ETT2結(jié)構(gòu)基因epaPQR對(duì)禽致病性大腸桿菌生物學(xué)特性及致病性的影響

邵 穎，傅丹丹，吳曉妍，谷 一，宋祥軍，涂 健，祁克宗

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230036)

禽致病性大腸桿菌(avian pathogenic, APEC)屬于腸外致病性大腸桿菌(extraintestinal pathogenic, ExPEC)，引起家禽持續(xù)感染并引發(fā)多系統(tǒng)疾病，常經(jīng)呼吸道定殖感染，引起家禽的氣囊炎、腹膜炎、輸卵管炎、蜂窩織炎以及敗血癥等，嚴(yán)重影響?zhàn)B禽業(yè)的養(yǎng)殖成本和產(chǎn)品質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，APEC與人源ExPEC具有很高的同源性，表明APEC具有潛在的人獸共患病風(fēng)險(xiǎn)。因此，加強(qiáng)對(duì)禽致病性大腸桿菌的致病研究，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全都具有重大意義。

大腸桿菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)2(Type Ⅲ secretion systems 2, ETT2) 又稱ETT2毒力島，與沙門(mén)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)SPI-1毒力島同源，其作為T(mén)3SS的主要毒力基因簇，參與多種毒力因子的調(diào)控。研究表明，尿道致病性大腸桿菌(uropathogenic，UPEC)中完整的ETT2毒力島缺失會(huì)顯著降低細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力，降低鞭毛蛋白、菌毛和表面蛋白、外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMV)的分泌，并影響細(xì)菌耐藥性以及改變細(xì)胞行為。ETT2 ATPase基因的缺失導(dǎo)致APEC運(yùn)動(dòng)能力降低，細(xì)菌鞭毛受損，表面菌毛增加等。ETT2轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子YqeI及EivF調(diào)控APEC運(yùn)動(dòng)性、生物被膜形成的能力以及細(xì)菌毒力。由此可見(jiàn)，ETT2毒力島在禽致病性大腸桿菌的生物學(xué)特性及致病性中發(fā)揮著重要作用。

ETT2基因簇由、、、、基因組成(圖1)，這5個(gè)基因被認(rèn)為是ETT2注射裝置假定的結(jié)構(gòu)基因的重要組成部分，與沙門(mén)菌SPI-1注射裝置的基因簇的基底裝置內(nèi)環(huán)的5個(gè)組成基因、、、、具有高度同源性。在腸出血性大腸桿菌O157: H7中，與沙門(mén)菌SPI-1中功能相似的基因的缺失會(huì)阻斷效應(yīng)蛋白NleB1和NleB2易位到宿主細(xì)胞中，該基因簇在細(xì)菌分泌蛋白的過(guò)程中發(fā)揮一定的作用并影響細(xì)菌致病性。而ETT2基因簇在大腸桿菌生物學(xué)特性及致病性中的作用目前尚不清楚。

圖1 大腸桿菌毒力島ETT2模式圖Fig.1 Physical map of the ETT2 element of Escherichia coli

本研究通過(guò)CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，構(gòu)建ETT2基底裝置基因的缺失株和回復(fù)株，對(duì)其生長(zhǎng)性能、運(yùn)動(dòng)性、生物被膜形成等生物學(xué)特性及致病作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，探究其對(duì)APEC生物學(xué)特性及致病性的影響，為進(jìn)一步了解APEC的致病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與引物設(shè)計(jì)

禽致病性大腸桿菌AE81菌株及質(zhì)粒pCas(卡那霉素抗性)、pTarget(大觀霉素抗性)由獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。PrimeScriptRT Master Mix (Perfect Real Time) 購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，PowerUpSYBRGreen Master Mix購(gòu)自Thermo公司。

利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)、、三個(gè)基因共同缺失的的檢測(cè)引物以及 CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)構(gòu)建基因缺失株和回復(fù)株所需要的引物。相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。

表1 epaPQR基因缺失的引物序列Table 1 Primer sequence for epaPQR gene knocking out

1.2 epa基因在AE81和腸出血性大腸桿菌O157： H7中序列比對(duì)及功能預(yù)測(cè)

通過(guò)NCBI將AE81中基因簇所包含的5個(gè)基因(、、、、)序列與腸出血性大腸桿菌O157： H7(GenBank: NC_002695.2)中基因簇進(jìn)行同源性分析。利用生物學(xué)軟件Phyre2進(jìn)行蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)，篩選置信度較高的疑似結(jié)構(gòu)基因(Phyre2: http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)。

1.3 基因缺失株AE81ΔepaPQR的構(gòu)建

利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，以pTarget質(zhì)粒為模板，sgRNA-F/R為引物擴(kuò)增sgRNA片段。以AE81基因組為模板，-up-F/R和-down-F/R為引物分別擴(kuò)增的上、下游序列片段。將以上3個(gè)片段為模板，以sgRNA-F/-down-R為引物，PCR連接成sgRNA特異性的結(jié)合靶標(biāo)序列，引導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)特異DNA序列切割使DNA雙鏈斷裂，利用非同源末端鏈接(non-homologous end joining，NHEJ)修復(fù)機(jī)制，隨機(jī)缺失或插入堿基造成移碼突變，以實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除。將此連接產(chǎn)物與pTarget質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切，鑒定正確后進(jìn)行膠回收，對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α中培養(yǎng)，驗(yàn)證重組質(zhì)粒pTarget-是否構(gòu)建成功。

將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入含有pCas質(zhì)粒的AE81感受態(tài)細(xì)胞中，涂布至含有卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h。將驗(yàn)證正確的陽(yáng)性菌株培養(yǎng)至OD為0.2，按照1∶150比例加入IPTG，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日劃菌至無(wú)抗固體培養(yǎng)基中，42 ℃培養(yǎng)，以消除抗性，用引物pCas-F/R和pTarget-F/R進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.4 基因回復(fù)株C-AE81ΔepaPQR的構(gòu)建

以AE81基因組為模板，-RI-F/-HI-R為引物，擴(kuò)增含有酶切位點(diǎn)的基因片段，將片段和pSTV28質(zhì)粒進(jìn)行酶切并利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，化轉(zhuǎn)至DH5α中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSTV28-，PCR篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。將pSTV28-質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入AE81Δ感受態(tài)細(xì)胞中37 ℃培養(yǎng)。用M13通用引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證并測(cè)序。

1.5 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

挑取3株細(xì)菌AE81、AE81Δ和C-AE81Δ的單克隆接種至液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min過(guò)夜培養(yǎng)，次日接種至新的液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到OD為1.0，然后1∶200轉(zhuǎn)移至新鮮LB肉湯中，每隔1 h用酶標(biāo)儀測(cè)量 OD，直到細(xì)菌生長(zhǎng)到穩(wěn)定期。

1.6 運(yùn)動(dòng)能力的檢測(cè)

挑取3株細(xì)菌AE81、AE81Δ和C-AE81Δ單克隆培養(yǎng)至OD為1.0，用滅菌PBS溶液洗滌2次，調(diào)整OD為2.0。然后滴加2 μL菌液點(diǎn)到瓊脂粉含量2.5 g·L的LB半固體培養(yǎng)基中央，37 ℃靜置培養(yǎng)8 h后觀察結(jié)果，根據(jù)運(yùn)動(dòng)圈的大小，比較菌株運(yùn)動(dòng)能力的差異。

1.7透射電鏡觀察鞭毛形態(tài)

將野生株AE81以及AE81Δ和C-AE81Δ在LB中于37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，用PBS洗滌3次后，將細(xì)菌置于200目銅鏡下，在室溫下短暫孵育。然后將細(xì)菌用2%醋酸鈾酰水溶液染色30 s，待樣品干燥后，用透射電子顯微鏡(日立HT-7700，日本)觀察3株細(xì)菌鞭毛的形態(tài)。

1.8 生物膜形成能力的檢測(cè)

挑取3株細(xì)菌AE81、AE81Δ和C-AE81Δ培養(yǎng)至OD為1.0，用新LB培養(yǎng)基重懸洗滌兩次，并調(diào)整OD為1.0，用LB培養(yǎng)基將菌液稀釋50倍，添加到96孔板中，每組重復(fù)3次，LB培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，分別在25 ℃和37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。用PBS洗滌并干燥兩次，再用0.1%結(jié)晶紫染色約20 min，用PBS洗滌并干燥兩次。將生物膜溶解在95%酒精中，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定OD吸光值，比較3株細(xì)菌生物被膜形成能力差異。

1.9 抗血清殺菌能力的檢測(cè)

挑取3株細(xì)菌AE81、AE81Δ和C-AE81Δ培養(yǎng)到OD為1.0，用無(wú)菌PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)菌數(shù)為1×10CFU·mL。用PBS將SPF雞血清稀釋至5%、12.5%、25%、50%和100%，將56 ℃水浴30 min的滅活血清做陰性對(duì)照。不同梯度的血清與細(xì)菌混勻后，37 ℃靜置培養(yǎng)30 min，梯度稀釋，掛板計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。

1.10 組織載菌量測(cè)定

將野生株AE81和缺失株AE81Δ培養(yǎng)到OD為1.0，用無(wú)菌PBS洗滌3次并重懸菌體。每組細(xì)菌感染3只羅曼蛋雞，每只攻毒劑量1×10CFU·mL。感染24 h后無(wú)菌條件下分別取心、肝、肺和脾組織，等比例加入無(wú)菌PBS，組織研磨儀研磨并倍比稀釋，用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。

1.11 熒光定量檢測(cè)鞭毛相關(guān)基因的表達(dá)

為探究基因?qū)Ρ廾淖饔?，選擇鞭毛結(jié)構(gòu)基因(、、、)和輸出蛋白基因()及一級(jí)調(diào)控操縱子(、)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。將野生株AE81與缺失株AE81Δ培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，利用TRIzol法提取細(xì)菌RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合成。參照PowerUpSYBRGreen Master Mix試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，每個(gè)樣本重復(fù)3次。鞭毛基因熒光引物見(jiàn)表2，以16為內(nèi)參基因。

表2 鞭毛基因熒光引物Table 2 The primers of flagellar genes

2 結(jié) 果

2.1 epaPQR基因的功能預(yù)測(cè)

通過(guò)Phyre2預(yù)測(cè)基因簇蛋白的結(jié)構(gòu)與功能(圖2A、2B和2C)，結(jié)果顯示，基因簇5個(gè)基因中的、和的結(jié)構(gòu)域分別以92%、99%和93%的置信度在其全結(jié)構(gòu)范圍內(nèi)與大腸桿菌鞭毛三型分泌系統(tǒng)核心輸出裝置的結(jié)構(gòu)域相一致。故選定此3個(gè)基因作為整體來(lái)探究其功能。

圖2 epaP(A)、epaQ(B)和epaR(C)蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)結(jié)果及三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 Prediction results and tertiary structure of epaP (A), epaQ (B) and epaR (C) proteins

2.2 基因缺失株AE81ΔepaPQR及其回復(fù)株C-AE81ΔepaPQR的構(gòu)建與鑒定

通過(guò)CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒pTarget，以-in-F/R為引物，PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒擴(kuò)增片段大小為2 101 bp，pTarget原始質(zhì)粒大小為800 bp(圖3A)，條帶大小相差1 391 bp，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

A. 重組質(zhì)粒驗(yàn)證，M. Marker；1. 重組pTarget質(zhì)粒，引物pTarget-F/R；2. pTarget質(zhì)粒，引物pTarget-F/R; 3. 陰性對(duì)照。B. 缺失驗(yàn)證，M. Marker；1. AE81菌株，引物epaPQR-in-F/R；2. AE81ΔepaPQR菌株，引物epaPQR-in-F/R；3. 陰性對(duì)照；4. AE81菌株，引物epaPQR-out-F/R；5. AE81ΔepaPQR菌株，引物epaPQR-out-F/R；6. 陰性對(duì)照A. Verification of recombinant, M. marker; 1. Recombinant pTarget plasmid, primer pTarget-F/R; 2. pTarget plasmid, primer pTarget-F/R; 3. Negative control. B. Verification of deletion, M. marker; 1. AE81 strain, primer epaPQR-in-F/R; 2. AE81ΔepaPQR strain, primer epaPQR-in-F/R; 3. Negative control; 4. AE81 strain, primer epaPQR-out-F/R; 5. AE81ΔepaPQR strain, primer epaPQR-out-F/R; 6. Negative control圖3 pTarget重組質(zhì)粒驗(yàn)證(A)及缺失驗(yàn)證(B)Fig.3 Verification of pTarget recombinant plasmid (A) and deletion (B)

通過(guò)內(nèi)、外側(cè)引物驗(yàn)證基因缺失株(圖3B)。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，通過(guò)內(nèi)側(cè)引物-in-F/R驗(yàn)證，野生株AE81大小為261 bp，缺失株和陰性都無(wú)條帶(孔道1～3)；通過(guò)外側(cè)引物-out-F/R驗(yàn)證基因缺失株，AE81野生株大小為2 791 bp，缺失株大小為1 400 bp(孔道4～6)，缺失株相較于野生株減少了1 391 bp，證明基因缺失成功，缺失株命名為AE81Δ。

通過(guò)pSTV28質(zhì)粒在AE81Δ中構(gòu)建出回復(fù)株，用引物M13-F/R進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，AE81Δ缺失株無(wú)條帶，而回復(fù)株出現(xiàn)1 391 bp條帶(圖4)，證明回復(fù)株構(gòu)建成功，回復(fù)株命名為C-AE81Δ。

M. Marker；1. AE81ΔepaPQR菌株，引物M13-F/R；2. C -AE81ΔepaPQR菌株，引物M13-F/RM. Marker; 1. AE81ΔepaPQR strain, primer M13-F/R; 2. C-AE81ΔepaPQR strain, primer M13-F/R圖4 回復(fù)株的驗(yàn)證Fig.4 Validation of complement strain

2.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

AE81、AE81Δ和C-AE81Δ3株菌在17 h內(nèi)的生長(zhǎng)趨勢(shì)相同(>0.05，圖5)，說(shuō)明基因的缺失不影響其生長(zhǎng)特性。

圖5 生長(zhǎng)曲線測(cè)定Fig.5 Growth curves determination

2.4 生物膜形成能力的測(cè)定

生物膜形成能力的結(jié)果表明，與野生株AE81相比，缺失株AE81Δ和回復(fù)株C-AE81Δ的生物膜形成能力的差異不顯著(>0.05，圖6)。

A.結(jié)晶紫染色法測(cè)定APEC生物被膜的形成；B. 酶標(biāo)儀測(cè)定的生物被膜形成的吸光值。ns. 差異不顯著(P>0.05)A. Crystal violet staining method was used to determine the formation of APEC biofilm; B. The absorbance value of biofilm formation was determined by enzyme reader. ns. No significant difference (P>0.05)圖6 生物被膜形成能力檢測(cè)Fig.6 Biofilm formation ability test

2.5 運(yùn)動(dòng)能力的測(cè)定

對(duì)3株菌的運(yùn)動(dòng)能力(圖7)檢測(cè)結(jié)果表明，野生株AE81、缺失株AE81Δ和回復(fù)株C-AE81Δ的運(yùn)動(dòng)圈直徑平均值分別為65.40、32.75、54.21 mm，在37 ℃下，缺失株AE81Δ的運(yùn)動(dòng)圈相較于野生株AE81顯著減?。换貜?fù)株C-AE81Δ的運(yùn)動(dòng)圈明顯回復(fù)。因此基因的缺失會(huì)降低AE81的運(yùn)動(dòng)能力。

圖7 運(yùn)動(dòng)能力的比較Fig.7 Comparison of motility ability

2.6 透射電鏡觀察鞭毛形態(tài)

通過(guò)透射電鏡觀察3株菌的鞭毛形態(tài)(圖8)。結(jié)果表明，野生株AE81有數(shù)根長(zhǎng)而彎曲的鞭毛；相較于野生株AE81，缺失株AE81Δ鞭毛的數(shù)量明顯減少；回復(fù)株C-AE81Δ鞭毛數(shù)量相較于缺失株明顯增加，且與野生株AE81鞭毛形態(tài)相似。透射電鏡對(duì)鞭毛形態(tài)的觀察與“2.5”中運(yùn)動(dòng)能力的測(cè)定結(jié)果趨勢(shì)一致，進(jìn)一步證明基因影響AE81的運(yùn)動(dòng)能力。

圖8 透射電子顯微鏡下的鞭毛形態(tài)Fig.8 Flagella under the transmission electron microscope

2.7 熒光定量PCR檢測(cè)鞭毛相關(guān)基因的表達(dá)

通過(guò)熒光定量PCR驗(yàn)證鞭毛相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，與野生株AE81相比，缺失基因后，缺失株中鞭毛一級(jí)調(diào)控操縱子和的表達(dá)水平顯著下調(diào)(<0.05)；鞭毛T3SS的結(jié)構(gòu)基因、、、的表達(dá)水平的顯著下調(diào)(<0.05)，的表達(dá)水平下調(diào)但差異不顯著(>0.05)；鞭毛輸出蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)(<0.05)?；貜?fù)株C-AE81Δ的基因表達(dá)水平基本恢復(fù)(圖9)。表明基因通過(guò)影響鞭毛基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性。

*. P<0.05，下同*. P<0.05, the same as below圖9 鞭毛相關(guān)基因熒光定量Fig.9 Fluorescence quantification of flagellum-related gene

2.8 抗血清殺菌能力的檢測(cè)

在不同濃度血清中3株菌的存活能力檢測(cè)結(jié)果表明(圖10)，3株菌在PBS和滅活血清中的存活能力無(wú)差異(>0.05)， 缺失株AE81Δ在不同濃度的血清中存活能力相較于野生株都顯著增強(qiáng)(<0.05)，且在5%、12.5%、25%濃度中存活能力極顯著高于其余2菌株(<0.01)，說(shuō)明基因缺失后其抗血清殺菌能力顯著增強(qiáng)(<0.05)。

***. P<0.001；**. P<0.01。下同***. P<0.001; **. P<0.01. The same as below圖10 抗血清殺菌數(shù)據(jù)圖Fig.10 Antiserum bactericidal data graph

2.9 體內(nèi)分布的檢測(cè)

通過(guò)體內(nèi)分布試驗(yàn)檢測(cè)野生株和缺失株菌在雛雞體內(nèi)心、肝、脾和肺4個(gè)器官的定殖情況(圖11)。結(jié)果表明，與野生株AE81相比，基因的缺失造成AE81在雛雞心、肝、脾和肺器官的定殖數(shù)量顯著減少，尤其在脾中定殖量較少。脾作為免疫器官，會(huì)影響細(xì)菌在機(jī)體內(nèi)存活能力。

圖11 野生株AE81和缺失株AE81ΔepaPQR感染雛雞的組織載菌量Fig.11 Tissue bacteria load after infected with AE81 and AE81ΔepaPQR strains

3 討 論

ETT2作為T(mén)3SS的主要毒力基因簇，編碼包括(3721-3726)、(3727-3734)、(3707-3712)等至少35個(gè)開(kāi)放閱讀框，參與多種毒力因子的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，ETT2毒力島編碼的蛋白影響大腸桿菌毒素和黏附素的分泌或運(yùn)輸；在產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌中許多毒力基因的表達(dá)和分泌受到ETT2毒力島的影響。在腸出血性大腸桿菌中，ETT2毒力島缺失后導(dǎo)致細(xì)菌鞭毛蛋白和菌毛蛋白的分泌減少?？梢?jiàn)ETT2對(duì)于細(xì)菌生物特性及毒力具有重要作用。

生物被膜是一種由胞外多糖、分泌蛋白和DNA組成的表面相關(guān)微生物的異質(zhì)聚集體，可幫助細(xì)菌增強(qiáng)自身抵抗力以及抵抗外部環(huán)境壓力。在本研究中，基因的缺失顯著降低其運(yùn)動(dòng)能力，對(duì)其生物被膜形成能力無(wú)顯著改變。有研究顯示，運(yùn)動(dòng)性對(duì)生物膜的形成并非必不可少，且細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性不總是促進(jìn)生物膜形成。ETT2分子伴侶基因缺失后導(dǎo)致其運(yùn)動(dòng)性顯著增加，生物被膜形成能力顯著下降。因此，運(yùn)動(dòng)能力在生物被膜形成過(guò)程中起著非常重要的作用，但也受到環(huán)二核苷酸和某些代謝調(diào)控蛋白等其他因素的影響。

鞭毛是細(xì)菌重要的毒力因子，在細(xì)菌感染過(guò)程中發(fā)揮多種作用。細(xì)菌可通過(guò)旋轉(zhuǎn)鞭毛來(lái)運(yùn)動(dòng)，使它們能夠克服表面環(huán)境中的靜電斥力和液體阻力，從而增加它們與細(xì)胞表面相互作用的機(jī)會(huì)，可促進(jìn)細(xì)菌穿過(guò)小腸黏膜黏附于宿主細(xì)胞或者非生物表面，并且可以維持和擴(kuò)散感染。研究表明，UPEC缺失2基因后，導(dǎo)致鞭毛蛋白的分泌顯著減少，血清存活能力增強(qiáng)，運(yùn)動(dòng)性減弱。ETT2基因簇中的缺失導(dǎo)致APEC運(yùn)動(dòng)能力減弱，且鞭毛和運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因,的表達(dá)水平顯著下調(diào)。在本研究中，透射電鏡中觀察到缺失株鞭毛數(shù)量顯著減少，可能通過(guò)影響鞭毛數(shù)量從而調(diào)控細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性；qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示，缺失基因后，鞭毛一級(jí)調(diào)控操縱子和、結(jié)構(gòu)基因、、、和鞭毛輸出蛋白的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)。其中鞭毛蛋白是鞭毛的主要成分，其表達(dá)由鞭毛一級(jí)調(diào)控子FlhD激活。

APEC主要通過(guò)呼吸道感染禽類(lèi)，然后擴(kuò)散到全身，導(dǎo)致家禽的菌血癥和死亡。研究表明，在789中ETT2的缺失導(dǎo)致細(xì)菌在1日齡雞中的毒力顯著減弱；ETT2 ATPase的缺失在鴨體內(nèi)毒力和存活率減弱。本研究發(fā)現(xiàn)，的缺失會(huì)降低APEC在雞體內(nèi)的定殖，減弱對(duì)APEC的致病作用。但在抗血清能力試驗(yàn)中，的缺失造成AE81在血清中的存活能力增強(qiáng)。在APEC中，缺失ETT2轉(zhuǎn)錄因子基因，增強(qiáng)了細(xì)菌在血清中的存活。缺失轉(zhuǎn)錄因子減弱APEC在血清中存活能力。ETT2基因簇的缺失增加了UPEC對(duì)血清的敏感性。細(xì)菌的許多特性都有助于其血清抗性，包括囊泡、OmpA和LPS等，但基因是否通過(guò)影響這些因素而導(dǎo)致其缺失株血清抗性增強(qiáng)還尚不清楚，還需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

ETT2結(jié)構(gòu)基因參與調(diào)控APEC的鞭毛形成及其相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，影響APEC抗血清殺菌能力以及在雛雞體內(nèi)不同器官的定殖能力，表明在APEC致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，為深入探究ETT2功能和APEC致病機(jī)制提供參考。