東北牛防風(fēng)果實(shí)精油生物活性研究

蔡馨瑤，潘紅陽，于旺，胡馨殊，劉雪蓮

（通化師范學(xué)院·吉林通化·134002）

植物精油屬于植物體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)，是一類可隨水蒸氣蒸餾，具有一定芳香氣味并且能在常溫下?lián)]發(fā)的油狀物質(zhì)的總稱。植物學(xué)上稱為精油，商業(yè)上則稱芳香油，而化學(xué)和醫(yī)藥學(xué)上稱揮發(fā)油，許多研究表明植物精油具有抗氧化活性和抑菌活性，在日化、飼料等多個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1-10]。植物精油作為天然抗氧化劑和抑菌劑，具有安全、高效等優(yōu)點(diǎn)，具有巨大的開發(fā)潛力和廣闊的應(yīng)用前景。

東北牛防風(fēng)（Heracleum moellendorffii）是傘形科多年生草本植物，又叫老山芹、土當(dāng)歸、山芹菜等，全株具有揮發(fā)油，生長(zhǎng)于中高緯度河岸濕草地、草甸子、山坡林下及山地混雜林緣等陰濕環(huán)境，為藥食同源植物[11-12]。東北牛防風(fēng)富含氨基酸及膳食纖維，可幫助胃腸蠕動(dòng)，還富含香豆素類、黃酮類化合物，具有降血脂、消炎等作用的皂苷，以及具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種功效的多糖，對(duì)降血壓血糖等有一定功效[13]，被稱為山野菜中的“綠色黃金”。目前關(guān)于東北牛防風(fēng)的研究主要集中在化學(xué)物質(zhì)含量及生物活性[14-17]，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量及生理特征[18-19]，栽培[20-22]等方面，但關(guān)于東北牛防風(fēng)果實(shí)精油生物活性研究未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)東北牛防風(fēng)果實(shí)精油進(jìn)行提取并對(duì)其抗氧化活性、抑菌活性進(jìn)行研究，旨在為東北牛防風(fēng)精油的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

材料取自通化師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地，待東北牛防風(fēng)果實(shí)成熟，收集果實(shí)，除去雜質(zhì)和腐壞果實(shí)，將優(yōu)質(zhì)果實(shí)收集晾干備用。實(shí)驗(yàn)用菌種（黑根霉、金黃色葡萄球菌）為通化師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 東北牛防風(fēng)果實(shí)精油的提取

1.2.2 抗氧化活性測(cè)定

1.2.2.1 DPPH清除率的測(cè)定

參考尹浩等[23]的測(cè)定方法并稍加修改。取DPPH·39.43 mg溶于1 000 mL溶劑無水乙醇中（0.1 mmol/L），充分振搖使其完全溶解。配制不同濃度梯度的東北牛防風(fēng)果實(shí)精油無水乙醇溶液，濃度分別為2、4、6、8、10g/ml，以抗壞血酸作為陽性對(duì)照。分別0.1 mL東北牛防風(fēng)果實(shí)精油溶液與3.9 mL上述DPPH·無水乙醇溶液混合，室溫下避光反應(yīng)30 min，測(cè)定混合液在516 nm的吸光值。以無水乙醇為空白樣，平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。DPPH自由基清除率按下式計(jì)算：

式中：A0為DPPH·溶液吸光值；At為待測(cè)樣品與DPPH·反應(yīng)t min后的吸光值。

1.2.2.2 羥自由基清除率的測(cè)定

采用水楊酸捕獲法測(cè)定抗氧化性[15]。配制不同濃度梯度的東北牛防風(fēng)果實(shí)精油無水乙醇溶液，濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1g/ml，以抗壞血酸作為陽性對(duì)照。取2mL不同濃度的樣品稀釋液，依次加入1mL10mmol/L的水楊酸-乙醇溶液和1mL10mmol/L的硫酸亞鐵，最后加入30%過氧化氫，常溫下水浴30min，用蒸餾水調(diào)零，于517nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度（A1）。以蒸餾水代替樣品稀釋液作為空白組測(cè)吸光度（A0）；以蒸餾水代替過氧化氫作為對(duì)照組測(cè)定吸光度（A2）。進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。清除率計(jì)算公式為：

“總裁對(duì)話”分兩輪展開，在第一輪“制造新生態(tài)變革”對(duì)話環(huán)節(jié)，由MM《現(xiàn)代制造》雜志總編馮建平先生主持，參與對(duì)話嘉賓有：德馬吉森精機(jī)中國總裁/首席運(yùn)營(yíng)官Dr.Frank Beermann先生、北京起重運(yùn)輸機(jī)械設(shè)計(jì)研究院有限公司黨委書記兼副總經(jīng)理孫吉澤先生和達(dá)索系統(tǒng)大中華區(qū)創(chuàng)新技術(shù)中心首席技術(shù)官趙文功先生、菲尼克斯（中國）投資有限公司副總裁彭曉偉先生和北京伍強(qiáng)科技有限公司董事長(zhǎng)尹軍琪先生。

1.2.3 抑菌活性測(cè)定

1.2.3.1 PDA培養(yǎng)基制備

將馬鈴薯去皮切成小塊，稱量200g浸泡在無菌水中。電磁爐加熱煮沸20min，將混合物通過濾網(wǎng),除去殘?jiān)玫綖V液，加水至1000ml。繼續(xù)加熱濾液，沸騰后加入葡萄糖以及瓊脂粉各20g，待瓊脂粉溶解后，用NaOH調(diào)pH，將培養(yǎng)基倒入錐形瓶中，置于滅菌鍋滅菌。

1.2.3.2 實(shí)驗(yàn)菌種的擴(kuò)繁

培養(yǎng)皿中培養(yǎng)黑根霉，擴(kuò)增后再次純化備用。金黃色葡萄球菌則采用購買的專業(yè)菌種。

1.2.3.3 活化菌種

在超凈工作臺(tái)中，將金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)接在培養(yǎng)基上劃線，恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)36h。

1.2.3.4 菌餅制備

黑根霉活化后轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)24h，使用取餅器在黑根霉菌絲部位取材，制成菌餅。

1.2.3.5 菌懸液制備

將活化后的金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)移至裝有無菌水的試管中混勻制成菌懸液。

1.2.3.6 東北牛防風(fēng)果實(shí)精油藥敏紙片制備

采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定抑菌效力[24]，用二倍稀釋法[25]配制不同濃度的東北牛防風(fēng)果實(shí)精油。利用打孔器打出直徑6mm的圓形濾紙片，并將濾紙片用滅菌鍋滅菌。在超凈工作臺(tái)中分別浸泡在0%、10%、20%、40%、80%、100% 6個(gè)濃度梯度的東北牛防風(fēng)果實(shí)精油中，浸泡1h后，制成精油藥敏紙片，陰干備用。

1.2.3.7 東北牛防風(fēng)果實(shí)精油抑菌活性研究

在超凈工作臺(tái)中將已經(jīng)配置完畢的6種濃度梯度的精油（無水乙醇作為對(duì)照組、0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%）用移液槍分別吸取20 μL，均勻涂抹在培養(yǎng)基表面。待精油陰干后，將黑根霉菌餅置于培養(yǎng)基中央[26]，每組實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)，分別標(biāo)記后，密封袋密封，置于風(fēng)箱中28℃下培養(yǎng)24h。

在相同的無菌環(huán)境下，將金黃色葡萄球菌菌懸液均勻涂布于培養(yǎng)皿中，將不同精油含量的藥敏紙片（濃度梯度為0%、10%、20%、40%、80%、100%，其中0%為無水乙醇浸泡，作為對(duì)照組）以相等間隔在培養(yǎng)基表面排成一圈。每組實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)，有序標(biāo)記后，置于恒溫培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)24h[27]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)所獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用Excel軟件和SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 東北牛防風(fēng)果實(shí)精油對(duì)DPPH的清除效果

由圖1可知，不同濃度東北牛防風(fēng)果實(shí)精油對(duì)DPPH清除率隨濃度的升高呈逐漸上升的變化趨勢(shì)，東北牛防風(fēng)果實(shí)精油濃度為10g/ml時(shí)，DPPH清除率最高為2.77%，與精油濃度為8g/ml的清除率相比差異不顯著，與其他3個(gè)時(shí)期相比差異顯著（P＜0.05），與陽性對(duì)照VC的清除率相比有很大差異。

圖1 不同濃度東北牛防風(fēng)果實(shí)精油對(duì)DPPH清除率的動(dòng)態(tài)變化

2.2 東北牛防風(fēng)果實(shí)精油對(duì)羥自由基的清除效果

由圖2可知，不同濃度東北牛防風(fēng)果實(shí)精油對(duì)羥自由基清除率隨濃度的提高呈逐漸上升的趨勢(shì)變化，東北牛防風(fēng)果實(shí)精油濃度為1g/ml時(shí)，羥自由基清除率最高為46.90%，與精油濃度為0.8g/ml的清除率相比差異不顯著，與其他3個(gè)時(shí)期相比差異顯著（P＜0.05），與陽性對(duì)照VC的清除率相比有較大差異。

圖2 不同濃度東北牛防風(fēng)果實(shí)精油對(duì)羥自由基清除率的動(dòng)態(tài)變化

2.3 東北牛防風(fēng)果實(shí)精油對(duì)黑根霉的抑菌效果

表1 不同濃度東北牛防風(fēng)果實(shí)精油對(duì)黑根霉的抑制作用

東北牛防風(fēng)果實(shí)精油對(duì)黑根霉的抑菌效果可以通過黑根霉的生長(zhǎng)直徑大小進(jìn)行比較（圖3），結(jié)果見表1，東北牛防風(fēng)果實(shí)精油對(duì)黑根霉具有明顯的抑菌效果。隨著精油濃度的提高，菌餅直徑逐漸下降，反應(yīng)抑菌效果逐漸增強(qiáng)。精油濃度在0.1%～0.4%之間，菌餅直徑變化差異不顯著。當(dāng)濃度達(dá)0.8%～1%時(shí)，菌餅直徑顯著減少，說明抑菌能力顯著增強(qiáng)。精油濃度為1%時(shí)，菌餅直徑最小為4.73cm，抑菌效果最高。

圖3 東北牛防風(fēng)果實(shí)精油對(duì)黑根霉的抑制效果

2.4 東北牛防風(fēng)果實(shí)精油對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果

東北牛防風(fēng)果實(shí)精油對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果可以通過金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小進(jìn)行比較（圖4），結(jié)果見表2，東北牛防風(fēng)果實(shí)精油對(duì)金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌效果。隨著精油濃度的提高，抑菌圈直徑逐漸上升，反應(yīng)抑菌效果逐漸增強(qiáng)。精油濃度在40%～80%之間，抑菌圈直徑變化差異不顯著。當(dāng)濃度到達(dá)80%～100%時(shí)，抑菌圈直徑顯著增大，說明抑菌能力顯著增強(qiáng)。精油濃度為100%時(shí)，抑菌圈直徑最大為0.92cm，抑菌效果最高。

表2 不同濃度東北牛防風(fēng)果實(shí)精油對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用

圖4 東北牛防風(fēng)果實(shí)精油對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用

3 結(jié)論

東北牛防風(fēng)果實(shí)精油對(duì)DPPH和羥自由基清除率隨濃度的升高而增大。當(dāng)東北牛防風(fēng)果實(shí)精油濃度為10g/ml時(shí)，DPPH清除率最高為2.77%;當(dāng)東北牛防風(fēng)果實(shí)精油濃度為1g/ml時(shí)，羥自由基清除率最高為46.90%。東北牛防風(fēng)果實(shí)精油對(duì)黑根霉、金黃色葡萄球菌均具有一定的抑菌效果,這與顧仁勇[28]、李娜[29]研究結(jié)果一致。精油濃度在0.8%～1%之間對(duì)真菌的抑制效果最好。精油濃度在80%～100%之間對(duì)細(xì)菌的抑制效果最好，抑菌效果與東北牛防風(fēng)果實(shí)精油濃度成正比。東北牛防風(fēng)果實(shí)精油具有良好的生物活性。其在日化、飼料、醫(yī)藥、化工和食品保藏等領(lǐng)域中的應(yīng)用具有很好的參考價(jià)值。