李蔣偉，周 力，馬博研，高占紅，姚有莉，王志有，侯生珍，桂林生

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016)

隨著近年來藏羊飼養(yǎng)模式從放牧到集中舍飼的轉(zhuǎn)變，其各生長階段的日糧配比及營養(yǎng)水平成為藏羊舍飼生產(chǎn)迫切待解決的問題[1]。從藏羊早期斷奶分欄飼喂直至出欄，在此階段日糧的營養(yǎng)水平尤為重要；其中蛋白水平是影響反芻動物育肥效果最重要因素之一，過低的蛋白水平會降低育肥藏羊消化率和生產(chǎn)性能，而過高的蛋白水平又會引起相關(guān)代謝病[2]，因此適宜的日糧蛋白水平對育肥藏羊尤為重要。瘤胃作為反芻動物日糧消化的重要一站，其內(nèi)數(shù)以億計的微生物將日糧營養(yǎng)成分轉(zhuǎn)化為能被宿主吸收利用的蛋白質(zhì)或者揮發(fā)酸[3]；細菌占瘤胃眾多微生物的50%以上，對反芻動物機體健康和生產(chǎn)性能起主導(dǎo)作用[4]。王堯悅[5]對5 ～ 6 月齡灘羊飼以不同營養(yǎng)水平日糧，發(fā)現(xiàn)棲瘤胃普雷沃氏菌、黃色瘤胃球菌、溶糊精琥珀酸弧菌、溶纖維丁酸弧菌和產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量隨日糧營養(yǎng)水平的提高而顯著增加。Chanthakho 等[6]研究給水牛日糧補充豆科植物，通過實時定量 PCR 和 PCR-DGGE 現(xiàn)代分子技術(shù)發(fā)現(xiàn)瘤胃內(nèi)纖維分解菌（黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌）數(shù)量顯著增加。目前，放牧和“放牧+補飼”模式下育肥藏羊瘤胃微生物區(qū)系受許多學(xué)者關(guān)注，但有關(guān)舍飼育肥藏羊瘤胃細菌菌群多樣性的研究較少，日糧蛋白水平對藏羊瘤胃細菌群影響的研究尚未形成定論。本試驗應(yīng)用16S rDNA 高通量測序技術(shù)探究日糧蛋白水平對育肥藏羊瘤胃細菌菌群多樣性的影響，以期為進一步了解藏羊瘤胃微生物和合理配制育肥期藏羊日糧奠定理論基礎(chǔ)，為舍飼藏羊健康高效的養(yǎng)殖模式探索提供參考。

1.2 試驗動物日糧及飼養(yǎng)管理

參考NY/T 816—2004 中國肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)[7]進行育肥藏羊日糧配制。各處理組分別飼以蛋白水平為10.08%、12.84%和14.97%的日糧，其他營養(yǎng)水平保持一致。飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗羔羊全舍飼分欄飼養(yǎng)，每天定時清掃圈舍，按時對羊舍和運動場進行消毒殺菌，并對羔羊進行常規(guī)疫苗的免疫注射和寄生蟲防治。

表1 飼料組成及營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets（DM basis）

1 材料與方法

1.1 試驗動物及試驗設(shè)計

在青海省海北州高原現(xiàn)代畜牧示范園區(qū)選取15 只體況良好的3 月齡健康藏羊公羔，平均體重為（22.05±2.06）kg；完全隨機平均分為3 個處理組（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ），預(yù)飼期7 d 后開始飼喂試驗，育肥期112 d。試驗期內(nèi)每天9:00 和18:00 飼喂2 次，自由采食、飲水。

1.3 樣品采集和處理

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，試驗藏羔羊于清晨空腹屠宰，在不同位點取瘤胃內(nèi)容物，經(jīng)4 層紗布過濾后取瘤胃液于50 mL 離心管中，混勻、過濾后將濾液進行3 500 r·min-1離心15 min，投入液氮，并于實驗室- 80 ℃冷凍保存。

1.4 瘤胃液細菌分析方法

本試驗中瘤胃細菌16S rDNA 高通量測序工作委托廣州賽哲生物科技股份有限公司完成。使用DNA提取試劑盒（Invitrogen?，USA）提取瘤胃微生物基因組DNA，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計得到引物，其中通用引物正向：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′；反向：5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′。擴增條件：98 ℃左右持續(xù)2 min，輪回30 次循環(huán)，依次經(jīng)過98 ℃ × 30 s、50 ℃ × 30 s、72 ℃ × 1 min，最后于72 ℃下延長7 min。根據(jù)Barode 序列和PCR 擴增引物序列從下機數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode 序列和引物序列，對樣品的reads 進行拼接、過濾低質(zhì)量的tag 以及嵌合體，得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)(Cean Tags)。然后基于 CleanTags 進行OTUs(Operational Taxonomic Unis)聚類(OTU 分析)。根據(jù)OTUs 聚類結(jié)果，對每個OTU 的代表序列做物種注釋，得到對應(yīng)的物種注釋信息和基于物種的豐度分布情況。Ⅱ組中一個樣品測序質(zhì)量評估不合格，對其剔除。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 整理初始數(shù)據(jù)，群落分布的差異顯著性檢驗采用R 語言（Version 4.1）中的Wilcox 非參數(shù)檢驗，檢測結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean ± SE）的形式表示。差異顯著的評斷標(biāo)準(zhǔn)為P＜ 0.05。Alpha多樣性指數(shù)分析軟件為： Mothur version v.1.30，通過PCA 分析中，計算距離矩陣，利用各樣品序列間的進化信息來計算樣品間距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白水平下育肥藏羊瘤胃細菌OTU基礎(chǔ)分析

2.1.1 測序質(zhì)量評估 參與測序樣品共產(chǎn)生371 200條Clean tags，每個樣品至少產(chǎn)生41 241 條Clean tags，平均產(chǎn)生49 356 條Clean tags，質(zhì)控有效數(shù)據(jù)量達48 322。所有樣品測序覆蓋率均在99%以上，本試驗測序深度能夠準(zhǔn)確反映瘤胃細菌的組成。

2.1.2 瘤胃微生物多樣性 對不同蛋白水平下藏羊瘤胃細菌Alpha 多樣性指數(shù)分析如表2：Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)反映了瘤胃細菌群落多樣性，ACE 指數(shù)和Chao l 指數(shù)則決定了瘤胃細菌OUT 數(shù)目和豐富度。其中，Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)各組之間無顯著性差異（P＞ 0.05），表明各組間群落多樣性相似；ACE 指數(shù)和Chao l 指數(shù)Ⅰ組顯著高于Ⅱ組和Ⅲ組（P＜ 0.05），表明Ⅰ組相較Ⅱ組和Ⅲ組有較高的群落豐富度。

表2 不同蛋白水平日糧對育肥藏羊瘤胃微生物多樣性指數(shù)的影響Table 2 Effects of different protein levels on rumen microbial diversity index of fattening Tibetan Sheep

2.2 不同蛋白水平下育肥藏羊瘤胃細菌分類學(xué)分析

2.2.1 門水平下瘤胃細菌分布分析 在本試驗中藏羊瘤胃存在4 種主要菌門，其中Bacteroidetes（擬桿菌門）和Firmicutes（厚壁菌門）是優(yōu)勢菌門。對4 種菌門相對豐度進行顯著性分析如表 3 所示：Bacteroidetes（擬桿菌門）和Firmicutes（厚壁菌門）相對豐度分別超過43%和37%，且均隨日糧蛋白水平提高而顯著增加（P＜ 0.05）；Proteobacteria（變形菌門）和Actinobacteria（放線菌門）相對豐度較小，分別低于4%和3%，且相對豐度Ⅱ組顯著較高（P＞ 0.05）。

表3 門水平下細菌相對含量Table 3 Relative bacterial content at phylum level %

2.2.2 科水平下瘤胃細菌分布分析 本試驗中藏羊瘤胃存在11 種主要菌科，其中Lachnospiraceae（毛螺菌科）、Prevotellaceae （普雷沃氏菌科）和Ruminococcaceae（瘤胃球菌科）是主要已知菌科。對其相對豐度進行顯著性分析如表 4 所示：Lachnospiraceae（毛螺菌科）相對豐度 6.04% ～11.42%，各組之間差異不顯著（P＞ 0.05）； Ruminococcaceae（瘤胃球菌科）相對豐度8.19% ～ 15.07%，且Ⅱ組和Ⅲ組顯著高于Ⅰ組（P＜ 0.05）；Veillonellaceae（韋榮氏菌科）相對豐度2.78% ～ 9.64%，且Ⅲ組顯著高于Ⅰ組（P＜ 0.05）。Paraprevotellaceae（帕拉普氏菌科）、Christensenellaceae（克里斯滕森菌科）和Succinivibrionaceae（琥珀酸弧菌科）的相對豐度不受日糧蛋白水平影響（P＞ 0.05）。

表4 科水平下細菌相對含量Table 4 Relative bacterial content at family level %

2.2.3 屬水平下瘤胃細菌分布分析 本試驗中藏羊瘤胃主要存在7 種主要菌屬，對其相對豐度進行顯著性分析如表5 所示：Prevotella（普雷沃氏菌屬）的相對豐度較高（13.32% ～ 18.87%），且Ⅲ組顯著高于Ⅰ組和Ⅱ組（P＜ 0.05）；Ruminococcus（瘤胃球菌屬）是次優(yōu)菌屬，Ⅱ組相對豐度顯著較高（P＜0.05）；其余菌屬相對豐度均較?。ǎ?3%）。其中Butyrivibrio（丁酸弧菌屬）、CF231、RFN20、Selenomonas（月形單胞菌屬）和Succiniclasticum（解琥珀酸菌屬）均不受蛋白水平影響（P＞ 0.05）。

表5 屬水平下細菌相對含量Table 5 Relative bacterial content at genus level %

2.3 不同蛋白水平下育肥藏羊瘤胃細菌主成分分析

利用UniFrac PCA 對不同蛋白水平下育肥藏羊瘤胃細菌群落差異進行研究，通過系統(tǒng)進化距離來衡量樣品間的距離并顯示于二維PCA 圖上（圖1）。基于UniFrac 加權(quán)主坐標(biāo)分析其第一主成分和第二主成分貢獻率分別為61.57%和52.37%，各組間瘤胃液細菌群落結(jié)構(gòu)差異不明顯，但有彼此分隔的趨勢，其中采食低蛋白水平日糧的藏羊細菌相似度更高，更好聚類在一起。

圖1 瘤胃細菌主成分分析Figure 1 The PCA of rumen bacteria

3 討論與結(jié)論

3.1 不同蛋白水平對瘤胃細菌多樣性的影響

剛出生的藏羔羊瘤胃中即有部分微生物定植，藏羔羊早期斷奶后隨著粗飼料采食的增加和瘤胃逐漸發(fā)育，瘤胃微生物群落迅速發(fā)展[8-9]；且新生或幼齡反芻動物瘤胃微生物與成年階段相比更易受飼糧等因素的影響，影響作用持續(xù)時間也更長久[10]。郭凱等[11]用19%和22%蛋白水平飼糧飼喂?fàn)倥?，發(fā)現(xiàn)19%組Chao1 指數(shù)比22%組顯著提高20.7%，PD whole tree 指數(shù)提高了17.4%，其余多樣性指數(shù)無顯著差異。在本試驗條件下，不同蛋白水平對瘤胃細菌香濃指數(shù)和辛普森指數(shù)均無顯著性影響，而低蛋白水平下藏羊瘤胃細菌ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)均顯著高于高蛋白組。說明在育肥藏羔羊建立了較為穩(wěn)定的微生物群落體系，而不同蛋白水平對細菌多樣性并無較大影響，只作用于OTU 種類和數(shù)量，從而影響細菌豐度；當(dāng)?shù)鞍姿綖?0.08%時可促進瘤胃細菌定植，與前人研究相一致。

3.2 不同蛋白水平下瘤胃細菌分類學(xué)分析結(jié)果

厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門是廣泛存在于反芻動物瘤胃中的優(yōu)勢細菌，其優(yōu)勢程度受宿主年齡、性別、飼糧組成、養(yǎng)殖方式以及遺傳條件等多重因素制約[12-13]，蛋白水平作為反芻動物日糧配制的主要因素，對瘤胃細菌優(yōu)勢菌群有較大影響[14]。高蛋白日糧能為微生物提供更多的營養(yǎng)，從而導(dǎo)致部分優(yōu)勢菌群增多，提高對營養(yǎng)物質(zhì)分解消化效率。本研究得到的結(jié)果與前人相似，厚壁菌門和擬桿菌門在瘤胃細菌種占據(jù)優(yōu)勢地位，擬桿菌門與非纖維類營養(yǎng)物質(zhì)降解直接相關(guān)，而厚壁菌門則主要降解纖維類物質(zhì)[15]。在本研究中，高蛋白日糧下擬桿菌門和厚壁菌門更易增殖，可能是高蛋白日糧可為擬桿菌門類細菌提供更多發(fā)酵底物和能量，微生物數(shù)量增加又提高部分營養(yǎng)物質(zhì)降解效率[16]。放線菌門能產(chǎn)生大量抗生素和蛋白酶等有益宿主消化道健康和營養(yǎng)物質(zhì)消化代謝的物質(zhì)[11]，本研究發(fā)現(xiàn)在蛋白水平為12.84%時豐度較高。李海琴等[17]研究發(fā)現(xiàn)提高飼糧蛋白質(zhì)水平有助于小尾寒羊瘤胃內(nèi)有關(guān)纖維降解菌的增殖，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水平達到14%時，瘤胃對日糧蛋白的降解能力最強，與本試驗結(jié)果一致。

普雷沃氏菌屬擬桿菌門，是瘤胃中最主要的蛋白降解菌，可分解淀粉和部分細胞壁多糖[18]，同時也可促進對半纖維素的降解[19]。Ellison 等[20]發(fā)現(xiàn)日糧中粗蛋白質(zhì)水平、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的差異均會引起反芻動物瘤胃內(nèi)普雷沃氏菌物種和豐度的差異。在本研究中，當(dāng)日糧蛋白水平達到14.97%時，普雷沃氏菌屬相對豐度顯著增加，并且占據(jù)瘤胃細菌優(yōu)勢地位，表明高蛋白日糧促進了普雷沃氏菌屬增殖。瘤胃球菌屬是瘤胃內(nèi)降解木質(zhì)纖維素的優(yōu)勢菌種，目前可分離的多數(shù)菌株都可利用纖維素、木聚糖和纖維二糖，并能夠產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶和纖維素酶等多種木質(zhì)纖維素降解酶[21]。本研究表明當(dāng)日糧蛋白水平為12.84%時，更適宜瘤胃球菌生長定植。丁酸弧菌屬功能同普雷沃氏菌屬相似，也是一種可發(fā)酵淀粉、非纖維多糖以及單糖的多功能菌屬，兼具淀粉酶和蛋白酶活性，也影響部分揮發(fā)性脂肪酸的含量[22]，但在本研究中不同蛋白日糧的影響下未對其豐度造成影響。

在本試驗條件下，不同蛋白水平對育肥藏羊瘤胃細菌多樣性無顯著影響，但可影響其豐富度；同時隨著日糧蛋白水平的提高，F(xiàn)irmicutes（厚壁菌門）和Bacteroidetes（擬桿菌門）相對豐度顯著增加，Prevotella（普雷沃氏菌屬）在日糧蛋白水平為14.97%時更適宜生長，Ruminococcus（瘤胃球菌屬）則在日糧水平為12.84%時活性更高。