張文華,吳 媛,施雅梅,汪 鵬,葉芮辰,徐 可,謝 文,徐敦明,伊雄海
(1.杭州海關(guān)技術(shù)中心,浙江 杭州 310016;2.浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院,浙江 杭州 310016;3.廈門海關(guān)技術(shù)中心,福建 廈門 361026;4.上海海關(guān)動植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,上海 200135)
氟苯尼考(florfenicol,F(xiàn)F)又稱氟甲砜霉素,為甲砜霉素的單氟衍生物,是新一代氯霉素類動物專用廣譜抗生素,其主要代謝產(chǎn)物為氟苯尼考胺(florfenicol amine,F(xiàn)FA),廣泛用于防治水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的細(xì)菌性疾病。FF的殘留包含原形藥物及其主要代謝產(chǎn)物FFA。FF的化學(xué)結(jié)構(gòu)中有2 個(gè)手性碳原子,即存在4 個(gè)對映體結(jié)構(gòu),而在實(shí)際生產(chǎn)中只能合成兩個(gè)對映體(圖1)。其中FF(1、2)左旋體構(gòu)型具有抗菌活性,而FF(1、2)右旋體構(gòu)型無活性甚至對FF的活性有一定的抑制作用。然而,GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》僅規(guī)定了魚肉中FF外消旋體的最高殘留限量≤1.0 mg/kg,并未對具有抗菌活性的左旋FF和無活性的右旋FF的殘留限量進(jìn)行精確規(guī)定。如果能進(jìn)一步精準(zhǔn)測定FF對映體及其代謝物FFA在魚肉中的殘留量,將能為FF藥物殘留分析提供精確的判定。
圖1 (-)-FF(A)、(+)-FF(B)和FFA(C)的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of (-)-FF(A),(+)-FF(B) and FFA (C)
目前國內(nèi)外測定獸藥的方法主要有高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等方法;而檢測FF對映體的方法主要為高效液相色譜法,該方法分離度好,但存在分析時(shí)間長,有機(jī)試劑消耗量大等問題。近年來新推出的超高效合相色譜技術(shù)(ultraperformance convergence chromatography,UPC)引起大家的廣泛關(guān)注,該技術(shù)的主要流動相為超臨界二氧化碳(CO),能精確調(diào)控分析物的分離度和保留時(shí)間,主要用于拆分和定量結(jié)構(gòu)類似物、異構(gòu)體等,尤其在分離手性化合物方面具有分離效率高、有機(jī)試劑消耗量少的獨(dú)特優(yōu)勢,彌補(bǔ)了傳統(tǒng)液相色譜系統(tǒng)在對映體分析功能上的不足。目前,尚未見到將UPC技術(shù)應(yīng)用于FF對映體的拆分及殘留測定的報(bào)道。
為解決傳統(tǒng)液相色譜法拆分對映體存在的問題,本實(shí)驗(yàn)建立一種UPC的方法,用于拆分和測定FF對映體及其代謝物;對FF對映體及其代謝物FFA的儀器色譜分離條件和魚肉中FF對映體的凈化條件進(jìn)行優(yōu)化;在最優(yōu)條件下,將建立的UPC方法應(yīng)用于實(shí)際魚肉樣品和FF外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品并進(jìn)行分析。該方法具有分析速度快、分離效果好、有機(jī)溶劑消耗少等特點(diǎn),以期為指導(dǎo)FF獸藥的生產(chǎn)過程、質(zhì)量控制和藥效評價(jià)以及魚類產(chǎn)品的質(zhì)量安全監(jiān)管提供一定技術(shù)支持。
魚肉購于當(dāng)?shù)爻泻娃r(nóng)貿(mào)市場,粉碎后于-18 ℃條件下保存。Anpel FF外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量濃度100 mg/L)上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;BePure FF外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%)、FFA標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.7%) 北京曼哈格生物科技有限公司;FF外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.0%) 德國Dr.Ehrenstorfer公司;(-)-FF標(biāo)準(zhǔn)品、(+)-FF標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.0%) 中國牧工商(集團(tuán))總公司研究院。
乙腈、甲醇、甲酸、乙醇、異丙醇、正庚烷、乙酸乙酯(均為色譜純) 西班牙薩勞有限公司;氨水浙江杭州高晶精細(xì)化工有限公司;磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀 廣東汕頭西隴科學(xué)股份有限公司;CO(純度99.999%) 上海寶鋼普萊克斯實(shí)用氣體有限公司;除特殊說明外,所有試劑均為分析純。
配制磷酸鹽緩沖液:稱取8 g KHPQ和2 g KHPO溶解混合,用超純水定容至1 000 mL。
Acquity UPC儀(帶有PDA二極管陣列檢測器)、Oasis MCX混合型陽離子交換固相萃取小柱(3 mL,60 mg) 美國Waters公司;CHIRALPAK AD-3手性色譜柱(150 mm×3.0 mm,3 μm) 大賽璐藥物手性技術(shù)(上海)有限公司;AE260電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;R215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司;ELGA CLXXXUVM2超純水凈化系統(tǒng) 英國ELGA LabWater公司;MS2渦旋混勻器 上海醫(yī)大儀器廠;N-EVAP111氮吹儀 日本東京理化器械株式會社;Oasis HLB聚合物固相萃取小柱(3 mL,60 mg) 杭州金譜科學(xué)儀器有限公司;Supleco C固相萃取小柱(3 mL,300 mg) 上海安譜科學(xué)儀器有限公司。
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
分別準(zhǔn)確稱取0.01 g(精確至0.1 mg)3 份市售FF外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解并定容至10 mL,配制成1.0 g/L FF外消旋體標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別準(zhǔn)確吸取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用正庚烷-異丙醇(8∶2,/)溶液將其稀釋成10.0 mg/L FF外消旋體標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。
分別準(zhǔn)確稱取0.01 g(精確至0.1 mg)(-)-FF、(+)-FF和FFA標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解并定容至10 mL,配制成質(zhì)量濃度為1.0 g/L的(-)-FF、(+)-FF和FFA標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別量取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用異丙醇稀釋并定容至10 mL,配制成100.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。1.0、2.0、4.0、10.0、20.0、40.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用正庚烷-異丙醇(8∶2,/)溶液逐級稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液獲得。
1.3.2 樣品的制備
從全部魚肉中取出有代表性的樣品約500 g,用粉碎機(jī)粉碎,分別裝入潔凈容器,密封標(biāo)記。將魚肉樣品于-18 ℃冷凍保存。
1.3.3 樣品前處理
1.3.3.1 樣品提取
稱取10.0 g(精確至0.01 g)魚肉樣品置于50 mL具塞離心管中,加入25 mL 2%氨水-乙酸乙酯溶液(/),渦旋混勻1 min,以8 000 r/min離心5 min,吸取上清液至濃縮瓶中,以25 mL乙酸乙酯重復(fù)提取,合并兩次提取液。在40 ℃以下水浴減壓濃縮提取液至近干,加10 mL 1%甲酸-水溶液(/)分次溶解殘?jiān)?,轉(zhuǎn)移至50 mL具塞離心管中,加入15 mL正己烷,渦旋混勻。以8 000 r/min離心5 min,棄掉上層正己烷,重復(fù)向離心管中加入15 mL正己烷脫脂,棄掉上層正己烷,下層水相待凈化。
1.3.3.2 樣品凈化
HLB、C固相萃取小柱使用前依次用3 mL甲醇和3 mL水活化;MCX固相萃取小柱使用前依次用3 mL甲醇和5 mL 1%甲酸-水溶液(/)活化。
移取1.3.3.1節(jié)待凈化的下層水相于活化好的MCX固相萃取小柱中,用5.0 mL甲醇-水溶液(1∶1,/)淋洗,抽干后用6 mL 5%氨水-甲醇洗脫,收集洗脫液。將洗脫液于40 ℃以下水浴中氮?dú)獯抵两?,向離心管中加入1 mL正庚烷-異丙醇溶液(8∶2,/),渦旋溶解充分,過0.22 μm濾膜后裝入進(jìn)樣小瓶中,待測。
1.3.4 UPC條件
CHIRALPAK AD-3手性色譜柱(150 mm×3.0 mm,3 μm);檢測波長:224 nm;系統(tǒng)背壓:13.8 MPa;柱溫:40 ℃;流動相:A 為超臨界CO,B 為氨水-甲醇溶液(0.5∶99.5,/);梯度洗脫程序:0~1.5 min,90% A、10% B;1.5~2.5 min,90%~77% A、10%~23% B;2.5~5.5 min,77% A、23% B;5.5~5.8 min,77%~90% A、23%~10%B;5.8~8.0 min,90% A、10% B;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:5.0 μL。
1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性測定
對新配制FF對映體及其代謝物FFA標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行考察:與分別貯存不同時(shí)間后的FF對映體和FFA的含量比較,觀察FF對映體和FFA標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性。分別準(zhǔn)確移取1.0 mL 10.0 mg/L FF對映體和FFA的混合工作溶液于7 個(gè)帶劃痕的1.5 mL UPC專用進(jìn)樣小瓶中,上機(jī)進(jìn)行含量測定,檢測后再轉(zhuǎn)移至7 個(gè)帶鋁蓋密封的進(jìn)樣小瓶中,并用封口膜封好后置于-18 ℃保存。按照優(yōu)化后的色譜條件測定新配制的與分別貯存1、3、5、7、14、30、60 d的FF對映體和FFA標(biāo)準(zhǔn)溶液。
1.3.6 加標(biāo)回收率及精密度測定
分別向不含有FF和FFA的魚肉空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行添加回收率和精密度測定。(-)-FF和(+)-FF的添加量分別為0.1、0.2、1.0 mg/kg,F(xiàn)FA的添加量分別為0.2、0.4、1.0 mg/kg,平行測定6 次,計(jì)算加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。
采用SPSS 12.0軟件處理數(shù)據(jù),用檢驗(yàn)評價(jià)新配制與貯存不同時(shí)間的FF對映體和FFA標(biāo)準(zhǔn)溶液含量的差異顯著性。
2.1.1 流動相中助溶劑的優(yōu)化
UPC分析中,通常使用超臨界CO為主要流動相,使用少量有機(jī)溶劑作為助溶劑,以調(diào)節(jié)對目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性和洗脫能力。在最佳條件下,考察氨水-甲醇溶液(0.5∶99.5,/)、甲酸-甲醇溶液(0.5∶99.5,/)、甲醇3 種助溶劑對10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液中兩種FF對映體和FFA分離的影響。由圖2可知,當(dāng)使用甲酸-甲醇溶液時(shí),基線升高;當(dāng)使用甲醇時(shí),兩種FF對映體實(shí)現(xiàn)了基線分離,但FFA未能出峰;當(dāng)選擇氨水-甲醇溶液作為助溶劑時(shí),兩種FF對映體和FFA在5.0 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離。這是因?yàn)镕FA含有氨基,屬于極性較強(qiáng)的化合物,而氨水的加入能夠延長出峰,明顯改善FFA的響應(yīng)和峰形。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇氨水-甲醇溶液(0.5∶99.5,/)作為助溶劑。
圖2 不同助溶劑對(+)-FF、(-)-FF和FFA分離效果的影響Fig.2 Effect of different cosolvents on the separation of (+)-FF,(-)-FF and FFA
2.1.2 系統(tǒng)背壓的優(yōu)化
通過柱溫和系統(tǒng)背壓的調(diào)節(jié)可以改變UPC系統(tǒng)中超臨界CO的密度,從而改變流動相對物質(zhì)的洗脫能力、溶解能力和選擇性。CO的溫度超過31 ℃且壓力超過7.38 MPa時(shí),CO才會進(jìn)入超臨界狀態(tài)。因此,在最佳條件下,考察系統(tǒng)背壓在10.3~24.1 MPa范圍內(nèi)對10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液FF對映體和FFA分離的影響。如圖3所示,隨著系統(tǒng)背壓的降低,3 個(gè)目標(biāo)物的保留時(shí)間延長;3 個(gè)目標(biāo)化合物在背壓13.8 MPa時(shí)的色譜峰形和分離度均達(dá)到最佳。綜合考慮保留時(shí)間、系統(tǒng)壓力及峰形,本實(shí)驗(yàn)選擇系統(tǒng)背壓為13.8 MPa。
圖3 不同系統(tǒng)背壓對(+)-FF、(-)-FF和FFA對映體分離效果的影響Fig.3 Effect of the system’s back pressure on the separation of(+)-FF,(-)-FF and FFA
2.1.3 色譜柱溫度的優(yōu)化
一般通過調(diào)節(jié)UPC系統(tǒng)中色譜柱溫度改變流動相密度,從而影響對目標(biāo)物的分離效果。隨著色譜柱溫度降低,超臨界CO流體的密度增大、黏度增高,對目標(biāo)物的洗脫能力也隨之增大,保留時(shí)間縮短??紤]到CHIRALPAK AD-3手性色譜柱的最高推薦運(yùn)行溫度(40 ℃)和超臨界CO的條件(壓力>7.38 MPa,溫度>31 ℃),在最佳條件下,考察色譜柱溫度在31~40 ℃范圍內(nèi)對10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液中兩種FF對映體和FFA分離的影響。結(jié)果表明,隨著柱溫降低,目標(biāo)物的保留時(shí)間逐漸縮短;當(dāng)柱溫為31 ℃和35 ℃時(shí),(+)-FF和FFA的分離度不佳,部分色譜峰出現(xiàn)重疊,分離度分別為0.81和0.83;繼續(xù)升高柱溫至40 ℃時(shí),(+)-FF和FFA的分離度為1.8,3 個(gè)目標(biāo)化合物在5.0 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)良好的基線分離。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇40 ℃作為色譜柱溫度。
2.2.1 提取試劑的優(yōu)化
通常采用氨化乙酸乙酯、乙酸乙酯、水-丙酮溶液(2∶8,/)、乙腈、甲醇對樣品中FF進(jìn)行提取。參照1.3.3節(jié)的前處理方法,使用這4 種試劑提取魚肉樣品中的FF及FFA,經(jīng)MCX固相萃取小柱凈化后,上機(jī)檢測,考察其提取效果。結(jié)果表明,采用水-丙酮溶液(2∶8,/)、乙腈和甲醇提取時(shí),F(xiàn)FA均未出峰,干擾峰較多;采用乙酸乙酯提取時(shí),F(xiàn)FA的回收率較低,存在干擾峰;在乙酸乙酯中加入氨水能夠明顯提高FFA的回收率,且干擾峰較少,與文獻(xiàn)[34]相符,這是因?yàn)镕FA含有氨基且極性較強(qiáng)。因此,本實(shí)驗(yàn)采用氨化乙酸乙酯作為提取試劑。
2.2.2 凈化條件的優(yōu)化
經(jīng)最優(yōu)試劑提取后,使用C、HLB、MCX3 種常用固相萃取小柱分別對待凈化的魚肉樣品的下層水相進(jìn)行凈化(C、HLB柱采用1.1節(jié)中磷酸鹽緩沖溶液溶解上柱,水淋洗,甲醇洗脫),上機(jī)檢測,考察其凈化效果。結(jié)果表明,MCX固相萃取小柱的凈化效果最好,且(-)-FF、(+)-FF和FFA回收率依次為90.0%、98.2%和94.1%;HLB固相萃取小柱的回收率略優(yōu)于MCX固相萃取小柱,但是經(jīng)MCX固相萃取小柱凈化得到的色譜圖中干擾峰較少,與文獻(xiàn)[28,41]相符。綜合考慮,本實(shí)驗(yàn)采用MCX固相萃取小柱對魚肉樣品中FF對映體和FFA進(jìn)行凈化。
為保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確度,對新配制與不同貯存時(shí)間后的FF對映體及其代謝物FFA標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行考察。結(jié)果表明:貯存7 d內(nèi)(-)-FF、(+)-FF和FFA含量的RSD分別為3.3%、1.5%和4.2%;貯存14 d內(nèi)(-)-FF、(+)-FF和FFA含量的RSD分別為3.5%、1.9%和10.2%;貯存30 d內(nèi)(-)-FF、(+)-FF和FFA含量的RSD分別為10.8%、10.4%和15.2%。采用檢驗(yàn)評價(jià)新配制與貯存不同時(shí)間的FF對映體和FFA含量的差異顯著性。結(jié)果表明,與新配制的FF對映體標(biāo)準(zhǔn)溶液相比,在-18 ℃下貯存14 d的標(biāo)準(zhǔn)溶液中兩種FF對映體含量差異不顯著(>0.05),具有良好的穩(wěn)定性;貯存30 d的標(biāo)準(zhǔn)溶液中兩種FF對映體含量差異顯著(<0.05),表現(xiàn)出較差的穩(wěn)定性。與新配制的FFA標(biāo)準(zhǔn)溶液相比,在-18 ℃下貯存7 d的標(biāo)準(zhǔn)溶液中FFA含量差異不顯著(>0.05),具有良好的穩(wěn)定性;貯存14 d的標(biāo)準(zhǔn)溶液中FA含量差異顯著(<0.05),表現(xiàn)出較差的穩(wěn)定性。因此,兩種FF對映體標(biāo)準(zhǔn)溶液在-18 ℃條件下可貯存14 d,F(xiàn)FA標(biāo)準(zhǔn)溶液在-18 ℃條件下可貯存7 d。
2.4.1 方法的線性范圍和定量限(limit of quantitation,LOQ)
對(-)-FF、(+)-FF和FFA的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(),對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為縱坐標(biāo)(),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)()。由表1可知,兩種FF對映體在1.0~20.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)和FFA在2.0~40.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系,均大于0.999 3。通過在不含F(xiàn)F和FFA的魚肉空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)品并進(jìn)行測定,得到LOQ(信噪比10)。由表1可知,(-)-FF和(+)-FF的LOQ均為0.1 mg/kg,F(xiàn)FA的LOQ為0.2 mg/kg。
表1 各目標(biāo)化合物的線性范圍、線性方程、R2和LOQTable 1 Linear range,linear equation,R2 and LOQ of each target compound
2.4.2 加標(biāo)回收率以及精密度分析
不加空白樣品基質(zhì),在2%氨水-乙酸乙酯溶液中加入(-)-FF、(+)-FF和FFA 3 種標(biāo)準(zhǔn)品,經(jīng)過1.3.3節(jié)的前處理后上機(jī)檢測。結(jié)果顯示,(-)-FF、(+)-FF和FFA的回收率依次為96.7%、98.1%、94.0%,RSD依次為5.2%、6.3%、6.8%,說明該方法具備良好的穩(wěn)定性。
對添加回收魚肉樣品進(jìn)行測定,計(jì)算加標(biāo)回收率及RSD。由表2可知,3 種目標(biāo)化合物的回收率范圍為81.5%~108.0%,RSD范圍為5.3%~9.3%。該回收率和精密度符合GB/T 27404—2008《食品理化檢測》的要求,能夠滿足魚肉樣品的分析要求,可用于日常檢測。
表2 魚肉樣品中FF對映體和FFA的加標(biāo)回收率和RSD(n=6)Table 2 Spiked recoveries and RSDs of florfenicol enantiomers and florfenicol amine in fish meat (n=6)
2.5.1 實(shí)際樣品分析
為了考察方法的實(shí)用性和有效性,在最優(yōu)條件下,應(yīng)用所建立的方法對隨機(jī)抽取的30 份市售魚肉樣品中FF對映體和FFA進(jìn)行檢測。結(jié)果表明:30 份魚肉樣品中均未檢出(+)-FF;其中1 份鳊魚樣品中檢出170 μg/kg (-)-FF;1 份黑魚(烏鱧)樣品中檢出537 μg/kg FFA。
2.5.2 市售標(biāo)準(zhǔn)品的純度分析
在最優(yōu)條件下,應(yīng)用所建立的方法對3 份市售常見FF外消旋標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行拆分及測定,結(jié)果如圖4所示。3 份FF外消旋標(biāo)準(zhǔn)品中均未檢出(+)-FF,Anpel、Bepure和Dr.Ehrenstorfer FF外消旋標(biāo)準(zhǔn)品中(-)-FF質(zhì)量濃度分別為10.0、9.2、9.4 mg/L。市售Bepure和Dr.Ehrenstorfer兩種外消旋固體標(biāo)準(zhǔn)品的純度和實(shí)際測量值存在偏差,偏差值分別為8.0%和6.0%。
圖4 FF對映體、FFA及外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.4 Chromatograms of florfenicol enantiomers,florfenicol amine and racemic florfenicol standard
市售常用FF外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品和魚肉樣品的檢測結(jié)果顯示,均未檢出(+)-FF,只檢出(-)-FF和FFA,檢測結(jié)果與文獻(xiàn)[6,18,20]相符,故陽性魚肉中代謝物質(zhì)FFA是由(-)-FF對映體代謝產(chǎn)生。
建立一種基于UPC的檢測方法用于分離魚肉樣品中兩種FF對映體和FFA。經(jīng)分析得到此方法的最優(yōu)條件:使用氨化乙酸乙酯對樣品進(jìn)行提取,通過MCX固相萃取小柱對樣品進(jìn)行凈化后,采用CHIRALPAK AD-3手性色譜柱分離,以超臨界CO(流動相A)和氨水-甲醇溶液(0.5∶99.5,/)(流動相B)為流動相進(jìn)行梯度洗脫,系統(tǒng)背壓13.8 MPa,柱溫40 ℃。將最優(yōu)條件用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在0.1~1.0 mg/kg范圍內(nèi)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),兩種FF對映體和FFA的加標(biāo)回收率為81.5%~108.0%,RSD為5.3%~9.3%。使用建立的方法對實(shí)際魚肉樣品和市售標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了分析測定。結(jié)果表明,本方法具有分析速度快、準(zhǔn)確度好、分離效果好等特點(diǎn),能夠滿足魚肉中左旋FF的純度分析及快速定量需要。