李海，任虎綜述，張燕，許文波，2審校

1.國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)醫(yī)學(xué)病毒和病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所世界衛(wèi)生組織西太平洋地區(qū)麻疹／風(fēng)疹參比實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.中國(guó)科學(xué)院生物安全大科學(xué)研究中心，湖北 武漢 430000

人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus，hRSV）是肺病毒科（Pneumoviridae）正肺病毒屬（Orthopneumovirus）中唯一感染人的病毒，因此也稱為人正肺病毒［1］。hRSV通過(guò)直接接觸和飛沫傳播，是引起5歲以下兒童急性下呼吸道感染的首要病原［2］。2歲以下嬰幼兒幾乎均感染過(guò)hRSV，常引起下呼吸道感染［3］。hRSV全球流行病學(xué)監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)顯示，2015年約320萬(wàn)名5歲以下兒童因感染hRSV住院，導(dǎo)致約59 600名患兒死亡，其中包括27 300名小于6個(gè)月的嬰兒［4］。hRSV在老年人中同樣具有較高的發(fā)病率及死亡率［5］。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年因hRSV感染產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)高于800億美元，但尚無(wú)有效的藥物和疫苗，目前僅帕麗珠單克隆抗體（Palivizumab，Synagis?）可預(yù)防早產(chǎn)兒和免疫低下兒童感染hRSV，但尚未引進(jìn)國(guó)內(nèi)進(jìn)行臨床應(yīng)用。近幾年hRSV抗體藥物ALX-0171［6］、Nirsevimab［7］和MK-1654［8］等在臨床試驗(yàn)中展現(xiàn)出了良好的效果。hRSV疫苗的研發(fā)同樣具有極大的商業(yè)價(jià)值和社會(huì)效益，WHO將hRSV疫苗列為全球最優(yōu)先研發(fā)的疫苗之一［9］。

2013年融合前F蛋白（prefusion F protein，Pre-F）構(gòu)象解析后，以Pre-F為基礎(chǔ)的hRSV疫苗研發(fā)項(xiàng)目大量出現(xiàn)，本文就hRSV疫苗研發(fā)面臨的挑戰(zhàn)以及最新研究進(jìn)展作一綜述。

1 疫苗研發(fā)面臨的挑戰(zhàn)

自hRSV被發(fā)現(xiàn)以來(lái)［10］，科研人員對(duì)hRSV疫苗進(jìn)行了60多年的研發(fā)，至今仍無(wú)商品化的疫苗，疫苗研發(fā)過(guò)程困難重重，挑戰(zhàn)巨大［11］。hRSV疫苗一直以臨床試驗(yàn)失敗率高而著稱，目前已有7種進(jìn)入臨床試驗(yàn)的hRSV疫苗宣布“失敗”，見(jiàn)表1。其中滅活疫苗FI-RSV［12］、亞單位疫苗BBG2Na［13］和載體疫苗MEDI-534［14］由于安全性原因被叫停，其他4種疫苗（顆粒疫苗ResVax［15］和SynGEM［16］以及亞單位疫苗PFP［17］和MEDI-7510［18］）保護(hù)效果不足，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體中和活性較低。除此之外，很多因素和困難制約著疫苗的研發(fā)。hRSV缺乏理想的動(dòng)物感染模型［19］，很難開(kāi)發(fā)出一種同時(shí)適用于孕婦、兒童和老年人［20］的疫苗。

表1 臨床試驗(yàn)失敗的hRSV疫苗Tab.1 The hRSV vaccines failed in clinical trials

1.1 F蛋白構(gòu)象的轉(zhuǎn)變F蛋白包含信號(hào)肽（aa 2～20）、信號(hào)肽切割位點(diǎn)（aa 21～25）、F2區(qū)（aa 26～109）、多肽裂解區(qū)（aa 110～136）和F1區(qū)（aa 137～574）［21］，F(xiàn)蛋白高度保守，以三聚體形式存在，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體對(duì)A和B 2個(gè)血清亞型均有中和作用［22］，包含Pre-F（長(zhǎng)約16 nm）和Post-F（長(zhǎng)約11 nm）2種構(gòu)象。Pre-F是一種亞穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，當(dāng)病毒與細(xì)胞發(fā)生融合后，Pre-F轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的Post-F［23］，在Pre-F中均具有目前鑒定的6種抗原表位（siteⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和?），但Post-F僅具有4種抗原表位（siteⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ）［24］。2013年，MCLELLAN等［25］對(duì)F蛋白進(jìn)行優(yōu)化改造，獲得了穩(wěn)定的Pre-F，并發(fā)現(xiàn)了新的中和抗體表位?，Pre-F特有的抗原表位?產(chǎn)生中和抗體的活性最強(qiáng)，較針對(duì)其他表位產(chǎn)生的抗體中和活性高幾十倍［26］，該成果被評(píng)為2013年度科學(xué)十大進(jìn)展之一。針對(duì)該表位的預(yù)防性單克隆抗體藥物Nirsevimab已經(jīng)進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)［27］。而2013年前，hRSV疫苗均是針對(duì)Post-F設(shè)計(jì)研發(fā)的，這或許解釋了疫苗失敗的原因。

MedImmune公司研制的亞單位疫苗MEDI-7510對(duì)60歲以上老年人進(jìn)行了Ⅰ期臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該疫苗具有良好的安全性［28］，但Post-F構(gòu)象誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體滴度較低，不能保護(hù)老年人免受hRSV感染［18］。純化的F蛋白（purified fusion protein，PFP）是冷傳代的hRSV A2毒株通過(guò)離子交換純化獲得，PFP-3的F蛋白占病毒總蛋白的95%以上，在兒童中能夠激活高滴度的中和抗體［17］。但PFP產(chǎn)量低，不能滿足市場(chǎng)需要，且F蛋白的構(gòu)象不能保證。長(zhǎng)春百克生物科技股份公司與荷蘭Mucosis B.V.公司合作開(kāi)發(fā)的細(xì)菌樣顆粒疫苗SynGEM，經(jīng)滴鼻途徑免疫小鼠和棉鼠，在鼻內(nèi)可生成sIgA，但血清中產(chǎn)生的中和抗體滴度低于FI-RSV疫苗［29-30］。該疫苗在英國(guó)開(kāi)展的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，滴鼻免疫后志愿者體內(nèi)未產(chǎn)生針對(duì)表位?的中和抗體，證明該疫苗中F蛋白處于融合后構(gòu)象［16］。

其中最遺憾的是諾瓦瓦科斯（Novavax）研制的顆粒疫苗ResVax［15］，也是目前唯一進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)的hRSV疫苗，該疫苗在臨床前和Ⅱ期臨床試驗(yàn)中均具有良好的安全性和免疫效果［31-34］。2016年，在1.2萬(wàn)名60歲以上老年人的Ⅲ期臨床試驗(yàn)中保護(hù)效果不佳，宣布失敗。2019年2月，于4 000多名孕婦中開(kāi)展的Ⅲ期臨床試驗(yàn)，未能達(dá)到設(shè)定的主要終點(diǎn)指標(biāo)，對(duì)嬰兒保護(hù)效力不佳［35］。

這4種疫苗失敗的主要原因是疫苗開(kāi)始研發(fā)時(shí)間較早（2013年前），Pre-F蛋白結(jié)構(gòu)尚未解析，均是基于Post-F蛋白設(shè)計(jì)的疫苗，誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體滴度低，不足以抵抗hRSV感染。

1.2 安全性不足 疫苗的安全性直接關(guān)系人類健康，因此必須保證疫苗沒(méi)有致病性和接種后異常反應(yīng)。目前有3種hRSV疫苗的臨床試驗(yàn)由于安全性原因被叫停：福爾馬林滅活疫苗（formalin-inactivated RSV，F(xiàn)I-RSV）接種后引起呼吸道疾病增強(qiáng)作用（enhanced respiratory disease，ERD）［36］；亞單位疫苗BBG2Na誘發(fā)接種者出現(xiàn)Ⅲ型超敏反應(yīng)；載體疫苗MEDI-534免疫原性較弱，遺傳性狀不穩(wěn)定。

上世紀(jì)60年代，接種FI-RSV疫苗的兒童再次感染hRSV，疫苗不僅不能產(chǎn)生保護(hù)效果，反而加重接種者病情，導(dǎo)致80%接種者入院并造成2名兒童死亡［12］。后來(lái)的研究證明，F(xiàn)I-RSV誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量CD4+T細(xì)胞、Th2類細(xì)胞因子和嗜酸性粒細(xì)胞，而CD8+T細(xì)胞和Th1類細(xì)胞因子相對(duì)減少，引起機(jī)體免疫系統(tǒng)失衡（偏向Th2類免疫應(yīng)答）［36］。FI-RSV病毒顆粒表面的F蛋白均處于融合后構(gòu)象，因此誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體滴度較低，不但不能中和hRSV反而形成大量的免疫復(fù)合物沉淀，引起過(guò)敏性炎癥。也有研究報(bào)道hRSV感染可能含有類似于登革病毒引起的抗體依賴性增強(qiáng)作用（antibody-dependent enhancement，ADE）［37］。

通?；陴じ降鞍譍設(shè)計(jì)的亞單位疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生偏向Th2類的免疫應(yīng)答［38］，亞單位疫苗BBG-2Na由鏈球菌白蛋白結(jié)合域（binding region，BB）和蛋白G核心保守區(qū)（G protein fragment，G2Na）組成［39］，在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，有一部分接種者出現(xiàn)Ⅲ型超敏反應(yīng)［13］。

MedImmune公司研制的載體疫苗MEDI-534，以人／牛副流感重組嵌合病毒為載體，在病毒表面表達(dá)hRSV F蛋白［14］，Ⅰ期臨床試驗(yàn)在半歲至2歲的嬰幼兒中進(jìn)行，結(jié)果顯示其具有良好的安全性和兼容性，但免疫原性較弱，基因組不穩(wěn)定，會(huì)導(dǎo)致鼻塞等副作用，因此該疫苗僅進(jìn)行了Ⅰ期臨床試驗(yàn)［40］。這些接種后異常反應(yīng)使得臨床試驗(yàn)無(wú)法繼續(xù)開(kāi)展。

1.3 免疫人群不同hRSV疫苗免疫人群包含孕婦、兒童和老年人，這3種人群體內(nèi)特異性抗體水平、免疫系統(tǒng)成熟程度不同，因此很難開(kāi)發(fā)出同時(shí)適用于3種人群的疫苗。嬰幼兒免疫系統(tǒng)尚未成熟，體內(nèi)母源抗體水平不同，對(duì)該年齡段嬰幼兒進(jìn)行免疫時(shí)須格外小心?？赏ㄟ^(guò)免疫孕婦來(lái)保護(hù)分娩后的嬰幼兒，通過(guò)胎盤(pán)傳遞的hRSV中和抗體在嬰兒體內(nèi)的半衰期為月1個(gè)月，在此期間可阻擋hRSV感染［41］。研究表明，對(duì)未接觸過(guò)hRSV的嬰幼兒應(yīng)避免使用非復(fù)制型疫苗（亞單位疫苗或滅活疫苗），盡量使用減毒活疫苗［42］。

老年人已經(jīng)多次自然感染過(guò)hRSV，減毒活疫苗很難誘導(dǎo)產(chǎn)生理想的保護(hù)效果，激發(fā)的免疫反應(yīng)不足以阻止再次感染hRSV［20］，對(duì)該人群可使用亞單位疫苗。因此顆粒疫苗和亞單位疫苗傾向用于孕婦和老年人，減毒疫苗和載體疫苗傾向用于嬰幼兒［43］。

1.4 缺乏理想的動(dòng)物模型 理想感染模型的缺乏也是疫苗發(fā)展和致病機(jī)理研究的主要障礙，小鼠對(duì)hRSV感染有較強(qiáng)抵抗力，不像人類那樣被廣泛感染，小鼠需高滴度的病毒才能引起肺臟病理變化。盡管有這些限制，但相對(duì)較低的成本和易操作等優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致目前最常用的動(dòng)物模型仍是BALB／c小鼠［44］。棉鼠比BALB／c小鼠更易被hRSV感染，與人類感染hRSV非常相似，病毒在下呼吸道的復(fù)制主要局限于細(xì)支氣管上皮，可反復(fù)感染hRSV，但不能完全模擬人體hRSV的感染［45］。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)商品化的棉鼠，因此，hRSV疫苗的臨床前試驗(yàn)均是在BALB／c小鼠中進(jìn)行的。

hRSV感染不同周齡的小鼠可引起不同的臨床癥狀，周齡較大的小鼠癥狀更明顯，肺臟組織病理變化更嚴(yán)重［46］。幼鼠對(duì)hRSV亞單位疫苗的免疫應(yīng)答反應(yīng)（中和抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答）要優(yōu)于老年小鼠［47］。

非洲綠猴和食蟹猴等靈長(zhǎng)類動(dòng)物免疫FI-RSV疫苗可導(dǎo)致與人類ERD非常相似的病理變化，通常在肺臟和支氣管組織內(nèi)含有淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和多形核細(xì)胞的嚴(yán)重浸潤(rùn)。但通常情況下，每個(gè)鼻孔需注射幾毫升高滴度病毒，有時(shí)需要?dú)夤軆?nèi)注射，因此并不能真實(shí)反映人體的傳播類型［19］。

2 處于臨床試驗(yàn)階段的hRSV疫苗

2013年P(guān)re-F結(jié)構(gòu)的成功解析為hRSV疫苗的研發(fā)提供了新的靶點(diǎn)，疫苗研發(fā)策略和種類迅速增多。截至2021年1月，文獻(xiàn)報(bào)道的處于臨床試驗(yàn)的hRSV疫苗共16種（5種亞單位疫苗、6種載體疫苗、1種顆粒疫苗、4種減毒活疫苗），其中進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)的疫苗共6種，絕大多數(shù)是基于Pre-F設(shè)計(jì)的（見(jiàn)表2）。

表2 處于臨床試驗(yàn)階段的hRSV疫苗Tab.2 The hRSV vaccines in clinical trials

2.1 亞單位疫苗 目前認(rèn)為以Pre-F為基礎(chǔ)的亞單位疫苗是最有潛力的候選疫苗，科研人員在各種表達(dá)系統(tǒng)中均有嘗試，包括哺乳細(xì)胞、酵母和大腸埃希菌等。GSK公司研發(fā)人員通過(guò)F蛋白氨基酸的突變和缺失，在C-末端加入GCN4序列，改造的蛋白疫苗Pre-F-GCN4t處于融合前構(gòu)象，在CHO細(xì)胞系中表達(dá)純化后以三聚體形式存在。Pre-F-GCN4t是針對(duì)孕婦和老年人設(shè)計(jì)的，對(duì)孕婦進(jìn)行免疫接種可通過(guò)胎盤(pán)轉(zhuǎn)移中和抗體為新生兒提供被動(dòng)保護(hù)。對(duì)128位18～44歲的健康男性單次肌肉注射60 μg疫苗Pre-F-GCN4t，在免疫60 d后中和抗體滴度增加3.2～4.9倍，但在第180天抗體滴度下降，實(shí)驗(yàn)中鋁佐劑并未起到增強(qiáng)免疫應(yīng)答的效果［48］。在18～45歲非妊娠女性中開(kāi)展的Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，免疫60 μg抗原后第30天，中和抗體滴度增加3.1～3.9倍，安全性與百白破疫苗相似。后期在400名18～45歲的非妊娠女性中開(kāi)展的Ⅱ期臨床試驗(yàn)未使用鋁佐劑，同樣具有良好的安全性和保護(hù)效果［49］。

McLellan博士基于結(jié)構(gòu)生物學(xué)，在2013年率先解析了Pre-F的結(jié)構(gòu)，對(duì)F蛋白（1～513氨基酸）進(jìn)行改造，將155和290位點(diǎn)的絲氨酸替換為半胱氨酸（S155C和S290C，DS）增加1對(duì)二硫鍵，在190和207位點(diǎn)替換2個(gè)疏水氨基酸（S190F和V207L，Cav1），使抗原位點(diǎn)?更穩(wěn)定，在C-末端增加T4噬菌體的三聚體基序（foldon，F(xiàn)d）［50］，為防止玫瑰花結(jié)的形成，對(duì)融合肽上的9個(gè)氨基酸（位點(diǎn)137～146）進(jìn)行缺失［51］。改造后的F蛋白稱為DS-Cav1，親和層析純化后用凝血酶將His標(biāo)簽切除。DS-Cav1含有穩(wěn)定的抗原位點(diǎn)?，以穩(wěn)定的三聚體形式存在。DS-Cav1免疫小鼠和獼猴可產(chǎn)生高滴度的中和抗體，2019年在18～50歲成年人中進(jìn)行的臨床試驗(yàn)也同樣產(chǎn)生了令人驚喜的效果：?jiǎn)未渭∪庾⑸浜竺庖呓M的中和抗體提高10倍以上，且抗體水平可維持3個(gè)月［52］。

輝瑞公司基于Pre-F開(kāi)發(fā)了新型hRSV亞單位疫苗。目前Ⅱ期臨床試驗(yàn)（18～49和50～85歲）已經(jīng)結(jié)束，不同劑量組誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體水平相當(dāng)，抗原方面無(wú)劑量依賴性，臨床結(jié)果于2019年hRSV疫苗世界大會(huì)上公布。

復(fù)旦大學(xué)王賓教授領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)的基于G蛋白（原核表達(dá)）的hRSV疫苗BARS13，能夠利用環(huán)孢素A佐劑實(shí)現(xiàn)對(duì)Treg細(xì)胞調(diào)控，可對(duì)G蛋白引起的炎癥反應(yīng)進(jìn)行有效控制，增加疫苗的安全性［53］。與艾棣維欣生物制藥有限公司（Advaccine）聯(lián)合在澳大利亞開(kāi)展的Ⅰ期臨床試驗(yàn)（60個(gè)健康成年）呈現(xiàn)出較好的應(yīng)用潛力，這是國(guó)內(nèi)研發(fā)的唯一進(jìn)入臨床試驗(yàn)的hRSV疫苗。

小疏水（small hydrophobic，SH）蛋白是一種跨膜糖蛋白，被感染的細(xì)胞在細(xì)胞膜表面大量表達(dá)SH蛋白，針對(duì)SH蛋白胞外結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)的亞單位疫苗可顯著降低小鼠或棉鼠肺臟中的病毒滴度［54］。在50～64歲健康人群中開(kāi)展了Ⅰ期臨床試驗(yàn)，2次肌肉注射顯示該疫苗具有較好的安全性和免疫原性［55］。

2.2 病毒載體疫苗 目前已經(jīng)有多種病毒載體被用于hRSV疫苗，其中進(jìn)入臨床試驗(yàn)的病毒載體包括腺病毒載體、修飾的痘苗安卡拉病毒（modified vaccine Ankara，MVA）載體和仙臺(tái)病毒（sendai virus，SeV）載體。將hRSV F、N和M2-1蛋白在黑猩猩腺病毒（PanAd3）和MVA載體中表達(dá)，滴鼻及肌注免疫小鼠和獼猴均能產(chǎn)生保護(hù)效果［56］。在18～50歲健康成年人中進(jìn)行的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，組合疫苗（PanAd3-RSV和MVA-RSV）具有良好的安全性、有效性和兼容性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。該組合疫苗同樣可誘導(dǎo)60～75歲健康老年人產(chǎn)生特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答［57］。

SAMY等［58］研發(fā)的病毒載體MVA-BN感染細(xì)胞后可進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，但不會(huì)形成子代病毒。應(yīng)用該載體編碼hRSV的結(jié)構(gòu)蛋白F和G，以及非結(jié)構(gòu)蛋白N和M2，形成新型疫苗MVA-BN-RSV。在安全性和免疫原性方面，Ⅰ期臨床試驗(yàn)中未觀察到成人（18～49歲）和老年人（50～65歲）之間的差異，均能誘導(dǎo)廣泛的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。在55歲以上的成年人中開(kāi)展的Ⅱ期臨床試驗(yàn)，MVA-BNRSV誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)持續(xù)6個(gè)月，但中和抗體增加的倍數(shù)較低［59］。

楊森（Janssen）公司應(yīng)用腺病毒載體（Advac?）開(kāi)發(fā)了一種hRSV候選疫苗，該疫苗應(yīng)用人腺病毒26和35型載體（Ad26和Ad35）表達(dá)F蛋白，肌肉注射免疫棉鼠或獼猴均可誘導(dǎo)持久的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答［59］。應(yīng)用Ad26載體表達(dá)Pre-F，獲得疫苗Ad26.RSV.pre-F，Ⅱ期臨床試驗(yàn)（60歲以上老年人）中與流感疫苗聯(lián)合使用，顯示該疫苗具有良好的安全性，免疫28 d后hRSV中和抗體滴度增加約2.5倍［63］。

GSK公司利用病毒載體ChAd155表達(dá)F、N和M2-1蛋白，獲得載體疫苗ChAd155-RSV。在hRSV血清陽(yáng)性的成年人（18～45歲）中，免疫ChAd155-RSV后60 d，血清中和抗體滴度增加2.3倍，并具有良好的安全性，已經(jīng)開(kāi)展針對(duì)血清陰性嬰幼兒的Ⅲ期臨床試驗(yàn)［72］。

Vaxart公司研發(fā)的口服疫苗，應(yīng)用非復(fù)制型Ad5表達(dá)F蛋白，該疫苗聯(lián)合Toll樣受體（TLR）佐劑已完成Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT02830932），但目前有關(guān)該疫苗的臨床試驗(yàn)結(jié)果尚未有公開(kāi)的報(bào)告［65］。

應(yīng)用反向遺傳技術(shù)將hRSVF基因插入至仙臺(tái)病毒F和HN基因之間構(gòu)建hRSV病毒載體疫苗SeVRSV，滴鼻免疫非洲綠猴可產(chǎn)生良好的保護(hù)效果。在血清陽(yáng)性的棉鼠中SeVRSV誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答可有效預(yù)防RSV感染［73］。臨床試驗(yàn)中對(duì)17名健康成人鼻內(nèi)接種SeVRSV，由于成人對(duì)hPIV-1和hRSV已有預(yù)存抗體，因此SeVRSV核酸存在的時(shí)間較短，引起的抗體反應(yīng)也較小。SeVRSV的目標(biāo)人群是嬰幼兒，未來(lái)臨床試驗(yàn)應(yīng)該在血清陰性兒童中進(jìn)行［66］。

2.3 減毒活疫苗和顆粒疫苗 自20世紀(jì)60年代滅活疫苗的臨床試驗(yàn)失敗后，科學(xué)家開(kāi)始注重減毒活疫苗的研發(fā)，早期應(yīng)用傳統(tǒng)的病毒減毒技術(shù)篩選溫度敏感型減毒疫苗，包括冷傳代和化學(xué)誘變技術(shù)，近年來(lái)反向遺傳技術(shù)應(yīng)用越來(lái)越廣泛。減毒活疫苗可通過(guò)滴鼻免疫嬰幼兒，不受血液中母?jìng)骺贵w的影響，并能激活黏膜免疫，但疫苗使用過(guò)程中存在毒力恢復(fù)的風(fēng)險(xiǎn)，如果病毒復(fù)制能力過(guò)度減少可使其免疫原性喪失，因此研發(fā)過(guò)程必須兼顧疫苗的安全性和免疫原性。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，目前已有多種減毒活疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

美國(guó)NIH和Med-Immune公司研發(fā)了一系列的hRSV減毒活疫苗，cpts248／955減毒活疫苗在嬰幼兒的臨床試驗(yàn)中顯示出安全方面的問(wèn)題，病毒減毒效果較差；cpts248／404減毒活疫苗在臨床試驗(yàn)中毒力較低，但引起了部分嬰幼兒的鼻塞。研發(fā)人員應(yīng)用反向遺傳學(xué)技術(shù)繼續(xù)對(duì)cpts248／404疫苗進(jìn)行基因改造，制備的重組減毒活疫苗rA2cp248／404／1030ΔSH（剔除SH基因，并在L基因1030位引入點(diǎn)突變），臨床試驗(yàn)（44名1～2個(gè)月的hRSV血清陰性的嬰兒）顯示安全性良好［61］，但誘導(dǎo)中和抗體能力有限，之后對(duì)其進(jìn)行39個(gè)核苷酸替換，獲得的減毒疫苗命名為MEDI-559［74］，在血清陰性嬰幼兒（5～24個(gè)月）中開(kāi)展臨床試驗(yàn)，顯示免疫原性和安全性良好［75］。但MEDI-559減毒株的248或1030位點(diǎn)易發(fā)生回復(fù)突變，為了使MEDI-559更穩(wěn)定，對(duì)其5個(gè)核苷酸和1個(gè)氨基酸進(jìn)行替換獲得新型疫苗hRSVcps2，臨床試驗(yàn)（6～24個(gè)月）顯示出良好的安全性和較好的免疫原性，且提高了遺傳穩(wěn)定性［69］。

將MEDI-559毒株的NS2基因和1313位點(diǎn)氨基酸缺失，將1314位點(diǎn)的異亮氨基酸替換為亮氨酸形成減毒活疫苗hRSVΔNS2／Δ1313／I1314L，該疫苗是一種溫度敏感型毒株，在黑猩猩體內(nèi)復(fù)制能力顯著減弱，在hRSV血清陽(yáng)性兒童（12～59個(gè)月）中安全性和有效性良好［68］。

缺失M2-2基因獲得MEDIΔM2-2減毒活疫苗，該疫苗可下調(diào)病毒RNA復(fù)制，上調(diào)基因轉(zhuǎn)錄和抗原合成，從而增加保護(hù)性抗原的表達(dá)量，但在hRSV血清陰性兒童體內(nèi)MEDI△M2-2在復(fù)制上受到高度限制［76］。為提高減毒疫苗復(fù)制水平，對(duì)篩選的另一株hRSV A2病毒進(jìn)行M2-2基因的剔除，制備減毒疫苗LIDΔM2-2，在嬰幼兒（6～24個(gè)月）中的臨床試驗(yàn)顯示安全性和免疫原性良好［67］。

2016年，埃默里大學(xué)STOBART等［70］通過(guò)基因替換和缺失以及密碼子去優(yōu)化等方法研制的減毒疫苗株OE4：hRSV-A2-dNS1-dNS2-△SH-dGm-Gsnullline19F，病毒高度減毒但免疫原性保持不變，形成的病毒粒子與野毒株相似，具有遺傳穩(wěn)定性，棉鼠試驗(yàn)中免疫效果和安全性優(yōu)于滅活疫苗。生物技術(shù)公司Meissa Vaccines獲得埃默里大學(xué)的技術(shù)授權(quán)，目前正在進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)。

以卡介苗為骨架表達(dá)hRSV N蛋白形成GMP rBCG-N-hRSV顆粒疫苗，單次低劑量的GMP rBCG-N-hRSV可誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答保護(hù)小鼠免受hRSV感染［71］，在人群中開(kāi)展的Ⅰ期臨床試驗(yàn)產(chǎn)生良好的保護(hù)效果。

3 hRSV疫苗展望

自然感染hRSV不能產(chǎn)生持久免疫力，易反復(fù)感染，成年人即使體內(nèi)含有較高濃度的hRSV特異性抗體，仍然可以反復(fù)感染hRSV，由于hRSV自然感染后抗體中和活性較低，僅能引起短暫的部分免疫保護(hù)，不足以抵抗下一次hRSV感染，因此，即使獲得安全性和有效性均較高的hRSV疫苗，能否預(yù)防嬰幼兒和老年人反復(fù)感染仍需繼續(xù)探討。

雖然目前尚無(wú)上市的hRSV疫苗，但隨著分子病毒學(xué)、免疫學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展，hRSV感染的免疫學(xué)機(jī)理和hRSV分子特征越來(lái)越清晰，F(xiàn)蛋白的表位及其免疫原性也均取得了顯著進(jìn)展。相信在未來(lái)數(shù)年內(nèi)，hRSV疫苗研發(fā)領(lǐng)域會(huì)有較大突破。hRSV疫苗未來(lái)上市后，市場(chǎng)空間值得期待。