劉 丹，王 容，陳天烺，吳海峰，張賓賓，方 萍，陳 煒，赫文韜

(浙江海豐生物科技股份有限公司，浙江紹興 312000)

菊花()，為菊科菊屬多年生宿根草本花卉,是我國的傳統(tǒng)名花，被譽為花卉“四君子”之一。目前切花菊栽培地域廣泛，在花卉產(chǎn)業(yè)中占有重要地位，作為世界四大切花之一，在生產(chǎn)規(guī)模上居于世界各類切花之冠。切花菊又分為多頭和單頭兩大類，多頭切花菊又稱切花小菊，小菊的一個莖稈上有多個花蕾，一般為5～7個，花朵直徑6 cm以下，主蕾與側(cè)蕾長勢均衡，花期接近，呈傘形花序，觀賞價值和經(jīng)濟價值極高，在國內(nèi)和國際市場的需求量迅速增加。為了滿足市場需求，近年來，菊花栽培面積不斷擴大，但菊花的病毒病越來越嚴重。已報道侵染菊花的病毒有20余種，如番茄不孕病毒(Tomatoa spermy virus,TAV)是危害菊花的主要病毒之一。TAV 為黃瓜花葉病毒屬的成員。侵染TAV病毒的菊花植株表現(xiàn)矮化、變形、碎花、花葉、皺縮、壞死等現(xiàn)象，嚴重影響菊花的品質(zhì)和產(chǎn)量，阻礙菊花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。筆者以切花小菊“紅昌”為試材，探究菊花脫毒技術(shù)，以期為脫除菊花病毒及解決品種退化提供技術(shù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

供試脫毒材料：經(jīng)鑒定感染TAV病毒的小菊“紅昌”(采自浙江海豐花卉有限公司種植基地)，該小菊為扦插培養(yǎng)18 d后得到的小菊幼苗，處于營養(yǎng)生長時期。

病毒唑預脫毒。用一次性注射器在距離地面2 cm的小菊“紅昌”植株莖稈上注射病毒唑溶液，溶液濃度分別為0(CK)、5、10、15、20 mg/L。培養(yǎng)條件：空氣濕度為50%～75%，環(huán)境溫度為15～30 ℃，光照時間為14 h/d，光照強度為50 000～100 000 lx。培養(yǎng)期間注意防蟲防菌，培養(yǎng)30 d后得到預脫毒小菊。

外植體的無菌培養(yǎng)。選取獲得的預脫毒小菊當年生嫩枝，剪去葉片，將其莖段剪成帶4～5個芽的小段，在洗潔精水中浸泡10 min，取出將每個帶芽莖段單獨用自來水流水沖洗1 min；然后將清洗后的帶芽莖段在多菌靈1 000倍液中浸泡30 min，取出單獨用自來水流水沖洗1 min；在超凈工作臺上將清洗后的帶芽莖段在75%乙醇溶液中浸泡30 s，取出用無菌水沖洗2次；最后將沖洗后的帶芽莖段在有效氯為5%次氯酸鈉溶液中浸泡10 min，取出用無菌水沖洗6次，每次沖洗1 min，得到消毒滅菌后的莖段。將獲得的莖段切成長2～3 cm的小段，每個小段帶有1～3個腋芽，同時切除莖段兩端2～3 mm接觸藥品的部位，將其接種于含有不定芽誘導培養(yǎng)基MS(3/4大量元素)+6-BA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L的組培瓶內(nèi)進行初代培養(yǎng)。25 d繼代培養(yǎng)一次，繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+活性炭0.5 g/L。培養(yǎng)條件：溫度為(22±2) ℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為14 h/d。

熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒。將繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d得到的無菌瓶苗在光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)7 d后置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，采用晝夜變溫的方式進行熱處理，進一步提高莖尖的脫毒率。設(shè)置2種熱處理方式：處理T，熱處理35 d；第1～5天：白天(8:00—20:00)高溫28 ℃，晚上(20:00—次日8:00)低溫25 ℃；第6～12天：白天(8:00—20:00)高溫33 ℃，晚上(20:00—次日8:00)低溫28 ℃；第13—35天：白天(8:00—20:00)高溫39 ℃，晚上(20:00—次日8:00)低溫33 ℃，濕度均為30%～50%。處理T，光照時間12 h/d，光照強度3 000 lx，按晝夜溫度28～32、30～35、33～38 ℃的順序，每2 d變換1檔。然后在33～38 ℃下繼續(xù)熱處理脫毒培養(yǎng)30 d。熱處理培養(yǎng)后進行莖尖剝離。

莖尖剝離、接種與培養(yǎng)。將經(jīng)過熱處理的無菌苗在超凈工作臺上用鑷子和刀片切下菊苗頂端1～2 cm，接種于含有莖尖固定培養(yǎng)基MS+瓊脂5 g/L的培養(yǎng)皿中，以防在莖尖剝離過程中由于脫水而影響成活率(以不使用莖尖固定培養(yǎng)基直接剝離作為對照)。在40倍解剖鏡下，一手用鑷子輕輕將材料固定于視野中，另一手用11號手術(shù)刀將菊花頂芽外的幼小葉片小心依次剝離，注意操作過程中不要過早折斷莖，以免增加剝離難度，直至在解剖鏡下能看清表面光滑、呈圓盤狀輕微發(fā)亮的莖尖為止。用手術(shù)刀割取莖尖組織，大小分別為0.1～0.3、0.8、1.5、1.9 mm，然后迅速接種于莖尖誘導培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，pH 6.0，接種時輕輕放置于培養(yǎng)基表面，避免將莖尖深埋培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件：溫度為(22±2) ℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為14 h/d，30 d后統(tǒng)計莖尖成活率。

莖尖成活率=(莖尖成活數(shù)/接種莖尖總數(shù))×100%

莖尖誘導培養(yǎng)基的不同配方:CHR-1,改良MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L;CHR-2,MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L;CHR-3,ZL+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L;CHR-4,1/2B5+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L(ZL為申請公布號為“CN109258460A”發(fā)明專利中的培養(yǎng)基組成成分)。

病毒檢測。對所得的小菊植株(莖尖組織培養(yǎng)苗)進行TAV檢測，統(tǒng)計脫毒率確定脫毒效果。

脫毒率=(脫毒植株數(shù)/熱處理植株數(shù))×100%

增殖培養(yǎng)。將獲得的經(jīng)鑒定確認不攜帶TAV病毒的小菊植株接種至增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度為(22±2) ℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為14 h/d。

生根培養(yǎng)。將增殖后的脫毒植株切成2 cm左右并帶有1～3個葉芽的莖段，接種于生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度為(22±2) ℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為14 h/d。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)RT-PCR檢測，小菊“紅昌”脫毒前感染TAV的結(jié)果呈陽性(圖1)。

注：M.Marker；1.陰性對照;2.供試脫毒材料TAV病毒的檢測結(jié)果Note:M.Marker;1.Negative control;2.TAV test results of the tested virus-free material圖1 TAV病毒檢測結(jié)果Fig.1 Test result of TAV

由表1可知，采用不同濃度病毒唑?qū)π【者M行預脫毒處理，小菊的脫毒率不同，以處理③的脫毒率最高，達92.50%；CK的脫毒率最低。部分莖尖組織培養(yǎng)苗的病毒檢測結(jié)果呈陽性(圖2)，說明病毒唑預脫毒對菊花脫毒有重要作用。

表1 不同濃度病毒唑?qū)γ摱韭实挠绊?/p>

注：M.Marker;1.陰性對照;2.供試脫毒材料TAV病毒的檢測結(jié)果Note:M.Marker;1.Negative control;2.TAV test results of the tested virus-free material圖2 未經(jīng)病毒唑預脫除TAV病毒檢測結(jié)果Fig.2 Detection results of TAV virus without virazole pre removal

由表2可知，2種不同熱處理方式對小菊脫毒率的影響呈極顯著差異；處理T，病毒唑濃度及莖尖剝離大小均一致時，熱處理溫度采用25～39 ℃的方式，脫毒率極顯著高于處理T，達92.50%。因此，熱處理溫度為25～39 ℃是熱處理結(jié)合莖尖脫毒的最佳溫度。無菌瓶苗在熱處理前狀態(tài)見圖3，熱處理后狀態(tài)見圖4。

表2 不同熱處理溫度對脫毒率的影響

圖3 無菌苗熱處理前Fig.3 Sterile seedlings before heat treatment

圖4 無菌苗熱處理后Fig.4 Sterile seedlings after heat treatment

由表3可知，剝離莖尖大小為0.1～0.3 mm，莖尖誘導培養(yǎng)基為CHR-1時，莖尖的存活率最高，達53.33%。因此，莖尖誘導培養(yǎng)基CHR-1時，即改良MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L為最適合莖尖培養(yǎng)的培養(yǎng)基。莖尖培養(yǎng)30 d的狀態(tài)見圖5，莖尖培養(yǎng)60 d的狀態(tài)見圖6。

表3 不同莖尖誘導培養(yǎng)基對莖尖成活率的影響

圖5 莖尖培養(yǎng)30 d的狀態(tài)Fig.5 The state of shoot tip culture for 30 days

圖6 莖尖培養(yǎng)60 d的狀態(tài)Fig.6 The state of shoot tip culture for 60 days

由表4可知，莖尖大小為0.1～0.3 mm，莖尖誘導培養(yǎng)基為CHR-1時，小菊的脫毒率最高，達89.00%；且莖尖增大，小菊的脫毒率降低，說明莖尖越小，病毒的數(shù)量越少，越有利于小菊脫除病毒。因此，莖尖大小為0.1～0.3 mm(圖7)，有助于病毒的脫除，提高脫毒率。

由表5可知，莖尖大小相同時，剝離莖尖時采用莖尖固定培養(yǎng)基和不采用莖尖固定培養(yǎng)基的小菊莖尖存活率有著明顯差異。處理①，采用莖尖固定培養(yǎng)基，莖尖大小為0.1～0.3 mm時，莖尖存活率最高，達60.00%。由此說明，剝離莖尖時，采用莖尖固定培養(yǎng)基能提高莖尖的存活率。

表4 不同大小莖尖對脫毒率的影響

圖7 0.1～0.3 mm的莖尖Fig.7 0.1-0.3 mm stem tip

表5 莖尖固定培養(yǎng)基對莖尖成活率的影響

經(jīng)病毒唑預脫毒，熱處理結(jié)合莖尖剝離及莖尖培養(yǎng)得到脫毒無菌苗，通過RT-PCR檢測無菌苗是否脫除TAV：首先提取待測無菌苗的RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；以cDNA為模板，采用TAV-F1和TAV-R1進行第1輪PCR反應(yīng)，得到第1輪PCR產(chǎn)物；以第1輪PCR產(chǎn)物為模板，采用TAV-F2和TAV-R2進行第2輪PCR，得到第2輪PCR產(chǎn)物(終產(chǎn)物)。引物序列如下：

TAV-F1：CCATCCCTTCAACATCCGAC

TAV-R1：GTTGAAGCGGAAGGAATACG

TAV-F2：TTATTGCTGGGAAGAAGTGTCG

TAV-R2：CGGTGGGAACGTGCTGAT

圖8為脫毒后植株病毒檢測結(jié)果，結(jié)果顯示呈陰性。

注：M.Marker;1.陰性對照;2.莖尖組織培養(yǎng)苗TAV檢測Note:M.Marker;1.Negative control;2.TAV test results of shoot tip tissue culture seedling圖8 脫毒后TAV病毒檢測結(jié)果Fig.8 Test results of TAV virus after virus removal

將獲得的經(jīng)鑒定后確認不攜帶TAV病毒的小菊植株接種至增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，在溫度為(22±2) ℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為14 h/d的條件下培養(yǎng)30 d后，得到增殖后的脫毒植株(圖9)，葉色濃綠，長勢較好。

圖9 增殖狀態(tài)的脫毒苗Fig.9 Virus free seedling in proliferation

將增殖后的脫毒植株切成2 cm左右并帶有1～3個葉芽的莖段，接種于生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)5～7 d后可明顯觀察到根系長出，在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后，得到脫毒生根苗(圖10)，植株健壯，根系發(fā)達。

圖10 生根狀態(tài)的脫毒苗Fig.10 Virus free seedlings in rooting state

3 討論與結(jié)論

目前，有關(guān)菊花脫除病毒技術(shù)的研究已經(jīng)有大量報道。國內(nèi)外報道的侵染菊花的病毒種類多，特點不同，脫除難易程度也不同，因此不同的脫毒方法和病毒檢測技術(shù)不斷被研究和分析。何旭君等以“增城蜜菊”無菌瓶苗為材料，對脫除菊花B病毒(Chrysanthemum virus B，CVB)和番茄不孕病毒(TAV)進行了研究，得出最佳莖尖誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.1 mg/L+椰子汁100 ml/L+蔗糖30 g/L，誘導率為52.67%的結(jié)論，而該研究的最佳莖尖誘導培養(yǎng)基為改良MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L，莖尖的成活率為53.33%，與何旭君等研究的誘導率相差不多。宋瑞琳等以切花菊為材料，采用熱處理結(jié)合2次莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)脫除TAV，莖尖取0.5～1.0 mm，熱處理溫度白天40 ℃，夜間30 ℃，脫毒率達83.3%～90.00%；而該研究的熱處理溫度為25～39 ℃，莖尖大小為0.1～0.3 mm，脫毒率略高于前者，為89.00%～92.50%。魏進莉研究結(jié)果表明，剝?nèi)〉那o尖大小在0.1～0.3 mm時，病毒可100%被脫除，且與該研究中隨著剝?nèi)∏o尖大小的增大，脫毒效果降低結(jié)論一致。吳丹等以莖尖分生組織培養(yǎng)結(jié)合熱處理或病毒唑處理脫除“滁菊”病毒效果明顯，與該研究采用病毒唑10 mg/L進行預脫毒處理的結(jié)果類似。該試驗的脫毒方法可為菊花的母本復壯和病毒脫除提供技術(shù)參考。