廣泛的雙環(huán)丁烷酶和環(huán)丁烯酶。

創(chuàng)新性引入生物催化過程為綠色化學(xué)的應(yīng)用提供了廣闊的前景。然而由于有限的催化性能，從自然界生物多樣性中獲得的酶往往需要通過長(zhǎng)時(shí)間、反復(fù)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化來(lái)改進(jìn)才能獲得所需的功能。Das等[53]和Richter 等[54]從蛋白質(zhì)折疊算法出發(fā)，開發(fā)了Rosetta程序包，可以實(shí)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)功能[53-54]，他們通過Rosetta設(shè)計(jì)了新酶，催化Kemp消除[55]和反醇醛縮合[56]等已知天然酶不能催化的反應(yīng)?；赗osetta及其他蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)方法，研究者可以優(yōu)化已知人工金屬酶的結(jié)構(gòu)，提高催化活性[57]；也可以設(shè)計(jì)新酶，實(shí)現(xiàn)手性β-氨基酸[58]和D-氨基酸等實(shí)驗(yàn)室合成和工程應(yīng)用[59]。

4 總結(jié)與展望

含能化合物由于自身結(jié)構(gòu)性能特點(diǎn)，在制備過程中存在高危易爆的風(fēng)險(xiǎn)。除了追求性能更高、更安全的含能材料之外，含能化合物制造工藝的安全環(huán)保也是重要的目標(biāo)。生物合成含能化合物作為代表性的綠色化學(xué)合成方法，秉承可再生可持續(xù)發(fā)展的理念，具有從可再生資源中提取并使用可持續(xù)方法制造的特點(diǎn)，是一種有前景、有潛力、可發(fā)展推廣的新型技術(shù)。酶作為催化劑，能夠加速化學(xué)轉(zhuǎn)化的數(shù)量級(jí)，同時(shí)表現(xiàn)出可控制的選擇性，但存在于狹窄的底物范圍和有限的反應(yīng)類型等缺點(diǎn)。而近年來(lái)發(fā)展的人工金屬酶(ArM)技術(shù)在克服這些挑戰(zhàn)方面顯示出了潛力，隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展，ArM的研究進(jìn)展迅速。通過理性設(shè)計(jì)改造，ArM可以催化天然酶無(wú)法進(jìn)行的非自然反應(yīng)，而且具有高反應(yīng)選擇性、寬泛的底物譜及生物相容性等特點(diǎn)。通過將ArM催化引入含能化合物生物合成的代謝途徑中，將會(huì)使該生物合成過程更高效、更易于設(shè)計(jì)且具有更高的可控性。

隨著微生物組學(xué)、代謝工程和合成生物學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展，我們已經(jīng)有能力構(gòu)建具有特定功能的微生物，并能合成大量具有醫(yī)學(xué)和工業(yè)重要性的化合物。通過代謝工程可以使藥物、化學(xué)品、燃料和材料的生物生產(chǎn)成為可能并以此發(fā)展起來(lái)，通過合成生物學(xué)可以建立生物部件、模塊和系統(tǒng)來(lái)理解和操縱生物工廠。為了實(shí)現(xiàn)含能化合物的生物全合成，生物合成機(jī)制解析、代謝途徑構(gòu)建、細(xì)胞產(chǎn)物釋放、產(chǎn)物分離純化等方面均要給予考慮。為了實(shí)現(xiàn)含能化合物生物全合成的工業(yè)級(jí)生產(chǎn)，除了生物催化在上游代謝途徑的優(yōu)化之外，該工藝的下游提取過程也應(yīng)當(dāng)符合“綠色化學(xué)”要求。利用微生物細(xì)胞代替化學(xué)工廠合成含能化合物具有廣闊的應(yīng)用前景，在今后的發(fā)展過程中，基于生物平臺(tái)的綠色合成方法不僅會(huì)成為能源材料工業(yè)，而且會(huì)成為整個(gè)化學(xué)工業(yè)高度追求的目標(biāo)。