HPLC法測(cè)定紫菀根、莖、花中紫菀酮含量研究

張立秋，張?jiān)鼋?，王秀春，楊帆，薛長(zhǎng)松*

（1.通化師范學(xué)院，通化 134002；2.通化市園藝研究所，通化 134002；3.通化縣水洞林業(yè)有限公司，通化 134002）

紫菀為菊科多年生草本植物，又名青菀、“小辮子”、還魂草[1,2]。主要產(chǎn)于黑龍江、吉林、遼寧、甘肅、山西、陜西等地[3,4]。紫菀中含有山柰酚、紫菀酮、槲皮素、異鼠李素和綠原酸等成分，具有很高的藥用價(jià)值，其中紫菀酮，有止咳、平喘、潤(rùn)肺、祛痰、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、消炎等方面的功效[5,6]。近些年來(lái)，紫菀酮成分得到了廣泛的開(kāi)發(fā)利用，謝文娟[7]等研究紫菀酮對(duì)去泛素化酶2活性的抑制作用。林紅[8]等研究的小兒止咳平喘口服液也有紫菀酮的參與。王芳[9]等的研究表明紫菀酮會(huì)抑制脂多糖誘導(dǎo)的一種巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞的幾種因子的釋放，具有體外抗炎作用。紫菀酮的最新研究中，鮮恩英[10]等研究表明紫菀酮對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。

目前對(duì)紫菀中紫菀酮的提取方法的研究主要有，程存歸[11]等研究的微波輔助加壓溶劑提取研究；莫尚志[12]等研究了超臨界CO2萃取法；毛秋蘭[13]研究了乙醇回流提取。根據(jù)實(shí)際條件考慮，由于紫菀酮無(wú)紫外吸收，早期采用薄層掃描法檢測(cè)，但薄層掃描法系統(tǒng)誤差較大[14]。國(guó)內(nèi)對(duì)于紫菀酮成分的檢測(cè)，現(xiàn)多使用高效液相色譜法[15-18]。國(guó)內(nèi)其他同領(lǐng)域的研究中，有將紫菀植株分為根、根狀莖、蘆頭、葉片、葉柄來(lái)檢測(cè)紫菀酮含量。夏成凱[19]等將紫菀植株分為根、母根、根莖分別檢測(cè)。國(guó)外的相關(guān)研究中，把紫菀進(jìn)行粗制、醋制、蜜制和蒸制來(lái)研究其中的多種成分含量變化[20]。目前未查到將紫菀植株按照根、莖、花進(jìn)行紫菀酮含量測(cè)定研究的。本試驗(yàn)參照2020版中國(guó)藥典的甲醇超聲提取方法[21]，采用高效液相色譜法（HPLC）將紫菀植株分為根、莖、花三部分進(jìn)行紫菀酮含量檢測(cè)，為更好地利用紫菀中紫菀酮成分，提高藥材對(duì)于紫菀酮的利用率提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料、儀器和試劑

1.1.1 材料

紫菀（采自長(zhǎng)白山區(qū)通化師范學(xué)院周邊，經(jīng)通化師范學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院于俊林教授鑒定為菊科紫菀屬多年生草本植物）。

1.1.2 儀器

試驗(yàn)所涉及的儀器設(shè)備，詳見(jiàn)表1。

表1中電子天平：感量0.01mg和感量0.1mg兩種；移液槍：選擇規(guī)格為1-10μL/100-1000μL/20-200μL三種；超聲機(jī)：選擇功率為250W，頻率40kHz的規(guī)格。

1.1.3 試劑

試驗(yàn)研究所涉及的試劑，詳見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)所用試劑清單

其中乙腈必須為色譜純級(jí)別；紫菀酮標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)號(hào)為B21703-20mg。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的前處理

紫菀全植株采集后，進(jìn)行清洗，分開(kāi)根、莖、花三個(gè)部位，晾干，經(jīng)中藥粉碎機(jī)粉碎，過(guò)三號(hào)篩，將粉末密封好備用。

1.2.2 色譜條件

本試驗(yàn)參照2020版《中國(guó)藥典》中測(cè)紫菀中紫菀酮的方法，詳見(jiàn)表3[21]。

表3 色譜條件

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

將紫菀酮標(biāo)準(zhǔn)品精密稱定約10mg置于10mL容量瓶中，加入少量乙腈使標(biāo)準(zhǔn)品溶解，再用乙腈定容至刻度，搖勻，配制成約1mg/mL的紫菀酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用乙腈分別稀釋成0.1、0.5、1、5、10、100、550μg/mL的濃度梯度，分別過(guò)0.45μm的濾膜，待測(cè)，臨用時(shí)現(xiàn)稀釋。

1.2.4 樣品溶液的制備

參照2020年《中國(guó)藥典》一部中紫菀提取方法[21]，分別將制備好的根、莖、花的樣品用十萬(wàn)分之一天平精密稱取各約3g，分別置于具塞錐形瓶中，各精密加入甲醇20mL，分別稱定重量，放入40℃恒溫溫浸1小時(shí)，再超聲處理（功率250W，頻率40kHz)15分鐘，取出，冷卻至室溫，再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液過(guò)0.45μm濾膜即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 重復(fù)性試驗(yàn)

紫菀酮100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液精密吸取20μL進(jìn)行測(cè)定，同一色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算色譜峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%值，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

由表4得出，6次平行測(cè)定色譜峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.53%，表明儀器系統(tǒng)重復(fù)性較好，滿足檢測(cè)需要。

2.2 線性關(guān)系考察

按照1.2.2中色譜條件進(jìn)行測(cè)定，將不同濃度標(biāo)紫菀酮準(zhǔn)品溶液分別吸取20μL進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)（x軸），以色峰面積作縱坐標(biāo)（y軸），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 紫菀酮標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

由圖1可知，不同濃度紫菀酮標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得結(jié)果，線性回歸方程為y=24584.32x-9013.67，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，結(jié)果表明紫菀酮在0.1～550μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 定性分析試驗(yàn)

將流動(dòng)相，標(biāo)準(zhǔn)品，跟、莖、花樣品溶液分別按照上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)紫菀酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液保留時(shí)間判斷根、莖、花樣品中是否檢測(cè)出紫菀酮成分，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 紫菀標(biāo)準(zhǔn)品與流動(dòng)相的色譜圖

由圖2可得，紫菀酮標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間為30.620min，15min前后的色譜峰是流動(dòng)相本身所具有的，根部保留時(shí)間為30.276min，莖部保留時(shí)間為30.325min，花部保留時(shí)間為30.611min。理論塔板數(shù)均達(dá)到15000以上。所以判定紫菀根、莖、花中均檢出紫菀酮成分。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

選擇紫菀根部樣品溶液，精密吸取20μL，分別于提取后0、4、8、16、24、30h進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)不同時(shí)間色譜峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%值，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，不同時(shí)間測(cè)得紫菀酮色譜峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.56%，表明樣品溶液在30h內(nèi)較穩(wěn)定，滿足檢測(cè)需要。

2.5 樣品中紫菀酮含量測(cè)定

將紫菀根、莖、花的樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品質(zhì)量計(jì)算紫菀酮含量，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 單位樣品紫菀酮含量

由表6可知，紫菀根部紫菀酮含量為1372.85μg/g，莖部為14.94μg/g，花中為16.42μg/g，結(jié)果表明，紫菀根中紫菀酮含量較多，莖和花中相對(duì)較少。

2.6 精密度試驗(yàn)

取紫菀酮根部樣品5份，按照上述方法進(jìn)行提取，相同色譜條件進(jìn)樣20μL進(jìn)行平行試驗(yàn)，將檢測(cè)結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品質(zhì)量分別計(jì)算每份樣品測(cè)定結(jié)果，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表7可知，5次平行試驗(yàn)測(cè)得紫菀酮含量結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.46%，表明試驗(yàn)的精密度良好。

2.7 檢出限試驗(yàn)

將紫菀酮標(biāo)準(zhǔn)品逐級(jí)稀釋成不同濃度進(jìn)行檢測(cè)，信號(hào)和噪聲的比值大于10時(shí)，確定紫菀酮的檢出限。結(jié)果確定紫菀酮的檢出限為0.03μg/mL。

2.8 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密稱取樣品約3g，共取5份，分別加入0.5mg/mL紫菀酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液1mL，按照1.2.4中的方法制成樣品品溶液，按1.2.2中色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)質(zhì)量計(jì)算含量，再計(jì)算平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 加標(biāo)回收率結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)品平均回收率為101.02%，RSD值為0.70%。表明試驗(yàn)回收率非常好，滿足測(cè)定需要。

3 結(jié)論

本課題采用高效液相色譜法測(cè)定長(zhǎng)白山地區(qū)紫菀中根、莖、花中紫菀酮含量，方法提取快、靈活簡(jiǎn)便、重復(fù)性良好、檢出限低、精密度良好、樣品溶液比較穩(wěn)定、理論塔板數(shù)達(dá)到了15000以上。測(cè)得紫菀中各部位紫菀酮含量，根部為1372.85μg/g，莖部為14.94μg/g，花中為16.42μg/g。研究結(jié)果表明，紫菀酮大量集中在紫菀的根部，莖和花中含量較少，建議利用紫菀中紫菀酮成分時(shí)，使用根部提取較為高效。此研究結(jié)果可為紫菀中紫菀酮的研究與應(yīng)用提供一定參考。