MMP1基因rs491152多態(tài)性與COPD發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)性分析*

唐李鳳，鐘雪梅，馬 濤，弓 慧，鄭愛芳，解承鑫，李菲菲，李 黎,△

1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832000；2.喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，新疆喀什844000；3.喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院新疆感染性疾病(結(jié)核病)臨床醫(yī)學(xué)研究中心，新疆喀什 844000

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種常見的呼吸道疾病，位于中國主要死因的第4位[1]。一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國喀什地區(qū)農(nóng)村40歲以上維吾爾族人群COPD的發(fā)病率高達(dá)17.01%[2]，明顯高于全國平均水平[3]。遺傳因素在COPD的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用[4]，在中國維吾爾族人群中鑒定COPD相關(guān)的基因突變可以對(duì)其提供一定依據(jù)和理論基礎(chǔ)，幫助理解這一現(xiàn)象。目前隨著高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，基因組學(xué)的研究可以把分子診斷策略廣泛地應(yīng)用于COPD的診斷和治療中。蛋白質(zhì)編碼基因僅占人類基因組的1%左右，但包含所有突變的85%，并且明顯影響疾病的相關(guān)性狀[5]，全外顯子測(cè)序(WES)有助于獲得對(duì)各種人類疾病的相關(guān)見解[5]。本研究對(duì)3個(gè)維吾爾族COPD家系進(jìn)行WES，經(jīng)過生物信息學(xué)分析，獲得一個(gè)新的候選突變——基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1)基因rs491152[6]。蛋白酶-抗蛋白酶失衡是COPD的眾多重要病理特征之一，抗蛋白酶相對(duì)缺乏，肺組織結(jié)構(gòu)被分解破壞可導(dǎo)致終末氣道擴(kuò)張而引起肺氣腫。MMPs能夠降解許多細(xì)胞外分子和生物活性分子，是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白酶[7]。MMP1基因位于染色體11q22.3，包含10個(gè)外顯子，是MMP基因簇的一部分，在細(xì)胞外基質(zhì)重塑中降解纖維性膠原。長(zhǎng)期吸入香煙煙霧(CS)會(huì)誘發(fā)蛋白過度水解，CS可能通過激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[8]和Toll樣受體4信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[9]介導(dǎo)MMP1表達(dá)增加，從而導(dǎo)致肺組織過多破壞，進(jìn)而發(fā)展為肺氣腫。多項(xiàng)研究表明，MMP1在COPD患者血清中表達(dá)增加，且受CS的明顯影響，提示MMP1在COPD的病理生理機(jī)制中發(fā)揮重要作用[9-11]。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是個(gè)體最常見的遺傳變異，可能影響啟動(dòng)子活性(基因表達(dá))、信使 RNA構(gòu)象及mRNA和(或)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，進(jìn)而參與疾病的發(fā)生和發(fā)展[12]。MMP1基因SNPs可能與COPD的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[13-15]，但此前關(guān)于MMP1基因在COPD中的研究多集中在啟動(dòng)子中 (-1607 1G/2G) 的rs1799750 SNP，且結(jié)論存在爭(zhēng)議[13-18]。更多多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)于理解MMP1基因SNPs在COPD的發(fā)生和發(fā)展中的作用至關(guān)重要。此外，MMP1基因rs491152多態(tài)性與COPD肺功能評(píng)估指標(biāo)是否相關(guān)，能否成為未來預(yù)測(cè)COPD發(fā)生和發(fā)展的標(biāo)志物，亟待進(jìn)一步研究。本研究旨在通過基于喀什地區(qū)維吾爾族人群的病例對(duì)照研究來評(píng)估MMP1基因rs491152多態(tài)性與COPD發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018-2019年于喀什地區(qū)招募病例對(duì)照研究隊(duì)列入組。541例COPD患者(病例組)和534例健康對(duì)照者(對(duì)照組)均來自喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院，其中病例組男280例，女261例；對(duì)照組男234例，女300例。COPD的診斷符合COPD全球倡議概述的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即吸入支氣管擴(kuò)張劑后第1秒用力呼氣容積(FEV1)/用力肺活量(FVC)<70%[19]。受試者的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)與GONG等[20]報(bào)道一致。所有受試者為3代以上居住在喀什地區(qū)的維吾爾族人群，年齡均大于40歲。錄入所有受試者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、吸煙狀況等基線資料。本研究通過喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2MMP1基因rs491152位點(diǎn)的來源 MMP1基因rs491152位點(diǎn)來源于COPD家系的WES，具體篩選說明詳見XU等[6]的研究報(bào)道。WES被用于3個(gè)家庭共9名成員(8名患者，1名健康對(duì)照者)。通過WANG等[21]研究(https://annovar.openbioinformatics.org/)進(jìn)行突變注釋，并將單核苷酸變異(SNV)在1000 Genomes、COSMIC、ClinVar、esp6500、ExAC_ALL、GWAS Catalog等不同數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，從而得到更為準(zhǔn)確的注釋結(jié)果。之后對(duì)上述步驟獲得的SNV進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括致病性評(píng)估、GO富集分析、通路富集分析及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析等。最終篩選出在家系中患病與健康成員之間差異表達(dá)位點(diǎn)——MMP1基因rs491152。

1.3DNA提取及目標(biāo)位點(diǎn)基因分型 于清晨時(shí)采集1 075例受試者空腹外周靜脈血5 mL，采用Greiner基因組DNA提取試劑盒(Greiner、Pleidelsheim、Germany)按照說明書步驟從全血中提取DNA。NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA)用于檢測(cè)DNA純度。采用48-Plex SNPscan試劑盒(Center for Genetic & Genomic Analysis,Genesky Biotechnologies Inc.,Shanghai,China)對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序[20]。分型成功率在98%以上。最后采用ABI3730XL(ABI、USA)測(cè)序器和Genemapper4.1(AppliedBiosystems,USA)分析位點(diǎn)多態(tài)性。

2 結(jié) 果

2.1兩組一般資料比較 兩組在煤炭暴露史、木炭暴露史和家庭年收入方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組在年齡、性別、BMI、吸煙狀況、吸煙指數(shù)(SI，SI=每天吸煙支數(shù)×吸煙年數(shù))、FEV1%和FEV1/FVC方面比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較[n(%)或或M(P25～P75)]

組別n吸煙狀況從不吸煙曾吸煙當(dāng)前吸煙SI<1≥1～400>400～800>800病例組541 417(77.08)23(4.25)101(18.67)417(77.08)98(18.11)16(2.96)10(1.85)對(duì)照組534465(87.08)17(3.18)52(9.74)465(87.08)52(9.74)11(2.06)6(1.12)P<0.001<0.001

組別n煤炭暴露史是否木炭暴露史是否肺功能指標(biāo)FEV1(%)FEV1/FVC病例組541513(94.82)28(5.18)519(95.93)22(4.07)69.00(53.92～82.00)0.62(0.55～0.66)對(duì)照組534516(96.63)18(3.37)500(93.63)34(6.37)86.00(74.00～98.00)0.80(0.75～0.86) P0.1440.090<0.001<0.001

2.2Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 分別對(duì)病例組和對(duì)照組中所檢測(cè)到的MMP1基因rs491152基因型分布頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，此多態(tài)性位點(diǎn)的基因型在對(duì)照組中分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，具有群體代表性。

2.3MMP1基因rs491152與COPD風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性分析 MMP1基因rs491152位點(diǎn)在病例組和對(duì)照組的分型成功率分別為98.89%(535/541)、99.63%(532/534)。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，rs491152位點(diǎn)在所有遺傳模型下與COPD風(fēng)險(xiǎn)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 MMP1基因rs491152基因型和等位基因頻率在病例組和對(duì)照組中的分布情況比較[n(%)]

2.4吸煙組和非吸煙組中MMP1基因rs491152的基因型分布及其與COPD風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性分析 根據(jù)吸煙史進(jìn)行亞組分析，采用校正年齡、性別和BMI后的多因素Logistic回歸方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，非吸煙組和吸煙組中rs491152與COPD風(fēng)險(xiǎn)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 MMP1基因 rs491152在吸煙組和非吸煙組中的遺傳模型分析

2.5MMP1基因rs491152多態(tài)性與COPD患者肺功能損傷的關(guān)系 多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，MMP1基因rs491152多態(tài)性與肺功能嚴(yán)重程度評(píng)估指標(biāo)之間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 MMP1基因rs491152在病例組不同F(xiàn)EV1%中的分布情況比較[n(%)]

3 討 論

COPD是一種復(fù)雜的、多因素的、多基因的疾病[22]。許多研究試圖通過尋找突變來評(píng)估基因與COPD之間的關(guān)系。本研究對(duì)來自3個(gè)維吾爾族COPD家系的受試者進(jìn)行了WES，經(jīng)過生物信息學(xué)分析，獲得了在患者和健康成員間差異表達(dá)位點(diǎn)MMP1基因rs491152。本研究在喀什地區(qū)維吾爾族人群中進(jìn)一步評(píng)估了MMP1基因rs491152與COPD發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)性，然而并沒有觀察到MMP1基因rs491152對(duì)COPD的致病或保護(hù)作用，并且與是否吸煙無關(guān)。在對(duì)FEV1%的分層分析中發(fā)現(xiàn)，rs491152 SNP也不影響肺功能的嚴(yán)重程度。

蛋白酶介導(dǎo)的彈性蛋白破壞的是肺實(shí)質(zhì)中的主要結(jié)締組織成分，被認(rèn)為是肺氣腫的一個(gè)重要特征[22]。MMP1基因主要作用底物為纖維性膠原，可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原纖維[7]，從而在呼吸道組織重塑的調(diào)節(jié)過程中起重要作用。進(jìn)行性肺泡損傷是由于選擇性細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解，這可能與其不受調(diào)控、過度的蛋白質(zhì)水解有關(guān)[23]。SNPs與基因表達(dá)、功能、表型和疾病均有關(guān)[12]，識(shí)別基因中的許多變異并分析其影響可能會(huì)有助于更好地理解它們對(duì)基因功能和個(gè)體健康的影響。遺傳證據(jù)表明，MMP1基因啟動(dòng)子多態(tài)性-1607 1G/2G與COPD易感性相關(guān)，突變純合子GG/GG基因型是COPD的高危因素[14-15]。JOOS等[13]研究發(fā)現(xiàn)，-1607 1G/2G與連續(xù)吸煙者肺功能下降率相關(guān)，且-1607 GG等位基因明顯影響肺功能的快速下降率。然而，遺傳研究并沒有提供一致的結(jié)果。BCHIR等[18]研究表明，MMP1基因-1607 1G/2G、-519 A/G可能不影響突尼斯人群COPD風(fēng)險(xiǎn)和疾病嚴(yán)重程度。在中國北方漢族、韓國人群中同樣未觀察到MMP1基因-1607 1G/2G與COPD易感性的相關(guān)性[16-17]。HERNANDEZ-MONTOYA等[24]在330例有吸煙史COPD患者、658例無吸煙史COPD患者和150例健康非吸煙者中評(píng)估了MMP1基因其他3個(gè)位點(diǎn)(rs470215、rs7125062、rs2071232)，但這些SNPs與墨西哥人群COPD并不相關(guān)。本研究在1 075例維吾爾族受試者中嘗試尋找新突變，然而并未觀察到MMP1基因rs491152 SNP與COPD易感性、嚴(yán)重程度之間的明顯關(guān)聯(lián)。此外，在本研究的吸煙分層分析中，MMP1基因rs491152同樣未顯示出與COPD易感性明顯關(guān)聯(lián)。基于上述文獻(xiàn)資料可發(fā)現(xiàn)，MMP1基因SNPs與COPD的相關(guān)性仍存在爭(zhēng)議，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是：樣本量小、遺傳異質(zhì)性、環(huán)境(CS暴露)異質(zhì)性等。

本研究納入的COPD樣本為散發(fā)人群，覆蓋了喀什地區(qū)下轄的大部分區(qū)域，在一定程度上降低了選擇偏倚對(duì)結(jié)果的影響。在吸煙狀況的亞組分析中觀察到rs491152多態(tài)性與COPD易感性無明顯相關(guān)性，而吸煙組的樣本量較少，這只能表明MMP1基因rs491152可能不是預(yù)測(cè)非吸煙人群COPD易感性的重要標(biāo)志物。鑒于MMP1基因參與CS相關(guān)的肺氣腫病理機(jī)制，因此，有必要通過擴(kuò)大吸煙組樣本量來進(jìn)一步評(píng)估二者的關(guān)系。值得注意的是，這項(xiàng)研究的人群驗(yàn)證是基于喀什的民族特征——維吾爾族，這并不意味著rs491152 SNP與其他人群的COPD無關(guān)，尤其是吸煙人群。

維吾爾族COPD家系WES篩選出一個(gè)COPD潛在的候選突變——MMP1基因rs491152，基于人群的病例對(duì)照研究卻表明MMP1基因rs491152 SNP可能不是預(yù)測(cè)中國維吾爾族非吸煙人群COPD發(fā)生和發(fā)展的重要標(biāo)志物。盡管MMP1基因與CS誘發(fā)的肺氣腫密切相關(guān)，然而支持膠原分解參與COPD病理機(jī)制的證據(jù)不足，其在COPD發(fā)生和發(fā)展機(jī)制中的確切功能仍然是一個(gè)懸而未解決的問題。MMP1基因rs491152 SNP與其他人群COPD的關(guān)系，尤其是吸煙人群，以及MMP1基因更多位點(diǎn)在COPD病理機(jī)制中的作用有待進(jìn)一步探索。