苗藥驗(yàn)方對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎家兔血清β-catenin、TNF-α 水平的影響

付鈺 李寶杰 陶陶 古麗玲 羅昌祿 梅建 夏景富

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病,主要臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、功能障礙,從而影響人們的生活質(zhì)量［1］。貴州地處云貴高原,氣候陰冷潮濕,是膝骨關(guān)節(jié)炎的高發(fā)地區(qū),長(zhǎng)期以來(lái),苗族人民在與關(guān)節(jié)炎抗?fàn)幍倪^(guò)程中發(fā)現(xiàn),苗醫(yī)藥治療膝骨關(guān)節(jié)炎療效可靠,便于操作,成本低廉且安全性高。苗藥熏蒸療法屬于苗醫(yī)傳統(tǒng)外治法的一種,是通過(guò)對(duì)皮部的溫?zé)帷⑺幬?、機(jī)械等刺激而發(fā)揮治療作用,屬于經(jīng)皮給藥的范疇。離子導(dǎo)入技術(shù)是現(xiàn)代經(jīng)皮給藥技術(shù)中研發(fā)最早的一種技術(shù),能促使皮膚電阻下降,改善局部血液循環(huán),通過(guò)其電場(chǎng)對(duì)藥物離子產(chǎn)生定向的推動(dòng)力來(lái)提高藥物的經(jīng)皮滲透率［2］。本研究用木瓜蛋白酶制備家兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型,觀察苗藥驗(yàn)方熏蒸療法與離子導(dǎo)入療法對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎家兔血清中β-catenin、TNF-α 水平的影響,探索苗藥治療膝骨關(guān)節(jié)炎的效應(yīng)機(jī)制,為苗藥的推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與分組 新西蘭大白兔36 只,雌雄各半,體重2.0～2.5 kg,SPF級(jí)繁殖飼料飼養(yǎng),滅菌飲用水飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度20～26℃,濕度40%～70%。

1.1.2 主要儀器及試劑 定向透藥離子導(dǎo)入儀(FB-312012002,長(zhǎng)沙海憑醫(yī)療設(shè)備有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-2,常州天瑞儀器有限公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(WD-2102B,北京市六一儀器廠)；木瓜蛋白酶(CAS#9001-73-4,上海源葉生物科技有限公司)；兔TNF-α 試劑盒(ED-72292,廈門(mén)侖昌碩生物科技有限公司)；兔β-catenin 劑盒(ED-73872,廈門(mén)侖昌碩生物科技有限公司)。

1.1.3 苗藥驗(yàn)方［3］透骨香(杜鵑花科)30 g、白龍須(八角楓科)6 g、土一枝蒿(菊科)10 g、五香血藤(五味子科)10 g、大血藤(木通科)10 g、艾納香(菊科)30 g、艾葉(菊科)15 g 等(貴州貴陽(yáng)同濟(jì)堂藥店)。苗藥制備方法：將以上諸藥用蒸餾水浸泡40 min 后煎煮,煎煮成濃度為68%～70%的藥液備用。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及造模 適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、苗藥熏蒸組、苗藥離子導(dǎo)入組,每組9 只。將4%木瓜蛋白酶溶液(4%木瓜蛋白酶的配制：稱取0.168 g 的木瓜蛋白酶,加入4.2 ml 的生理鹽水完全溶解)0.3 ml 注入模型組、苗藥熏蒸組、苗藥離子導(dǎo)入組的家兔右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)［4］,每隔3 d 注射1 次,連續(xù)注射3 次,獲得穩(wěn)定的膝骨關(guān)節(jié)炎模型后造模完成。

1.2.2 治療方法 苗藥熏蒸組：造模成功后,每日將苗藥置于自制恒溫熏洗箱中,待蒸氣溫度達(dá)到39～40℃對(duì)家兔進(jìn)行熏蒸,20 min/次；苗藥離子導(dǎo)入組：造模成功后,用兩片醫(yī)用無(wú)菌藥墊充分浸濕苗藥液5 ml,包裹在家兔右膝關(guān)節(jié),外包連接定向透藥離子導(dǎo)入儀的電極板,外面用繃帶膠布固定,定向透藥離子導(dǎo)入儀持續(xù)治療20 min,治療時(shí)紅外強(qiáng)度設(shè)置為1,能量強(qiáng)度設(shè)置為5。以上治療1 次/d,共治療20 d,治療時(shí)以與空氣混合的5%異氟烷輕度吸入性麻醉。正常對(duì)照組與模型組：造模成功后每日抓拿及輕度麻醉,但不實(shí)施治療。

1.2.3 行為學(xué)觀察 分別于治療第10、20 天用改良Lequesne MG 的膝關(guān)節(jié)級(jí)別評(píng)估方法［5］對(duì)四組家兔右膝關(guān)節(jié)局部反應(yīng)、步態(tài)改變、關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍及腫脹程度等情況進(jìn)行評(píng)估。

1.2.4 取血與血清的制備 造模成功后第21 天,四組家兔均在無(wú)菌條件下心臟采血。所取血液放4℃冰箱靜置過(guò)夜,離心(3000 r/min)20 min,取上清,將同組動(dòng)物血清混合,經(jīng)0.22 μm 抽濾除菌后,56℃滅活30 min,分裝,于-80℃冰箱保存,備用。

1.2.5 ELISA 方法檢測(cè)家兔血清β-catenin、TNF-α水平 取備用血清,ELISA 方法檢測(cè)四組家兔血清中β-catenin、TNF-α 含量,具體操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行；用酶標(biāo)儀在450 nm 測(cè)定光密度值(OD 值),以濃度作為橫坐標(biāo),吸光度值作為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)本的OD 值在坐標(biāo)上找出對(duì)應(yīng)的濃度值,單位用pg/ml表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),方差齊性時(shí)用LSD 法,方差不齊時(shí)用Dunnett T3 法,組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組家兔改良Lequesne MG 評(píng)分比較 模型組、苗藥熏蒸組、苗藥離子導(dǎo)入組家兔第10、20 天的改良Lequesne MG 評(píng)分均高于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；苗藥熏蒸組、苗藥離子導(dǎo)入組家兔第10、20 天的改良Lequesne MG 評(píng)分均低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；苗藥熏蒸組與苗藥離子導(dǎo)入組家兔第10、20 天的改良Lequesne MG 評(píng)分組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。正常對(duì)照組、模型組家兔第20 天的改良Lequesne MG 評(píng)分與本組第10 天比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；苗藥熏蒸組、苗藥離子導(dǎo)入組家兔第20 天的改良Lequesne MG 評(píng)分均低于本組第10 天,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 四組家兔改良Lequesne MG 評(píng)分比較(±s,分)

表1 四組家兔改良Lequesne MG 評(píng)分比較(±s,分)

注：與正常對(duì)照組比較,aP＜0.01；與模型組比較,bP＜0.01；與本組第10 天比較,cP＜0.05

2.2 四組家兔血清β-catenin、TNF-α 水平比較模型組、苗藥熏蒸組、苗藥離子導(dǎo)入組家兔血清β-catenin、TNF-α 水平均高于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；苗藥熏蒸組家兔血清β-catenin、TNF-α 水平均低于模型組,苗藥離子導(dǎo)入組家兔血清β-catenin 水平低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；苗藥離子導(dǎo)入組家兔血清TNF-α 水平與模型組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；苗藥離子導(dǎo)入組家兔血清β-catenin 水平與苗藥熏蒸組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；苗藥離子導(dǎo)入組家兔血清TNF-α 水平高于苗藥熏蒸組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 四組家兔血清β-catenin、TNF-α 水平比較(±s,pg/ml)

表2 四組家兔血清β-catenin、TNF-α 水平比較(±s,pg/ml)

注：與正常對(duì)照組比較,aP＜0.01；與模型組比較,bP＜0.01；與苗藥熏蒸組比較,cP＜0.05

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎是一種以膝關(guān)節(jié)軟骨退行性改變?yōu)椴±硇蕴卣鞯穆赃M(jìn)行性骨關(guān)節(jié)病,主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、僵直、畸形和關(guān)節(jié)功能?chē)?yán)重障礙［6］。隨著我國(guó)社會(huì)人口的老齡化,膝骨關(guān)節(jié)炎因其在老齡人中的高發(fā)病率與危害性成為人類健康的主要問(wèn)題。因此,探討膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的機(jī)制以及尋找一種安全、有效、方便的防治方法,是廣大學(xué)者面臨的重大課題。

膝骨關(guān)節(jié)炎的病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,目前認(rèn)為其發(fā)病中心環(huán)節(jié)是關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變,而Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、增殖、分化、遷移、調(diào)亡及穩(wěn)態(tài)維持方面起著重要作用。β-catenin 是經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路的核心分子,上游分子傳遞的信號(hào)均需通過(guò)β-catenin 才能發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)膝骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織中β-catenin的mRNA 表達(dá)水平均明顯增加,但在未受損傷軟骨中的表達(dá)沒(méi)有升高［7］,而Wnt/β-catenin 的過(guò)度表達(dá)以及β-catenin 的降解減少,都會(huì)引起轉(zhuǎn)錄水平升高進(jìn)而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)合成停止［8］。膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)組織、滑液中均存在促炎細(xì)胞因子,如白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和TNF-α 等［9］。其中TNF-α 是膝骨關(guān)節(jié)炎病理改變過(guò)程中促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨破壞的最重要細(xì)胞因子,能誘導(dǎo)滑膜組織中β-catenin 等因子的分泌,從而促進(jìn)滑膜炎癥的進(jìn)一步發(fā)展［10］,由此說(shuō)明TNF-α 可能通過(guò)Wnt/β-catenin 通路驅(qū)動(dòng)膝骨關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)軟骨退變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,模型組β-catenin、TNF-α 水平顯著升高,與上述研究結(jié)果一致,β-catenin 和TNF-α 均參與了膝骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生和發(fā)展。

膝骨關(guān)節(jié)炎在苗醫(yī)中當(dāng)屬“風(fēng)濕類疾病”中的冷骨風(fēng)、冷肉風(fēng)、濕熱風(fēng)范疇［11］。近幾年的臨床研究表明苗藥外治法治療膝骨關(guān)節(jié)炎有明確的臨床療效,可以減輕或改善患者關(guān)節(jié)疼痛度、關(guān)節(jié)疼痛、晨僵、屈伸不利的癥狀,降低血清炎性指標(biāo)血沉(ESR)、C 反應(yīng)蛋白(CRP)及中醫(yī)證候積分情況［12-14］,可以對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠的痛行為及膝關(guān)節(jié)活動(dòng)有明顯的改善作用,并通過(guò)促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨bcl-2 的表達(dá)和抑制p53、Bax 的表達(dá),從而抑制膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的凋亡,改善軟骨的病變［15,16］。

本研究選用的苗藥驗(yàn)方是貴州苗族人民在長(zhǎng)期與膝骨關(guān)節(jié)炎抗?fàn)幍倪^(guò)程中發(fā)現(xiàn)總結(jié)的苗藥熏蒸常用方,有很高的實(shí)用價(jià)值,但受各種條件的限制,其治療的機(jī)制研究相對(duì)滯后。因此,作者在該苗藥驗(yàn)方熏蒸治療廣泛的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)上,運(yùn)用了離子導(dǎo)入法這種新型的經(jīng)皮給藥方法,觀察苗藥驗(yàn)方對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎模型家兔血清中β-catenin 和TNF-α 的影響,探討苗藥防治骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)該苗藥驗(yàn)方經(jīng)皮給藥能夠改善膝骨關(guān)節(jié)炎家兔模型改良Lequesne MG 評(píng)分,降低膝骨關(guān)節(jié)炎家兔模型血清中Wnt/β-catenin 通路上的核心分子β-catenin、促炎細(xì)胞因子TNF-α 的水平。初步證實(shí)了苗藥驗(yàn)方經(jīng)皮給藥能夠通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin 通路,減輕膝骨關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng),從而改善膝骨關(guān)節(jié)炎癥狀,延緩軟骨細(xì)胞的損傷,本研究為苗藥驗(yàn)方經(jīng)皮給藥的進(jìn)一步臨床推廣應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。