呼倫貝爾草甸草原土壤古菌群落多樣性高通量分析

高明華，于春艷，劉金月，于鳳蒞，孫廣霽

（呼倫貝爾學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021008）

草地生態(tài)系統(tǒng)是由植被生態(tài)系統(tǒng)、土壤生態(tài)系統(tǒng)和微生物生態(tài)系統(tǒng)組成，其分布廣泛，面積巨大，是重要的自然資源。內(nèi)蒙古呼倫貝爾草原為溫帶草原，具有極其重要的生態(tài)服務(wù)功能、蘊(yùn)含著巨大的碳匯資源，同時(shí)還是綠色畜產(chǎn)品的生產(chǎn)地和優(yōu)質(zhì)牧草的輸出地。因此如何客觀評(píng)價(jià)草地的利用與保護(hù)之平衡，就顯得尤為重要。放牧和刈割是天然草場(chǎng)管理和利用的主要方式，也是兩個(gè)主要人為干擾因素[1]。放牧和刈割一方面影響著植被生態(tài)系統(tǒng)，另一方面還會(huì)對(duì)土壤微生物產(chǎn)生的影響。近年很多天然草地實(shí)施了圍封管理，研究表明，圍封也是保護(hù)草地生態(tài)系統(tǒng)的重要措施之一。

微生物是草地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，推動(dòng)了土壤的發(fā)生和發(fā)育，是生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)與能量交換的重要紐帶，維系著草地生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展。土壤微生物學(xué)是生命科學(xué)與地球科學(xué)的新興學(xué)科與交叉前沿，是地球元素生物化學(xué)循環(huán)的引擎[2]。同時(shí)，土壤微生物在草地生態(tài)系統(tǒng)的合理利用和土壤生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)方面也具有指示和指標(biāo)作用。土壤微生物的多樣性與群落結(jié)構(gòu)是當(dāng)今生物多樣性研究的熱點(diǎn)[3]。

古菌域是不同于細(xì)菌域與真核生物域的獨(dú)立生命域，也是微生物的重要組成部分。土壤細(xì)菌和土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)、多樣性以及在維持土壤肥力和可持續(xù)發(fā)展方面的研究已開展多年，但是古菌在土壤中的生物多樣性及功能近些年才被關(guān)注。目前國內(nèi)古菌群落研究可見于水生態(tài)系統(tǒng)[4]、農(nóng)田土壤[5-6]等，關(guān)于草甸草原土壤古菌研究尚未有報(bào)道。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)（High-throughput sequencing，HTS），分析了不同利用方式下呼倫貝爾草甸草原土壤古菌群落的結(jié)構(gòu)、多樣性和功能，以揭示不同利用方式對(duì)草原影響的微生物學(xué)本質(zhì)和古菌之作用，為草原土壤微生物多樣性保護(hù)和利用提供理論依據(jù)。

1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)樣地位于呼倫貝爾草甸草原腹地，地理位置為E119°36′326″～119°59′856″，N49°17′781″～50°19′991″，海拔629～635 m。植被群落的主要物種有羊草（Lepidum chinense）、貝加爾針茅（Stipa baicalensis）等。試驗(yàn)地區(qū)屬于中溫帶半干旱大陸性季風(fēng)氣候，年降水量356 mm，主要集中在7—9月份，變動(dòng)幅度較大；年均氣溫-2.36℃，最高氣溫36.8℃，最低氣溫-48.1℃。年積溫1 580～1 860℃，無霜期112 d。土壤類型是暗栗鈣土。

2 研究方法

2.1 土壤樣品的采集與處理

于2018年植物的生長(zhǎng)旺季（8月份）在呼倫貝爾草原上進(jìn)行野外觀測(cè)及采樣。試驗(yàn)樣地（3塊）位于呼倫貝爾草甸草原，利用方式分別為刈割（Y）、放牧（F）和圍封（W），每塊樣地設(shè)置3個(gè)樣方（20 m×20 m），每個(gè)樣方內(nèi)采用5點(diǎn)取樣法采集0～10 cm土屋（分別為Y1、F1和W1）和10～20 cm（分別為Y2、F2和W2）土層樣品混合成1個(gè)土壤樣本，除去樣本中的礫石和植物殘根等，混勻、研碎，過2 mm篩，取部分土樣用無菌塑封袋密封，置于0℃以下保溫盒中帶回實(shí)驗(yàn)室用于高通量測(cè)序分析。試驗(yàn)樣地相關(guān)信息見表1。

表1 樣本采樣地相關(guān)信息

2.2 試劑與儀器

E.Z.N.A.TMMag-Bind Soil DNA Kit（型號(hào)為M5635-02），購于Omega Bio-Tek公司；分光光度儀（型號(hào)為NanoDrop-ND 1000），購于凱樂博（北京）科技發(fā)展有限公司；土壤DNA提取試劑盒購于Omega公司。

2.3 土壤基因組DNA提取及高通量測(cè)序

土壤碾碎過80目篩后提取土壤總DNA。利用土壤DNA提取試劑盒提取DNA，然后采用分光光度儀測(cè)定提取的DNA濃度，并利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。將提取質(zhì)量合格的DNA樣品送生工生物工程（上海）股份有限公司對(duì)細(xì)菌16S rRNA V3～V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序使用Illumina（MiSeq）平臺(tái)。

2.4 生物信息學(xué)分析

原初數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控過濾，得到各樣本有效數(shù)據(jù)。在97%的相似水平下利用QIIME（v1.8.0)軟件進(jìn)行物種操作分類單元（Operational taxonomic units，OTU)的劃分，并進(jìn)行基于OTU的物種組成分析、Alpha多樣性分析、樣本聚類和樣本間相似性比較及基于COG（Clusters of orthologous groups，直系同源基因群）的功能預(yù)測(cè)分析等。

2.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與高通量分析

2.5.1 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)

采用Excel 2011軟件和SPSS 19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析。

2.5.2 高通量分析用軟件和數(shù)據(jù)庫

采用RDP數(shù)據(jù)庫（Release 11.1,http://rdp.cme.msu.edu/）及R（v3.2）、Mothur 1.30.1和UniFrac軟件等進(jìn)行高通量分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 測(cè)序結(jié)果質(zhì)量分析

每個(gè)樣品的有效序列數(shù)量測(cè)定結(jié)果見表2。

通過對(duì)6個(gè)不同處理的土壤樣品進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序，根據(jù)結(jié)果對(duì)序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，每個(gè)樣品的有效序列數(shù)量結(jié)果見表2。原始序列的數(shù)目為481 319條，QC后得到優(yōu)質(zhì)序列的總數(shù)是468 904條，過濾后有效率為96.73%～99.25%。

表2 樣品序列數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

通常在97%的相似水平下對(duì)序列進(jìn)行OTU的聚類，統(tǒng)計(jì)獲得全部樣品在不同OTUs中的豐度信息，共產(chǎn)生2 523個(gè)OTUs。6個(gè)土壤樣品的優(yōu)質(zhì)序列長(zhǎng)度主要分布在377～379 bp，在378 bp的序列最多為85 553條。

6個(gè)處理所含的古菌群落OTUs韋恩圖見圖1。由韋恩圖可知，6個(gè)處理共有的OTU為65個(gè)，占比為13.18%～20.57%；而每個(gè)樣品特有的OTU數(shù)量為23～41個(gè)，占比相對(duì)較低。W2特有的OTU在6個(gè)處理中最多，為41，占該樣品總OTU的8.82%；Y1特有的OTU在6個(gè)樣品中最少，為23，僅占該樣品總OTU的6.37%。這說明不同處理方式對(duì)土壤古菌群落的影響很大；同時(shí)還表明，由于處理間與土層異質(zhì)性增加，為種群的進(jìn)化和演替提供了更大的可能。

圖1 6個(gè)處理土壤古菌群落OTUs韋恩圖

6個(gè)樣品基于OTU的樣本聚類樹圖見圖2。樣本聚類樹圖利用樹枝結(jié)構(gòu)能夠更加直觀地反映出多個(gè)樣品之間的相似性和差異關(guān)系。樹枝的長(zhǎng)度代表樣本間的距離，越相似的樣本會(huì)越靠近。由圖2可知，Y1與F1的相似性最高，W1與Y1、F1在一個(gè)分支上，說明在0～10 cm土層中放牧、刈割和圍封處理方式下，土壤古菌群落均具有較高的相似性；Y2與F2的相似性次之，二者與W2不在一個(gè)分支上，W2與Y2、F2的相似性明顯低于W1與Y1、F1的相似性。OTU的樣本聚類樹圖還表明，W2與另外兩個(gè)分枝（Y2和F2、Y1和F1）及W1分枝共同聚類在一起?？傮w分析來看，基本上反映出Y區(qū)與F區(qū)的古菌群落相似程度高，但與W區(qū)的相似程度較低。

圖2 基于OTU的樣本聚類樹圖

3.2 Alpha多樣性分析

3.2.1 基于Alpha多樣性的稀釋曲線

W1、W2、F1、F2、Y1和Y2優(yōu)質(zhì)序列分別包含84 447、73 667、80 606、85 553、69 969、74 662條。使用97%相似度的OTU，利用Mothur軟件進(jìn)行Rarefaction分析，再利用R軟件制作稀釋曲線圖[7]。各個(gè)樣本稀釋曲線見圖3。

從圖3中可以看出，序列數(shù)目達(dá)到400時(shí)各種樣品稀釋曲線均趨于平展，表明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，能真實(shí)反映土壤樣本中的古菌群落。

圖3 不同區(qū)組土壤古菌測(cè)序的稀釋曲線

3.2.2 Alpha多樣性指數(shù)

Alpha多樣性指數(shù)見表3。

表3 6個(gè)土壤樣品古菌多樣性指數(shù)

由表3可知：各樣本文庫的覆蓋率均為100%，說明土樣中的基因序列能被檢出的概率高，本次測(cè)序結(jié)果能代表草甸草原土壤古菌群落的實(shí)際情況。

根據(jù)香濃指數(shù)分析，古菌物種的多樣性表現(xiàn)為W2＞F2＞F1＞Y1＞W(wǎng)1＞Y2；在 刈 割 條 件 下，0～10 cm土層物種多樣性則高于10～20 cm土層的。而在圍封和放牧條件下，10～20 cm土層物種多樣性均高于0～10 cm土層的；說明不同處理方式下土壤古菌演替存在不一致性。

基于土層方面，0～10 cm土層物種多樣性表現(xiàn)為F1＞Y1＞W(wǎng)1；10～20 cm土層物種多樣性表現(xiàn)為W2＞F2＞Y2。說明放牧和刈割在促進(jìn)物種豐度和群落多樣性增加方面具有積極的作用。

根據(jù)Chao1指數(shù)分析，各處理物種的豐度表現(xiàn)為W2＞F1＞W(wǎng)1＞F2＞Y1＞Y2；在 刈 割 和 放 牧 條 件下，0～10 cm土層物種的豐度均高于10～20 cm土層的，而圍封條件下，10～20 cm土層物種的豐度則高于0～10 cm土層的（W2＞W(wǎng)1）。

基于土層方面，0～10 cm土層物種豐度表現(xiàn)為：放牧＞圍封＞刈割；10～20 cm土層物種豐度表現(xiàn)為：圍封＞放牧＞刈割。

通過表3的綜合數(shù)據(jù)看來，W2區(qū)的古菌群落多樣性和豐富度都最高，因此，圍封對(duì)保持物種豐度和群落多樣性具有重要作用。

從不同處理間Alpha指數(shù)箱式圖可以看出，樣本內(nèi)的離散程度，例如從辛普森指數(shù)來看樣本之間的離散程度結(jié)果見圖4。

從圖4可以看出，F(xiàn)區(qū)組的盒子最窄，說明該區(qū)內(nèi)樣本離散程度最小，相比較而言具有較高的保守性；W區(qū)組的盒子最寬，說明該區(qū)樣本的離散程度最大，W區(qū)組的古菌群落相對(duì)于F區(qū)與Y區(qū)保守性較低，結(jié)果表明圍封有利于古菌群落多樣性的保護(hù)，而重度放牧?xí)r古菌群落多樣性則明顯降低。

圖4 處理間Alpha指數(shù)箱式圖（辛普森指數(shù)）

3.3 土壤樣品古菌群組成分析

從門水平分析群落組成，結(jié)果見圖5；從屬水平分析群落組成，結(jié)果見圖6。

圖5 門水平所有樣本群落結(jié)構(gòu)分布情況

圖6 屬水平所有樣本群落結(jié)構(gòu)分布圖

從門的分類水平看，6個(gè)土壤樣品中共檢測(cè)出12個(gè)門類，其中奇古菌門（Thaumarchaeota）、廣古菌門（Euryarchaeoya）平均占比分別為78.03%和19.81%，為優(yōu)勢(shì)菌門；烏斯菌門（Woesearchaeota）和疣微菌門（Verrucomicrobia）平均占比分別為1.37%和1.12%，是主要菌門，其他菌門占比均低于1%。

由圖6可知，6個(gè)土壤樣品中共檢測(cè)到24個(gè)屬，其中亞硝化球菌屬（Nitrososphaera）、產(chǎn)甲烷類球菌屬（Methanomassiliicoccus）平均占比分別為78.03%和19.39%，為優(yōu)勢(shì)屬；烏斯菌AR16屬（Woesearchaeota Incertae SedisAR16）、斯巴桿菌屬（Spartobacteria genera incertae sedis）平均占比超過1%，是土壤古菌

如圖8所示，除了W1與W1這樣的自身交叉區(qū)的顏色之外，F(xiàn)1與Y1交叉區(qū)的顏色是最深紅的，所以二者古菌群落組成最相似，其次是F2與W2、W1與Y2、W1與Y1、W1與F1、Y1與Y2交叉區(qū)的顏色逐漸變淺，說明其間的相似性依次變低；F1與Y2、W2與F2、W2與Y2、W1與W2、F2與F1、F1與F2交叉區(qū)的顏色由淺藍(lán)依次變?yōu)樯钏{(lán)，說明其間的差異性依次遞增。W2與F1、Y1交叉區(qū)的顏色最為深藍(lán)，所以W2區(qū)與F1區(qū)、Y1區(qū)古菌群落組成差異性最大，相似水平最低。故通過對(duì)Unifrac分析結(jié)果的聚類發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)區(qū)與Y區(qū)的古菌群落相似性高。二者與W區(qū)組的古菌群落的相似性低。中的主要群落。

3.4 主成分分析

樣本間的相似度越高則在圖中的位置越聚集，基于OTU的主成分分析（Principal component analysis，PCA）三維圖結(jié)果見圖7。

圖7 基于OTU的PCA三維圖

如圖7所示，可以看出PCA1、PCA2和PCA3的樣品差異性貢獻(xiàn)率分別達(dá)到93%、4%和2%，合計(jì)達(dá)到99%，是差異的主要來源，根據(jù)各樣本在圖中的位置關(guān)系可以看出，F(xiàn)1區(qū)與Y1區(qū)更加聚集些，所以F1區(qū)與Y1區(qū)的相似度高，其次為W1和F2。

3.5 樣品間復(fù)雜度比較分析

各樣本之間距離關(guān)系分析結(jié)果見圖8。

圖8 樣品距離熱圖（加權(quán)UniFrac的熱圖）

3.6 功能測(cè)序分析

樣品中古菌的功能預(yù)測(cè)結(jié)果見圖9。

根據(jù)功能測(cè)序結(jié)果，可觀測(cè)各樣品土壤古菌在更高層級(jí)水平上的功能。由圖9可以看出，6個(gè)樣品在更高層級(jí)上的功能主要有25種，其中能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換（Energy production and conversion），通用一般功能預(yù)測(cè)（General function prediction only），復(fù)制、重組與修復(fù)（Replication,recombination and repair），核苷酸的遷移和代謝（Migration and metabolism of nucleotides），翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生（Translation,ribosomal structure and biogenesis）以及氨基酸的運(yùn)輸和代謝（Transport and metabolism of amino acids）等功能在古菌群落中表現(xiàn)明顯。同時(shí)由圖9可知，三種處理0～10 cm土層土壤古菌的功能明顯強(qiáng)于10～20 cm土層的，說明0～10 cm土層土壤古菌的代謝活性強(qiáng)于10～20 cm的。F1和Y1、W2和F2及Y2和W1在主要功能和功能強(qiáng)度上具有相似性，說明放牧和刈割對(duì)0～10 cm土層古菌的功能影響比較明顯。

圖9 基于COG通路的功能結(jié)構(gòu)分布柱狀圖

4 討論

一般來講，古菌主要分布在極端環(huán)境，但在一些非極端環(huán)境中均有分布，其分布的生態(tài)類型多樣，包括水生態(tài)系統(tǒng)[4]、農(nóng)田土壤[5-6]、放射污染區(qū)[7]、重金屬污染區(qū)[8]、火山噴發(fā)沉積物[9]和陸坡沉積物[10]。研究結(jié)果顯示，目前已檢測(cè)到包括奇古菌、廣古菌和泉古菌等12個(gè)門21個(gè)科36個(gè)屬。這說明古菌存在的生態(tài)環(huán)境類型多樣，對(duì)各種環(huán)境條件具有很好的適應(yīng)性，以保證各科屬古菌群落的多樣性和物種豐度，同時(shí)為研究草地生態(tài)系統(tǒng)古菌群落結(jié)構(gòu)和物種多樣性具有重要意義。本次試驗(yàn)土壤樣本采集地為呼倫貝爾草甸草原腹地，氣候特點(diǎn)為中溫帶半干旱大陸性季風(fēng)氣候，年降水量為356 mm，降雨主要集中在7—9月份，變動(dòng)幅度較大；年平均氣溫-2.36℃，最高氣溫36.8℃，最低氣溫-48.1℃。年積溫1 580～1 860℃，無霜期112 d。土壤類型是暗栗鈣土。

土壤理化指標(biāo)比較均衡[11]，不同處理方式對(duì)古菌群落結(jié)構(gòu)和物種多樣性與豐度均有一定的影響。

土壤微生物群落功能多樣性是反映土壤生態(tài)系統(tǒng)功能與穩(wěn)定性的重要指示因子。隨著新一代高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，已成為土壤質(zhì)量評(píng)價(jià)的常規(guī)方法。但對(duì)土壤古菌群落多樣性研究的還相對(duì)較少，尤其是對(duì)草甸草原土壤中古菌群落特征分析尚未有報(bào)道，本研究通過對(duì)6個(gè)不同處理的研究區(qū)的土壤樣品進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序，根據(jù)結(jié)果對(duì)序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到優(yōu)質(zhì)序列468 904條。在97%的相似水平下進(jìn)行OTU的聚類，以獲得全部樣品在不同OTUs中的豐度信息，共有2 523個(gè)OTUs，共有的OTU為65個(gè)，占比為13.18%～20.57%。研究區(qū)的古菌被分為13個(gè)門。但不同生境古菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性方面還存在很大的不同。閆慧貞等[4]利用16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，研究了梅山島海域春季浮游古菌群落空間分布情況，結(jié)果表明該海域浮游古菌在原核群落中的相對(duì)豐度為0.6%～26.5%，浮游古菌群落由奇古菌門Marine GroupⅠ（MGⅠ）和廣古菌門Marine GroupⅡ（MGⅡ）主導(dǎo)，MGⅠ的物種組成較為單一，而MGⅡ的系統(tǒng)發(fā)育多樣性較高。張偉等[5]的研究結(jié)果表明，新疆干旱半干旱土壤環(huán)境下當(dāng)?shù)卦鷳B(tài)土壤古菌群落主要由Thaumarchaeota、SM1K20、Euryarchaeota、Aenigmarchaeota、Crenarchaeota和Marine-HydrothermalVentGroup（MHVG）等6個(gè)門組成。雖然各樣品特有OUT相差較大，但各樣品共有的核心OTU數(shù)仍高達(dá)232個(gè)，占主要部分。古菌不僅從參與多種元素的地球化學(xué)循環(huán)中獲得能量，而且成為數(shù)億年地質(zhì)形成過程中最重要的地質(zhì)營力，所以地質(zhì)生態(tài)環(huán)境的變化必定指示著古菌種群的多樣性差異。

古菌和細(xì)菌和真菌一樣，在土壤物質(zhì)循環(huán)轉(zhuǎn)化和生態(tài)系統(tǒng)平衡方面具有非常重要的作用。其作用是通過其各種功能來發(fā)揮的。目前在古菌的功能研究中，常用基于COG功能的預(yù)測(cè)分析，通過對(duì)宏基因組預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)功能分析與對(duì)應(yīng)16S預(yù)測(cè)功能分析結(jié)果的比較，表明該方法對(duì)土壤菌群功能分析的準(zhǔn)確性接近89%以上，因此該方法能非常好地反映樣本的功能基因構(gòu)成[12]。本研究顯示6個(gè)樣本在更高層級(jí)上的功能主要有25種，涉及到能量代謝、核苷酸與核酸代謝、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生、細(xì)胞代謝等多方面，表現(xiàn)出其功能的多樣性，這些多樣性的功能與細(xì)菌和真菌的功能基本一致[13-18]。表明不同微生物的功能在分子層面上具有同質(zhì)性。

5 結(jié)論

1）基于細(xì)菌群落多樣性層面，6個(gè)樣本表現(xiàn)為W2＞F2＞F1＞Y1＞W(wǎng)1＞Y2；基于物種豐度層面，6個(gè)樣本表現(xiàn)為W2＞F1＞W(wǎng)1＞F2＞Y1＞Y2。

2）基于門和屬層面，6個(gè)樣本的優(yōu)勢(shì)菌門、優(yōu)勢(shì)菌屬和其他菌門、菌屬構(gòu)成相似，但相對(duì)豐度存在一定的差異。

3）草原土壤古菌主要功能與細(xì)菌、真菌基本一致，說明基于分子層面不同微生物的功能具有同質(zhì)性。

4）個(gè)樣本土壤古菌群落結(jié)構(gòu)與功能相似，具有一定的穩(wěn)定性。植被類型、處理方式和土層深度等都是影響古菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的因素。