顧 星，盧 薇，徐大琴，張影菊

成都市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院兒科，四川成都 610000

毛細(xì)支氣管炎的特征是反復(fù)發(fā)作的氣道炎癥反應(yīng)、免疫球蛋白(Ig)E過度產(chǎn)生、黏液分泌過多和氣道高反應(yīng)性，全球有超過1億的患兒[1]。越來越多的證據(jù)表明，毛細(xì)支氣管炎是多因素疾病，是由多種遺傳和環(huán)境因素相互作用引起的，但其詳細(xì)機制尚未完全闡明[2-3]。自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)是先天免疫系統(tǒng)中的特殊淋巴細(xì)胞，能夠在沒有抗原特異性識別和克隆擴增的情況下感知和消除病原體感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞[4]。NK細(xì)胞的功能受激活和抑制信號的平衡調(diào)節(jié)。NK細(xì)胞通過主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類特異性表面受體接收抑制信號，例如殺傷Ig樣抑制受體和CD94-NKG2A異二聚體。NK細(xì)胞還有一系列刺激性受體，包括天然細(xì)胞毒性受體(NKp46、NKp30、NKp44)、NKG2D和其他孤兒受體。NKG2D在CD8+-a和-b細(xì)胞，以及NK細(xì)胞上表達(dá)，CD8+-a和-b細(xì)胞上的NKG2D可作為抗原識別的共刺激分子，通過NK細(xì)胞上的NKG2D發(fā)出的信號促進(jìn)NK細(xì)胞活性(如增殖)[5-6]。NKG2D還通過激活信號蛋白誘導(dǎo)過敏性和嗜酸性介質(zhì)[如白細(xì)胞介素(IL)-5、IL-13]的釋放，導(dǎo)致嗜酸性炎癥和IL-33信號減弱[7]，這些數(shù)據(jù)表明NKG2D基因可能參與毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病。有研究表明，NKG2D基因多態(tài)性與兒童哮喘之間存在關(guān)系[8]，但少有研究顯示NKG2D單基因位點與毛細(xì)支氣管炎易感性相關(guān)。本研究考慮地區(qū)和種族的差異，采用聚合酶鏈反應(yīng)分析毛細(xì)支氣管炎患兒的NKG2D基因多態(tài)性，研究其與毛細(xì)支氣管炎和血清炎癥因子水平的關(guān)系，為該病的預(yù)防、診斷和治療提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年12月至2021年12月本院兒科收治的120例毛細(xì)支氣管炎患兒作為病例組，其中男58例，女62例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合毛細(xì)支氣管炎的診斷；(2)患兒未接受腎上腺皮質(zhì)激素或免疫調(diào)節(jié)劑治療；(3)無家族史的哮喘或其他過敏性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)營養(yǎng)不良、免疫功能低下、先天性呼吸道畸形、慢性鼻咽炎、佝僂病；(2)嚴(yán)重心血管疾病或其他重大疾病。另選取同期本院門診行健康體檢的98例健康兒童作為對照組，其中男50例，女48例，無任何呼吸道疾病癥狀。本研究按照赫爾辛基宣言進(jìn)行，并經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。所有研究對象監(jiān)護(hù)人均知情同意并簽署知情同意書。

1.2血常規(guī)及一般生化指標(biāo)檢測 抽取所有研究對象清晨空腹靜脈抽血5 mL，5 000 r/min分離血清，采用貝克曼庫爾特AU-680全自動生化分析儀及希森美康IX-2000全自動血細(xì)胞分析儀檢測血常規(guī)及一般生化指標(biāo)。

1.3NKG2D 基因的rs48965 單核苷酸多態(tài)性檢測 根據(jù)制造商說明，使用基因組DNA提取試劑盒(NO.DP318，TIANGEN，Biotech，北京，中國)從外周靜脈血中分離基因組DNA。Nanodrop2000檢測分離的基因組DNA的濃度和純度；使用瓊脂糖凝膠電泳分析其質(zhì)量和完整性。然后將 DNA 樣品儲存于-80 ℃。NKG2D基因位點的PCR引物均由Invitrogen(Thermo Fisher Scientific，美國)合成。NKG2D基因啟動子區(qū)rs48965位點的PCR引物序列如下：正向5′-TCGATCGTGTAGTCGATCGATCGATCGTAG CTAGCTAGCTAGGGTAGCTAGCTGC-3′;反向5′-TGGGGCTGTCGCTAGCTAGCTGACTGCTGA TCGATCGATCGATGCTAGCTAGCTGCTAGTG C-3′。采用Takara LA TaqTM(代碼號DRR042A)進(jìn)行PCR擴增。NKG2D引物PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，制備瓊脂糖凝膠(2%)。PCR產(chǎn)物(5 μL)和6×上樣緩沖液(1 μL)完全混合后加入上樣孔，150 V電壓下電泳1 h。凝膠放入數(shù)字成像顯示系統(tǒng)。如果每對引物均能擴增到亮度均勻、特異性好、大小和位置正確的目的條帶，則認(rèn)為PCR擴增成功。如果沒有或出現(xiàn)明顯的非特異性條帶，則認(rèn)為PCR擴增失敗，重復(fù)PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)ABI 3500xL基因分析儀檢測后進(jìn)行堿基測序，測序結(jié)果通過Mutation Surveyor軟件進(jìn)行比對分析，得到相關(guān)基因型。

1.4血清炎癥因子水平檢測 采用MK3酶標(biāo)儀檢測干擾素(IFN)-γ、IL-4、IgE水平，IFN-γ、IL-4、IgE酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒購于上海雅吉生物科技有限公司(批號：HU-59854、NB-96547、CU-74850)。

2 結(jié) 果

2.1對照組和病例組一般資料比較 病例組白細(xì)胞計數(shù)(WBC)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、IFN-γ、IL-4、IgE水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而兩組年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、收縮壓、舒張壓、血紅蛋白(Hb)、血細(xì)胞比容(Hct)、血小板計數(shù)(PLT)、清蛋白(ALB)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、葡萄糖(GLU)、鈣(Ca)、肌酐(Cr)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 對照組和病例組一般資料比較

組別nHct(%)PLT(×109/L)ALB(g/L)AST(U/L)GGT(U/L)對照組980.49±0.05197.57±52.2439.69±3.4850.18±18.5986.28±26.52病例組1200.48±0.06198.27±54.5839.29±4.1849.29±19.36125.48±23.58t1.2961.8351.6881.33511.543P>0.05>0.05>0.05>0.05<0.001

組別nTBIL(μmol/L)DBIL(μmol/L)GLU(mmol/L)Ca(mmol/L)Cr(μmol/L)TC(mmol/L)對照組9826.48±10.505.14±2.5912.36±3.511.93±0.3389.25±10.374.48±3.75病例組12027.29±11.275.36±2.5913.21±3.592.04±0.4991.59±11.244.29±3.48t1.3981.4791.4991.0250.9391.497P>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05

組別nHDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)TG(mmol/L)IFN-γ(ng/L)IL-4(ng/L)IgE(g/L)對照組981.69±0.582.15±1.171.59±0.4818.59±9.5920.48±9.2525.14±6.54病例組1201.59±0.592.14±1.151.58±0.4839.32±9.2556.25±10.5865.59±12.96t1.7851.3950.97426.21432.18924.158P>0.05>0.05>0.05<0.001<0.001<0.001

2.2對照組和病例組NKG2D rs48965 AA、AT、TT基因型比例比較 病例組 NKG2D rs48965 AA基因型比例高于對照組， NKG2D rs48965 TT基因型比例低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。NKG2D rs48965 AA基因型能增加兒童毛細(xì)支氣管炎的易感性(OR=1.93，95%CI：1.25～2.93,P<0.05)。見表2。

表2 對照組和病例組NKG2D rs48965 AA、AT、TT基因型比例比較[n(%)]

2.3對照組和病例組 NKG2D rs48965 A、T等位基因頻率比例比較 病例組 NKG2D rs48965 A等位基因頻率比例高于對照組，NKG2D rs48965 T等位基因頻率比例低于對照組，差異均有計學(xué)意義(P<0.05)。NKG2D rs48965 A等位基因頻率能增加兒童毛細(xì)支氣管炎的易感性(OR=2.29,95%CI：1.62～3.20,P<0.05)。見表3。

表3 對照組和病例組 NKG2D rs48965 A、T等位基因頻率比較[n(%)]

2.4病例組NKG2D rs48965各基因型患兒IFN-γ、IL-4、IgE水平比較 NKG2D rs48965 AA基因型患兒IFN-γ、IL-4、IgE水平均高于AT、TT基因型患兒，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；NKG2D rs48965 AT基因型患兒IFN-γ、IL-4、IgE水平均高于TT基因型患兒，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 病例組NKG2D rs48965各基因型患兒IFN-γ、IL-4、IgE水平比較

2.5兒童毛細(xì)支氣管炎發(fā)生的多因素Logistic回歸分析 以兒童毛細(xì)支氣管炎發(fā)生作為因變量，以NKG2D rs48965等位基因頻率等單因素分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義的因素作為自變量進(jìn)行多因素Logistic逐步回歸分析，結(jié)果顯示，NKG2D rs48965 AA基因型、NKG2D rs48965 A等位基因頻率比例增高為兒童毛細(xì)支氣管炎發(fā)生的獨立危險因素(P<0.05)。見表5。

表5 兒童毛細(xì)支氣管炎發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

目前有研究認(rèn)為，毛細(xì)支氣管炎是一種多基因遺傳病，具有明顯的家族聚集性和較強的遺傳異質(zhì)性，其遺傳率為60%～80%[9]。毛細(xì)支氣管炎不遵循經(jīng)典的孟德爾遺傳定律，這往往是由多種遺傳因素、環(huán)境因素及其他易感因素相互作用引起的[10]，存在基因-基因和基因-環(huán)境的相互作用。有研究表明，細(xì)胞因子是毛細(xì)支氣管炎發(fā)作過程中炎癥細(xì)胞間重要信息的傳遞者，決定了炎癥反應(yīng)的類型和持續(xù)時間[11]。各種炎癥介質(zhì)對氣道的作用不同，它們之間的相互作用引起并加重呼吸道高反應(yīng)性和氣道炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致IgE水平升高，產(chǎn)生毛細(xì)支氣管炎的病理、生理特征[12]。IFN-γ、IL-4在IgE合成過程中對細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要作用，在調(diào)節(jié)血清IgE水平和毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病機制中也起重要作用[13]。

NKG2D是一種激活的跨膜受體，由人類NK細(xì)胞和T細(xì)胞亞群表達(dá)。NKG2D信號傳導(dǎo)參與癌癥免疫監(jiān)視、病毒感染防御和自身免疫性疾病，由于它們在適應(yīng)性和先天免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵作用，NKG2D及其配體已被認(rèn)為是潛在的治療靶點。有研究表明，呼吸道合胞病毒(RSV)感染通過 NKG2D受體激活免疫系統(tǒng)[14]，在體外將RSV感染引入人樹突狀細(xì)胞會導(dǎo)致NKG2D配體上調(diào)，并導(dǎo)致NK細(xì)胞增殖和IFN-γ產(chǎn)生，在來自BALB/c小鼠肺部的NK細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果。有研究表明，在RSV感染的早期階段，NKG2D高表達(dá)和隨后的IFN-γ產(chǎn)生與肺免疫損傷有關(guān)[15]。此外，NKG2D還可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)血管細(xì)胞黏附分子21的表達(dá)，參與毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病機制[16]。

NKG2D直接或間接誘導(dǎo)肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒產(chǎn)生支氣管高反應(yīng)性和炎癥反應(yīng)，在哮喘的即刻和延遲反應(yīng)中起重要作用。此外，NKG2D對B細(xì)胞、T 細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞均具有免疫調(diào)節(jié)作用[17]。NKG2D基因啟動子區(qū)的突變C→A on-590位點與哮喘的發(fā)生有關(guān)，A等位基因可增加IgE水平。新疆維吾爾族哮喘患兒NKG2D基因-590位點T→A分析結(jié)果顯示，哮喘組AA基因型兒童哮喘發(fā)病風(fēng)險較TT基因型兒童增加7.91倍(OR=8.91,95%CI：1.89～41.98)[18]，這些數(shù)據(jù)表明NKG2D T等位基因可能增加兒童IgE水平和哮喘發(fā)生的概率。本研究結(jié)果表明，病例組 NKG2D rs48965 AA基因型比例、A等位基因頻率比例均高于對照組，NKG2D rs48965 TT基因型比例、T等位基因頻率比例均低于對照組。由此表明，NKG2D rs48965 AA基因型、A等位基因頻率均能明顯增加兒童毛細(xì)支氣管炎的易感性。

有研究發(fā)現(xiàn)，NKG2D基因位點與哮喘和血清IFN-γ、IL-4、IgE水平密切相關(guān)[19]。 本研究發(fā)現(xiàn)，毛細(xì)支氣管炎患兒NKG2D rs48965位點存在TT、TA、AA 3種基因型，其基因型比例分別為18.3%、15.0%和66.7%，而對照組比例分別為55.1%、9.2%和35.7%。NKG2D rs48965 AA基因型比例高于對照組，TT基因型比例低于對照組，AA基因型能增加兒童毛細(xì)支氣管炎的易感性(OR=1.93)，提示AA基因型在毛細(xì)支氣管炎易感性中發(fā)揮重要作用。病例組患兒IFN-γ、IL-4、IgE水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；NKG2D rs48965 AA基因型患兒IFN-γ、IL-4、IgE水平均高于AT、TT基因型患兒，NKG2D rs48965 AT基因型患兒IFN-γ、IL-4、IgE水平均高于TT基因型患兒，提示NKG2D rs48965基因座堿基突變與血清IFN-γ、IL-4、IgE水平相關(guān)。這說明NKG2D rs48965 AA基因型比例與毛細(xì)支氣管炎患兒外周炎癥細(xì)胞因子具有一定的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，NKG2D rs48965 AA基因型、NKG2D rs48965 A等位基因頻率比例增高為兒童毛細(xì)支氣管炎發(fā)生的獨立危險因素。

綜上所述，NKG2D rs48965 AA基因型、NKG2D rs48965 A等位基因能增加兒童毛細(xì)支氣管炎的易感性，并且與外周炎癥細(xì)胞因子具有一定的相關(guān)性。