賈切，劉亞博,*，王飛，姚明華，余楚英，沈勝,3，劉奕清,，李寧

1.長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，長江大學(xué)香辛作物研究院，湖北 荊州 434025 2.蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，湖北 武漢 430064 3.海南大學(xué)園藝學(xué)院，海南 ?？?570228

長鏈脂酰輔酶A合成酶(Long-Chain Acyl-Coenzyme A Synthetase，LACS)是ACS家族中的一類酶，在幾乎所有脂肪酸衍生分子的生物代謝途徑中都具有重要的作用[1]。LACS將游離脂肪酸酯化成?；o酶A，這是大多數(shù)脂肪代謝酶利用脂肪酸所必需的關(guān)鍵活化步驟。LACS通過2個步驟催化?；o酶A的形成。首先游離脂肪酸通過ATP的焦磷酸分解轉(zhuǎn)化為酰基-AMP中間體，稱為腺苷；然后腺苷酸酯的活性羰基碳與輔酶A的硫醇基團(tuán)偶聯(lián)，釋放AMP和?；o酶A最終產(chǎn)物[2]。酶結(jié)合腺苷酸的形成機(jī)制在生物體中廣泛存在，這種機(jī)制上的相似性反映在酶的氨基酸基序的保守上，特別是一個基序(ProSite PS00455)非常保守，也是AMP-binding超家族所共有的氨基酸保守基序，此外AMP-binding超家族還有1個保守的ACS信號基序[1,3]。LACS家族成員的蛋白質(zhì)序列中均具有AMP-binding結(jié)構(gòu)域。

LACS在脂類生物合成中的作用在細(xì)菌[4,5]、酵母菌[6]、綠藻[7]、哺乳動物細(xì)胞[8]和植物[1,9-11]中被廣泛研究。在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中共鑒定出9個LACS基因，分別定位于擬南芥的不同細(xì)胞器中，均參與了脂肪酸衍生分子的生物合成途徑。AtLACS1～AtLACS3參與脂肪酸的跨膜移動和角質(zhì)層生物合成[9,12-14]，AtLACS4和AtLACS9在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和葉綠體之間的脂質(zhì)運(yùn)輸中具有很強(qiáng)的重疊功能[15]，AtLACS1、AtLACS2、AtLACS4、AtLACS8和AtLACS9均與蠟質(zhì)合成有關(guān)，并影響表皮脂質(zhì)代謝[12,16]；AtLACS1和AtLACS9還參與種子油脂的合成，AtLACS6和AtLACS7參與脂肪酸的β-氧化[17]。AtLACSs的表達(dá)具有組織特異性，AtLACS5在花中特異表達(dá)[1]，AtLACS1、AtLACS2、AtLACS4和AtLACS9在的種子中表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平。對大豆、向日葵等作物中LACS家族的研究表明，其在脂肪酸代謝、角質(zhì)和表皮蠟合成、花粉涂層形成等多個生化過程中起著關(guān)鍵作用[11, 16, 18, 19]。此外，LACS基因在植物逆境脅迫中也具有重要作用，角質(zhì)和表皮蠟質(zhì)的積累有助于提高植物對滲透脅迫、病原菌侵染等的耐受性[20-22]。與其他作物相比，在辣椒中LACS家族基因的功能尚不明確。本研究擬利用生物信息學(xué)分析方法在辣椒全基因組范圍內(nèi)鑒定CaLACS基因家族，分析其染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)、保守基序等，并分析CaLACS基因在辣椒不同組織和非生物逆境脅迫下的表達(dá)模式，以期為后續(xù)利用分子生物學(xué)手段深入研究CaLACS基因家族在辣椒脂代謝及非生物脅迫中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 辣椒CaLACS基因家族的鑒定

從茄科作物基因組網(wǎng)站SGN(https://solgenomics.net/)下載辣椒‘Zunla-1’參考基因組信息，Ensembl Plants在線數(shù)據(jù)庫下載擬南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryzasativa)參考基因組信息。在Pfam數(shù)據(jù)庫中下載LACS基因家族保守結(jié)構(gòu)域AMP-binding(PF00501)的種子序列，利用HMMER3.0軟件對‘Zunla-1’基因組功能注釋的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行本地化檢索。對所得的結(jié)果分別在Pfam(http://pfam.xfam.org/)和SMART數(shù)據(jù)庫(http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測，選擇具有AMP-binding結(jié)構(gòu)域的成員進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2 CaLACS蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析、染色體定位

利用ExPASy ProtParam在線程序(https://web.expasy.org/protparam/)對篩選到的基因進(jìn)行氨基酸數(shù)目、分子量和等電點(diǎn)等理化性質(zhì)預(yù)測。通過Cell-PLoc在線程序(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/)對CaLACS基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。憑借Sequence Manipulation Suite在線程序(http://www.detaibio.com/)對CaLACS蛋白質(zhì)親水性進(jìn)行分析。根據(jù)辣椒‘Zunla-1’基因組文件信息，利用TBtools軟件[23]對辣椒CaLACS基因家族進(jìn)行染色體位置分析。

1.3 進(jìn)化樹、基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

利用Cluster omega在線程序(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)，進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的多重序列比對分析、構(gòu)建鄰接樹，研究辣椒與雙子葉植物擬南芥和單子葉植物水稻間LACS基因家族的進(jìn)化關(guān)系。根據(jù)參考基因組GFF3文件，分析CaLACS的基因結(jié)構(gòu)。利用MEME(http://meme-suite.org/)軟件分析辣椒CaLACS基因家族成員保守基序(motif)類型和排列順序，獲得基因家族基序特點(diǎn)。利用GeneDoc(Version 2.7)軟件繪制多重序列比對圖，TBtools軟件[23]繪制相關(guān)基因結(jié)構(gòu)和保守基因結(jié)構(gòu)圖。

1.4 順式作用元件分析

提取CaLACS基因起始密碼子上游2000bp序列，提交至在線網(wǎng)站PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測基因啟動子區(qū)域順式作用元件，TBtools軟件[23]進(jìn)行可視化分析。

1.5 基因表達(dá)模式分析

1.5.1 材料處理

將辣椒耐鹽自交系‘H1023’和鹽敏感自交系‘XWHJ-M’分別用清水噴施對照與0.25mol/L NaCl處理3h、3d后取樣，樣品液氮速凍后研磨成粉，于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 熒光定量PCR分析

使用TRIzol試劑(Invitrogen，USA)提取總RNA。使用 HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Vazyme，南京)進(jìn)行cDNA合成。使用Primer Premier 3.0在線軟件設(shè)計 qRT-PCR引物(見表1)，以辣椒CaUBI3為內(nèi)參基因。使用ChamQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，南京)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30s，95℃變性10s，60℃退火30s和72℃延伸20s，40個循環(huán)。重復(fù)3次。采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達(dá)量，使用TBtools軟件[23]繪制表達(dá)熱圖。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.5.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

辣椒‘6421’不同組織表達(dá)譜數(shù)據(jù)來源于PepperHub在線數(shù)據(jù)庫[24，25]，不同非生物脅迫處理(NaCl、低溫、熱脅迫)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)來源PepperHub在線數(shù)據(jù)庫。分析不同轉(zhuǎn)錄組試驗(yàn)中CaLACS基因家族的表達(dá)模式，TBtools軟件[23]繪制表達(dá)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒LACS基因家族的鑒定、染色體定位與理化特征分析

以‘Zunla-1’為參考基因組從中共鑒定到10個CaLACS基因。在10個CaLACSs中，有7個基因被定位到辣椒辣椒1、3、4、7、8、9號染色體上(見圖1)，而CALACS1、CALACS2和CALACS3未被定位在染色體上。10個CaLACSs基因編碼區(qū)序列的長度在1215～2172bp之間，編碼的蛋白氨基酸數(shù)量在404～723之間，蛋白分子質(zhì)量在45.34～79.47ku之間，等電點(diǎn)在6.13～8.81之間，蛋白親水性在-0.297～0.012之間，亞細(xì)胞定位預(yù)測大多數(shù)蛋白僅存在于過氧化物酶體中，CaLACS2編碼的蛋白還存在于葉綠體中(見表2)。

圖1 ‘Zunla-1’辣椒LACS基因家族的染色體定位Fig.1 Chromosome mapping of LACS gene family in pepper ‘Zunla-1’

表2 ‘Zunla-1’辣椒LACS基因家族的基本信息Table 2 Basic information of LACS gene family in pepper variety ‘Zunla-1’

2.2 辣椒LACS基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化與基因結(jié)構(gòu)分析

構(gòu)建辣椒和單子葉植物擬南芥、雙子葉植物水稻等28個LACS基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖2)，結(jié)果表明，3個物種的LACSs基因可劃分為8個亞家族：Group Ⅰ包括3個CaLACS基因，分別是CaLACS8、CaLACS10和CaLACS7；Group Ⅱ包括CaLACS6和CaLACS1，Group Ⅲ包括CaLACS4；Group Ⅴ和Group Ⅶ僅包含辣椒LACS基因，分別包含1個和3個CaLACS基因；Group Ⅵ和Group Ⅷ不包括辣椒CaLACS基因，Group Ⅵ只包含擬南芥AtLACS基因，而Group Ⅷ只包括水稻OsLACS基因；除Group Ⅲ中的CaLACS4和LOCOs05g04170位于同一分支外，總體上單、雙子葉植物的LACS形成了不同的亞組分支。

圖2 ‘Zunla-1’辣椒與擬南芥和水稻的LACS基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of LACS gene family in pepper ‘Zunla-1’ with Arabidopsis thaliana and rice

對CaLACS、AtLACS和OsLACS的基因結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域分析表明(見圖3)，劃分在同一亞組的CaLACS、AtLACS和OsLACS的內(nèi)含子和外顯子數(shù)目基本一致，區(qū)別主要體現(xiàn)在長度上；CaLACS、AtLACS和OsLACS的蛋白序列均具有LACS基因家族的保守結(jié)構(gòu)域AMP-binding結(jié)構(gòu)域(motif 5)、AFD class Ⅰ超家族。Group Ⅰ中LOCOs11g06880由motif 13和motif 3構(gòu)成PLN02387結(jié)構(gòu)域，其他成員由motif 16和motif 3構(gòu)成PLN02387結(jié)構(gòu)域；Group Ⅱ中成員均具有motif 17和motif 3構(gòu)成的PLN02736結(jié)構(gòu)域；Group Ⅲ中成員均具有motif 20和motif 3構(gòu)成的PLN02430結(jié)構(gòu)域；Group Ⅳ成員具有motif 20和motif 3構(gòu)成的PLN02861結(jié)構(gòu)域，Group Ⅴ、Group Ⅵ、Group Ⅶ與Group Ⅷ中除CALACS2由motif 8和motif 3構(gòu)成PLN02614結(jié)構(gòu)域與CALACS3由motif 13和motif 3構(gòu)成PLN02614結(jié)構(gòu)域外，其他成員均由motif 20和motif 3構(gòu)成PLN02614結(jié)構(gòu)域，說明CaLACS蛋白在進(jìn)化上是高度保守的(見圖4)。

圖3 辣椒LACS家族的基因結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Gene structure analysis of LACS family in pepper

圖4 辣椒LACS基因家族的保守基序分析Fig.4 Analysis of conserved motifs of the LACS gene family in pepper

2.3 辣椒LACS基因啟動子區(qū)順式作用元件分析

對CaLACS基因家族成員的啟動子區(qū)順式作用元件進(jìn)行分析，結(jié)果(見圖5)顯示CaLACS基因啟動子區(qū)具有G-Box、TATA-box和光響應(yīng)元件，TC-rich repeats、LTR等響應(yīng)逆境和防御脅迫等響應(yīng)元件，以及TATC-box、TGACG-motif和ABRE等響應(yīng)激素的元件，暗示CaLACS基因家族可能與非生物脅迫相關(guān)。

圖5 辣椒LACS家族的基因啟動子區(qū)順式作用元件分析Fig.5 Analysis of cis-acting elements in gene promoter region of pepper LACS family

2.4 辣椒CaLACS基因家族的組織表達(dá)分析

利用辣椒材料‘6421’在Pepper Hub網(wǎng)站的組織表達(dá)譜數(shù)據(jù)，分析CaLACS基因家族成員在不同組織和不同發(fā)育時期的表達(dá)情況。結(jié)果(見圖6)顯示，在幼葉期發(fā)育期、開花期和坐果早期CaLACS4的表達(dá)量最高；CaLACS1在種子發(fā)育后期的表達(dá)量較高，CaLACS7和CaLACS8在辣椒果實(shí)和胎座中的表達(dá)量較高。

注：L1～L9分別代表新葉剛現(xiàn)后2、5、10、15、20、25、30、40、50d；AL、AR、AS分別為成年植株葉、莖、根；F1～F9分別代表花蕾現(xiàn)蕾后2、5、10、15、20、25、30、40、50d；P10、O10、STA10分別代表完全開放花(F10)的花瓣、子房和雄蕊；FST0和FST1分別代表授粉3d、7d后含果肉種子胎座的整果；G1～G11分別代表授粉10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60d的果肉；ST1和ST2分別代表授粉10d和15d后的種子和胎座；S3～S11分別代表授粉20、25、30、35、40、45、50、55、60d的種子；T3～T11分別代表授粉20、25、30、35、40、45、50、55、60d的胎座。圖6 ‘6421’辣椒LACS基因家族在不同組織中的表達(dá)模式Fig.6 Expression patterns of LACS gene family from pepper ‘6421’ in different tissues

2.5 辣椒CaLACS基因家族在非生物脅迫下表達(dá)分析

利用Pepper Hub表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對10個CaLACS基因在不同非生物逆境脅迫下葉片和根部組織的表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果(見圖7)顯示，NaCl脅迫下CaLACS1基因在處理12h時的葉片中顯著上調(diào)表達(dá)；CaLACS1和CaLACS2基因在根部均顯著受NaCl誘導(dǎo)表達(dá)，其中CaLACS2基因在NaCl脅迫3h時的根部中表達(dá)量最高。低溫脅迫處理下，除CaLACS5、CaLACS6和CaLACS9外均受低溫誘導(dǎo)在葉片中表達(dá)，其中CaLACS1基因在處理24h時的葉片中表達(dá)量最高；CaLACS2基因受低溫誘導(dǎo)在根部顯著表達(dá)，與對照0h相比，在處理1、1.5、3h和6h時的根部中均顯著上調(diào)表達(dá)。高溫脅迫下，CaLACS8基因在葉片和根部均受到誘導(dǎo)表達(dá)，在處理24h時的表達(dá)量最高；CaLACS2基因在高溫脅迫1h和3h時的根部中表達(dá)量較高。綜合CaLACS基因的表達(dá)譜數(shù)據(jù)推測，辣椒中CaLACS1和CaLACS2基因與非生物脅迫響應(yīng)密切相關(guān)。

注：CK_L為葉片對照；CK_R為根對照；NL_1h、NL_1.5h、NL_3h、NL_6h、NL_12h、NL_24h分別代表NaCl脅迫處理1、1.5、3、6、12、24h后的葉片樣品；NR_1h、NR_1.5h、NR_3h、NR_6h、NR_12h、NR_24h分別代表NaCl脅迫處理1、1.5、3、6、12、24h后的根部樣品；FL_1h、FL_1.5h、FL_3h、FL_6h、FL_12h、FL_24h分別代表低溫脅迫處理1、1.5、3、6、12、24h后的葉片樣品；FR_1h、FR_1.5h、FR_3h、FR_6h、FR_12h、FR_24h分別代表低溫脅迫處理1、1.5、3、6、12、24h后的根部樣品；HL_1h、HL_1.5h、HL_3h、HL_6h、HL_12h、HL_24h分別代表熱脅迫處理1、1.5、3、6、12、24h后的葉片樣品；HR_1h、HR_1.5h、HR_3h、HR_6h、HR_12h、HR_24h分別代表熱脅迫處理1、1.5、3、6、12、24h后的根部樣品。圖7 ‘6421’辣椒LACS基因家族在不同非生物脅迫下的表達(dá)模式Fig.7 Expression patterns of LACS gene family from pepper ‘6421’ in different abiotic stress

2.6 不同鹽敏感品種中CaLACS基因家族對鹽脅迫響應(yīng)的表達(dá)分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證CaLACS基因在鹽脅迫處理下的表達(dá)情況，利用qPCR方法分析耐鹽自交系‘H1023’和鹽敏感自交系‘XWHJ-M’在3h和3d鹽脅迫處理下CaLACS基因的表達(dá)情況。結(jié)果(見圖8)表明，CaLACS1和CaLACS2基因在葉片中均顯著受NaCl誘導(dǎo)表達(dá)，耐鹽品種比鹽敏感品種的表達(dá)量更高，也表明CaLACS1和CaLACS2基因在NaCl脅迫中發(fā)揮重要的作用。

注：A_CK代表H1023噴施清水對照;A_3h代表H1023鹽處理3h;A_3d代表H1023鹽處理3d；B_CK代表XWHJ-M噴施清水對照;B_3h代表XWHJ-M鹽處理3h;B_3d代表XWHJ-M鹽處理3d。圖8 辣椒LACS基因家族在不同鹽耐受性品種中NaCl脅迫下的表達(dá)模式 Fig.8 Expression patterns of LACS gene family in pepperunder NaCl stress in different salt-tolerant cultivars

3 討論

與擬南芥和水稻等模式作物相比，辣椒中CaLACS家族中基因的相關(guān)研究還鮮有報道。本研究共鑒定出10個辣椒CaLACS家族成員，而在擬南芥[1]、甘藍(lán)型油菜[16]、蘋果[26]等作物中分別鑒定出9、34、11個LACSs基因，這可能是由于不同物種的基因組大小與基因復(fù)制方式不同，從而導(dǎo)致鑒定得到的LACSs成員數(shù)量不同。通過進(jìn)化與基因結(jié)構(gòu)等分析將LACSs 家族基因分為了8個亞家族，同一亞組內(nèi)的CaLACS與擬南芥和水稻的外顯子數(shù)量基本一致，保守基序相同或相似，說明LACSs基因在進(jìn)化上比較保守，同一亞組內(nèi)的LACSs基因可能具有相似的功能[20-22]。

研究發(fā)現(xiàn)CaLACS基因啟動子區(qū)含有多個與激素響應(yīng)和逆境脅迫相關(guān)的調(diào)控元件，表明CaLACS基因家族可能與非生物脅迫脅迫相關(guān)[27]。前人研究表明，與CaLACS1同一亞組的擬南芥AT3G05970為種子萌發(fā)和其他需要能量的生理過程提供能量[1]，公共數(shù)據(jù)庫的表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析顯示，CaLACS1和CaLACS2在非生物脅迫下均具有較高的表達(dá)量，熒光定量數(shù)據(jù)也顯示，不同鹽耐受性品種在NaCl脅迫下，CaLACS1和CaLACS2基因均顯著受NaCl誘導(dǎo)表達(dá)，以上結(jié)果說明這2個基因可能與非生物脅迫響應(yīng)關(guān)系密切。在后續(xù)的研究中，可以進(jìn)一步驗(yàn)證這2個基因在非生物脅迫中的功能。有研究表明，與CaLACS4同一亞組的擬南芥AT2G47240參與蠟的生物合成[12]，還是花粉被膜形成的關(guān)鍵基因[15]。對辣椒組織表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析表明，基因CaLACS1和CaLACS4在花芽、果實(shí)、種子中均有較高的表達(dá)量，推測這2個基因可能與辣椒的生長發(fā)育相關(guān)，但其在脂類合成代謝中的作用尚不清楚，有待后續(xù)深入研究。

本研究利用生物信息學(xué)手段和公共數(shù)據(jù)在詳細(xì)分析辣椒CaLACS家族基因和初步解析其理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位預(yù)測的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了辣椒LACSs進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)、保守基序及表達(dá)模式等分析，結(jié)合熒光定量PCR分析CaLACS基因家族在不同鹽耐受性品種中NaCl脅迫下的表達(dá)模式，挖掘鹽脅迫響應(yīng)候選CaLACS基因。相關(guān)工作為明確CaLACS基因在非滲透脅迫和生長發(fā)育中的角色進(jìn)行了初步的探索，并為今后進(jìn)行CaLACS家族的基因克隆、功能驗(yàn)證奠定了一定的基礎(chǔ)。