蘇倩，杜文宣，馬琳，夏亞迎，李雪，祁智，龐永珍

紫花苜蓿的克隆及功能分析

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021

【目的】CIPK是植物響應(yīng)逆境脅迫信號通路中一類重要的蛋白激酶，可與CBL形成CBL-CIPK復(fù)合物，啟動細(xì)胞內(nèi)相關(guān)應(yīng)答基因的表達(dá)而應(yīng)對各種非生物脅迫。發(fā)掘并研究紫花苜蓿MsCIPK基因響應(yīng)非生物脅迫的分子機(jī)理，有助于揭示紫花苜?？鼓嫔飳W(xué)基礎(chǔ)，為紫花苜?？鼓嬗N提供新的基因資源?！痉椒ā客ㄟ^PCR技術(shù)克隆，使用生物信息學(xué)工具分析基因序列，利用qRT-PCR技術(shù)分析，以及與其互作的4個CBL基因（、、和）在紫花苜蓿各組織中的表達(dá)水平，在煙草葉片表皮細(xì)胞中，瞬時表達(dá)pCAMBIA1302-GFP-MsCIPK2融合表達(dá)載體，通過激光共聚焦顯微鏡觀察進(jìn)行亞細(xì)胞定位，利用酵母雙雜交技術(shù)分析MsCIPK2與4個MsCBLs蛋白互作情況，利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)紫花苜蓿產(chǎn)生過量表達(dá)的毛狀根，利用qRT-PCR技術(shù)分析轉(zhuǎn)基因毛狀根株系中相關(guān)基因的表達(dá)水平?！窘Y(jié)果】通過PCR擴(kuò)增獲得片段，該基因CDS為1 230 bp，編碼409個氨基酸，具有典型的CIPK家族的ATP結(jié)合位點、激活環(huán)、NAF motif和PPI motif等結(jié)構(gòu)域。在紫花苜蓿根中表達(dá)量最高，在花中表達(dá)量最低。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，MsCIPK2蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。酵母雙雜交試驗結(jié)果顯示，MsCIPK2蛋白與MsCBL2、MsCBL6、MsCBL7和MsCBL10蛋白具有相互作用，且與MsCBL10蛋白相互作用較強(qiáng)。、和在紫花苜蓿根中表達(dá)量最高，在莢中表達(dá)量最高。qRT-PCR結(jié)果表明，過量表達(dá)的毛狀根中響應(yīng)非生物脅迫基因、、、、和的表達(dá)量均明顯上調(diào)。在200 mmol·L-1NaCl和20%PEG處理條件下，與對照相比，過量表達(dá)毛狀根的丙二醛含量降低，SOD活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量增高?！窘Y(jié)論】紫花苜蓿MsCIPK2與MsCBLs蛋白互作，主要在根中表達(dá)并響應(yīng)鹽和干旱脅迫，過量表達(dá)可以提高紫花苜蓿的耐鹽性和耐旱性，可作為提高紫花苜蓿抗逆育種的候選基因。

紫花苜蓿；CBL-相互作用蛋白激酶；類鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B；非生物脅迫

0 引言

【研究意義】紫花苜蓿（L）是豆科苜蓿屬草本植物，是世界上最重要、種植面積最廣的豆科栽培牧草。近年來，隨著中國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和畜牧業(yè)的發(fā)展[1]，苜蓿種植面積逐年擴(kuò)大，并逐步向規(guī)?；?、集約化方向發(fā)展[2]，逐步形成了寧夏河套灌區(qū)、甘肅河西走廊、內(nèi)蒙古科爾沁草地等十萬畝以上優(yōu)質(zhì)苜蓿種植基地[2]。雖然如此，苜蓿產(chǎn)業(yè)供給矛盾仍然突出，僅內(nèi)蒙古年供需缺口達(dá)到3 000萬t[3]。隨著國人對高質(zhì)量牛羊肉和牛奶的需求，優(yōu)質(zhì)苜蓿需求量將逐年增長。而苜蓿在生長過程中遇到的非生物脅迫（干旱、鹽堿、極端溫度等）[4]，嚴(yán)重影響了產(chǎn)量和品質(zhì)[5-6]。因此，挖掘紫花苜?？鼓嫦嚓P(guān)基因，改善紫花苜蓿的抗逆性，對提高紫花苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】CIPK是一種特異的絲氨酸-蘇氨酸激酶家族蛋白，最初由Shi等[7]和Johnson等[8]在擬南芥中對CBLs蛋白進(jìn)行酵母雙雜交篩選時發(fā)現(xiàn)的。在野大麥（）中，是鹽和滲透脅迫耐受性的正調(diào)控因子。HbCIPK2主要定位于質(zhì)膜和細(xì)胞核。啟動子的異源表達(dá)不僅回復(fù)了擬南芥突變體對鹽的敏感性，而且提高了野生型擬南芥的耐鹽性，并在萌發(fā)過程中表現(xiàn)出對滲透脅迫的耐受性。的表達(dá)有助于防止根系K+流失，減少地上部Na+積累，維持K+/Na+穩(wěn)態(tài)，保護(hù)根細(xì)胞免于死亡[9]。在煙草中，過量表達(dá)鷹嘴豆（）提高了轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性，表現(xiàn)為幼苗根系發(fā)達(dá)、基部生長素轉(zhuǎn)運增加以及對生長素的超敏性[10]。在鹽脅迫條件下，玉米的表達(dá)水平上調(diào)，過量表達(dá)玉米擬南芥中和的表達(dá)量上調(diào)，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性[11]。干旱脅迫條件下，表達(dá)量上升，過量表達(dá)煙草提高了其抗旱性，并誘導(dǎo)了干旱脅迫相關(guān)基因的表達(dá)[12]。過量表達(dá)擬南芥在干旱脅迫下的存活率明顯高于野生型，并且與抗旱相關(guān)的生理指標(biāo)，如過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性高于野生型，丙二醛和脯氨酸含量低于野生型[13]。在水稻中，過量表達(dá)可以誘導(dǎo)干旱脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，表達(dá)抑制的RNAi植株對干旱脅迫表現(xiàn)出高度敏感反應(yīng)[14]。擬南芥在冷、鹽和ABA脅迫下的表達(dá)水平上調(diào)，突變體植株誘導(dǎo)逆境相關(guān)基因的表達(dá)和ABA響應(yīng)基因的表達(dá)[15]。【本研究切入點】CIPK作為一類蛋白激酶，在植物逆境脅迫響應(yīng)信號通路中發(fā)揮重要作用，其上游基因所編碼的類鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B是一類鈣感受器，可以感知細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度在特定的時間變化，與Ca2+結(jié)合后激活其活性，CBL與CIPK蛋白的NAF結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成CBLs-CIPKs復(fù)合物，啟動細(xì)胞內(nèi)相關(guān)應(yīng)答基因的表達(dá)來應(yīng)對各種非生物脅迫。CIPK蛋白激酶作為Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要因子，在脅迫網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中起關(guān)鍵作用，但該家族蛋白在紫花苜蓿中的功能還不完全清楚。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草種質(zhì)資源收集保護(hù)和利用團(tuán)隊前期通過蒺藜苜蓿芯片數(shù)據(jù)庫篩選了一個受非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的MtCIPK基因，鑒定了該基因在紫花苜蓿中的同源基因，通過實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)的表達(dá)水平受NaCl和PEG等非生物脅迫的誘導(dǎo)[16]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以紫花苜蓿為研究對象，進(jìn)一步揭示以為代表的CIPK基因家族在紫花苜蓿體內(nèi)的生物學(xué)功能，有助于更好地改善紫花苜蓿抗逆性并指導(dǎo)紫花苜?？鼓嬗N。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年12月至2022年4月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草種質(zhì)資源收集保護(hù)和利用實驗室進(jìn)行。紫花苜蓿中苜1號和本氏煙草植物材料、大腸桿菌菌株DH5α、農(nóng)桿菌菌株GV3101和ARquaⅠ、酵母菌菌株AH109、植物表達(dá)載體pCAMBIA1302-GFP、酵母表達(dá)載體pGADT7-DEST和pGBKT7-DEST、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位標(biāo)簽（ER-marker）、增強(qiáng)熒光信號農(nóng)桿菌P19均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草種質(zhì)資源收集保護(hù)和利用團(tuán)隊提供。試驗引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 DNA、RNA提取及cDNA合成

利用CTAB法提取紫花苜蓿DNA。取紫花苜蓿根、莖、葉、花和莢組織鮮樣，利用Eastep? Super總RNA提取試劑盒（上海普洛麥格生物科技有限公司）提取總RNA。利用FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑（天根生化科技（北京）有限公司），將紫花苜?？俁NA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并稀釋至10 ng·μL-1備用。

1.3 PCR和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

用于基因克隆的PCR體系（50 μL）：5 μL 10× Buffer、5 μL 2 mmol·L-1dNTP、2 μL 25 mmol·L-1MgSO4、1.5 μL正反向引物F/R（表1）、2 μL紫花苜蓿根cDNA、1 μL KOD-Plus（東洋紡生物科技有限公司）。用于菌落檢測的PCR體系（20 μL）：10 μL 2×Taq PCR StarMix（北京德益恒達(dá)生物科技有限公司）、0.5 μL正反向引物F/R、2 μL菌液。PCR擴(kuò)增程序為94℃ 3 min，58℃ 30 s，72℃ 2 min，35個循環(huán)；72℃ 5 min。

實時熒光定量PCR使用ABI7500 Real-Time PCR system（美國ABI公司）進(jìn)行擴(kuò)增。20 μL體系：1 μL模板、0.5 μL正反向引物F/R（表1）、10 μL UltraSYBR Mixture（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）。qRT-PCR擴(kuò)增程序為94℃ 60 s；94℃ 34 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)。

1.4 MsCIPK2的克隆與序列分析

以紫花苜蓿cDNA為模板，引物為MsCIPK2-F/ MsCIPK2-R，利用KOD-Plus酶克隆目的基因。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化后連接pTOPO-TA載體（北京艾德萊生物科技有限公司），轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，鑒定陽性單克隆，送至北京擎科生物科技有限公司測序。

將得到的序列使用ORF finder（https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析開放閱讀框；使用在線網(wǎng)站ProtScale進(jìn)行蛋白疏水性分析。利用生物信息學(xué)網(wǎng)站ProtParam（https://web.expasy.org/ protparam/）預(yù)測蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)和NovoPro分析其二級結(jié)構(gòu)。利用NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST工具檢索MsCIPK2同源蛋白序列，獲得的蛋白序列通過Jalview2.11.0軟件進(jìn)行序列比對。

1.5 MsCIPK2蛋白的亞細(xì)胞定位

使用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和Ⅰ雙酶切pCAMBIA1302-GFP表達(dá)載體，通過SE無縫克隆試劑盒（美國CloneSmarter公司）連接基因與載體，經(jīng)測序后獲得重組表達(dá)載體質(zhì)粒。利用凍融法將重組質(zhì)粒pCAMBIA1302-GFP-MsCIPK2和空載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101。挑取陽性農(nóng)桿菌菌落于LB液體培養(yǎng)基（含50 mg·L-1Kan+50 mg·L-1Rif）中培養(yǎng)，28℃，250 r/min避光培養(yǎng)至OD600約為0.8，4 700 r/min離心10 min收集菌液，使用乙酰丁香酮緩沖液重懸菌體，注射煙草葉片，48 h后將注射葉片剪下、裝片，在激光共聚焦/TIRF顯微鏡（Leica TCS SP8）下觀察熒光信號。

1.6 MsCBLs-MsCIPK2的酵母雙雜交試驗

使用RⅠ和Ⅰ雙酶切pGADT7-DEST（AD）和pGBKT7-DEST（BD）表達(dá)載體，通過SE無縫克隆試劑盒（美國CloneSmarter公司）連接基因與載體，產(chǎn)生分別含AD-MsCIPK2、BD-MsCBL2、BD-MsCBL6、BD-MsCBL7和BD-MsCBL10的表達(dá)載體，經(jīng)測序后獲得重組表達(dá)載體質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化于酵母感受態(tài)細(xì)胞AH109，并涂布于SD-Trp+ Leu二缺篩選培養(yǎng)基，獲得陽性轉(zhuǎn)化子后再通過濃度梯度稀釋涂布在SD-Trp+Leu+His培養(yǎng)基，確定蛋白之間的相互作用，最終在SD-Trp+Leu+His培養(yǎng)基中加入X-α-gal確認(rèn)蛋白之間的互作。

表1 試驗所用引物序列

1.7 過表達(dá)MsCIPK2紫花苜蓿毛狀根的獲得及基因表達(dá)分析

使用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和Ⅰ雙酶切pCAMBIA1302-Flag表達(dá)載體，通過SE無縫克隆試劑盒連接基因與載體，經(jīng)測序后獲得重組表達(dá)載體質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒pCAMBIA1302-Flag-MsCIPK2和空載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌ARquaⅠ，侵染紫花苜蓿下胚軸，在F培養(yǎng)基中培養(yǎng)一個月，更換添加5 mg·L-1Hyg的B5培養(yǎng)基（美國Phytotech有限公司），待毛狀根生長旺盛時，擴(kuò)繁培養(yǎng)，待生長量達(dá)到試驗需求時，收集材料。

提取轉(zhuǎn)基因毛狀根DNA，通過PCR確認(rèn)陽性轉(zhuǎn)基因毛狀根，從陽性毛狀根提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，檢測在陽性毛狀根中的表達(dá)量，篩選出3個高表達(dá)的陽性毛狀根，以轉(zhuǎn)空載體毛狀根為對照，對這三個株系中的脅迫相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行qRT-PCR分析，其中，（responsive to dehydration 2）和（cold regulated 47）是苜蓿響應(yīng)干旱脅迫的相關(guān)基因[17]；（H+- ATPase）是細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)的核心調(diào)節(jié)基因[18]；（Δ1-Pyrroline-5-Carboxylate synthase）是編碼脯氨酸生物合成的關(guān)鍵酶基因，（oxygen binding protein）編碼的蛋白負(fù)責(zé)結(jié)合氧，對清除ROS、維持細(xì)胞ROS穩(wěn)態(tài)起關(guān)鍵作用[9]；（high affinity K+transporter 5）是鹽脅迫下調(diào)控鉀的吸收、轉(zhuǎn)運和生理功能的關(guān)鍵基因。

1.8 過表達(dá)MsCIPK2毛狀根在脅迫條件下的生化指標(biāo)測定

以Gamborg’s B5為基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基（美國Phytotech有限公司），在液體中大量擴(kuò)繁并培養(yǎng)對照和轉(zhuǎn)基因的紫花苜蓿毛狀根20 d，在液體培養(yǎng)基中添加NaCl和PEG6000終濃度分別為200 mmol·L-1和20%，置于人工智能溫室（光照：16 h光/8 h黑暗，溫度：25℃/23℃，光強(qiáng)400 μmoL·m-2·s-1），搖床100 r/min慢速培養(yǎng)，分別在處理0、6、12和24 h后收集材料，在液氮中磨成粉末。利用脯氨酸（Pro）含量檢測試劑盒、植物可溶性糖含量檢測試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量檢測試劑盒以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒分別分析對照和轉(zhuǎn)基因毛狀根在2種處理條件下，不同時間點的生化指標(biāo)。所有處理均設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 MsCIPK2的生物信息學(xué)分析

根據(jù)紫花苜蓿的編碼序列，設(shè)計特異性引物MsCIPK2-F/MsCIPK2-R，采用PCR擴(kuò)增目的基因，經(jīng)凝膠電泳顯示，獲得一條單一清晰條帶，與目的基因（1 230 bp）大小一致。將目的片段連接至TA載體，使用引物M13-F/M13-R鑒定陽性克隆。將的陽性克隆菌液送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序。

將測序獲得的正確序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。預(yù)測最長開放閱讀框編碼409個氨基酸。MsCIPK2為親水性蛋白，親水指數(shù)為-0.224（圖1-A）。MsCIPK2蛋白分子量為46.41 kD，等電點為8.99，不穩(wěn)定系數(shù)為33.34，屬于穩(wěn)定蛋白；MsCIPK2蛋白的α-螺旋占37.38%，不規(guī)則卷曲占34.52%，延伸鏈占19.52%，β-轉(zhuǎn)角占8.57%（圖1-B）；使用NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST工具檢索MsCIPK2同源蛋白序列，通過Jalview2.11.0軟件進(jìn)行序列比對，并對MsCIPK2蛋白序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，MsCIPK2蛋白在4—13位為ATP結(jié)合位點，139—167位為激活環(huán)，285—294位為NAF motif，313—331位為PPI motif，與大部分豆科植物CIPK25蛋白相似度高（圖1-C）。

2.2 MsCIPK2的組織表達(dá)特異性分析

為了研究的表達(dá)模式，從紫花苜蓿根、莖、葉、花、莢中分別提取植物總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用實時熒光定量PCR進(jìn)行的組織表達(dá)特異性分析。結(jié)果顯示，在根中的表達(dá)量最高，在莢和莖中次之，在花中的表達(dá)量最低，并且根中的相對表達(dá)量約為莢中表達(dá)量的8.9倍，是莖和葉中表達(dá)量的20倍（圖2）。

2.3 MsCIPK2蛋白的亞細(xì)胞定位

將pCAMBIA1302-GFP-MsCIPK2載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，注射煙草葉片，48 h后使用激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白定位情況（圖3），在pCAMBIA1302-GFP空載體對照中，綠色熒光在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中均有分布，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位標(biāo)簽（ER-mCherry）重疊；而pCAMBIA1302- GFP-MsCIPK2融合蛋白在煙草葉片內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中出現(xiàn)GFP綠色熒光，具有明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)絲狀特征，且與ER-mCherry紅色熒光信號重合。表明MsCIPK2蛋白定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。

2.4 酵母雙雜交試驗

由于CIPK參與植物應(yīng)對各種外部脅迫的響應(yīng)過程大多與CBL相互作用發(fā)揮功能，所以利用生物信息學(xué)方法篩選了可能與CIPK互作的4個紫花苜蓿CBL基因（、、和），克隆這4個基因并利用酵母雙雜交技術(shù)分析這4個MsCBL與MsCIPK2之間的相互作用，研究MsCBL和MsCIPK2結(jié)合的特異性和作用強(qiáng)度，闡明CBL- CIPK復(fù)合體在逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮的功能機(jī)制。

將pGADT7-DEST-MsCIPK2和pGBKT7-DEST- MsCBLs載體共轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109，涂布在SD-Trp+Leu二缺篩選培養(yǎng)基上，獲得陽性轉(zhuǎn)化子后再通過1﹕1、1﹕10、1﹕100、1﹕1 000及1﹕10 000梯度稀釋涂布在SD-Trp+Leu和SD-Trp+Leu+His篩選培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)7 d后觀察試驗結(jié)果。以常用并已驗證互作的擬南芥類黃酮途徑2個轉(zhuǎn)錄因子蛋白AtTT8+AtTT2為陽性對照，pGADT7+pGBKT7為陰性對照。如圖4所示，共表達(dá)菌株在SD-Trp+Leu篩選培養(yǎng)基上能穩(wěn)定生長，即使在1﹕10 000稀釋條件下仍有陽性菌株生長，說明陽性菌株活力強(qiáng)，篩選濃度適當(dāng)（圖4-左）。在SD-Trp+Leu+His篩選培養(yǎng)基上，與對照相比，MsCIPK2與MsCBL2、MsCBL6、MsCBL7和MsCBL10具有相互作用，且與MsCBL7相互作用較弱，而與MsCBL10相互作用較強(qiáng)（圖4-中）。3次重復(fù)結(jié)果一致，且互作結(jié)果在SD-Trp+Leu+ His+X-α-gal缺陷培養(yǎng)基上，經(jīng)X-gal染色呈現(xiàn)藍(lán)色，進(jìn)一步驗證了蛋白之間的互作（圖4-右）。

A：蛋白親疏水性預(yù)測；B：蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；C：MsCIPK2與不同物種CIPKs蛋白序列比對。TcCIPK25：可可樹，EOY29347.1；DzCIPK25：榴蓮，XP_022730333.1；HuCIPK25：哥倫比亞錦葵，XP_021276011.1；ApCIPK5：相思子，XP_027354272.1；MtCIPK25：蒺藜苜蓿，XP_003588823.1；TpCIPK25：紅車軸草，XP_045823300.1；CaCIPK25：鷹嘴豆，XP_004498818.1

2.5 MsCBLs的表達(dá)特性分析

為了進(jìn)一步研究與MsCIPK2互作的4個MsCBL蛋白對應(yīng)基因在紫花苜蓿中的表達(dá)部位，運用qRT-PCR分析它們在紫花苜蓿根、莖、葉、花、莢中的表達(dá)量。結(jié)果顯示，在根中的表達(dá)量最高，在花中的表達(dá)量最低，根中的相對表達(dá)量約為莢中表達(dá)量的2倍、莖中表達(dá)量的5倍（圖5-A）；在根中表達(dá)量最高，在莖、葉、花和莢中表達(dá)量極低，根中表達(dá)量為莖、葉、花和莢中表達(dá)量的25倍以上（圖5-B）；在莢中表達(dá)量最高，在花中表達(dá)量幾乎為零，在根、莖和葉中表達(dá)量相對較低（圖5-C）；在根中的表達(dá)量最高，在花中的表達(dá)量最低，根中的相對表達(dá)量約為莢中表達(dá)量的3.6倍、莖中表達(dá)量的21倍（圖5-D）。上述結(jié)果表明，和具有相似的組織表達(dá)譜，與的表達(dá)譜一致（圖2）。

2.6 轉(zhuǎn)基因MsCIPK2毛狀根中響應(yīng)非生物脅迫基因的表達(dá)分析

毛狀根是通過發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的，具有生長迅速、生產(chǎn)周期短，遺傳穩(wěn)定性高等優(yōu)點，可以短期內(nèi)驗證基因在植物體內(nèi)功能[19-20]。為了深入研究紫花苜蓿響應(yīng)脅迫環(huán)境的分子機(jī)制，通過發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生26株轉(zhuǎn)基因毛狀根株系（圖6-A和圖6-B），通過PCR在DNA水平確認(rèn)了部分轉(zhuǎn)基因陽性毛狀根（圖6-C），進(jìn)而利用qRT-PCR技術(shù)檢測陽性毛狀根中的表達(dá)量（圖6-D），從中篩選表達(dá)量高的毛狀根用于后續(xù)試驗（代表性株系2-3、2-3和2-6）。

*表示P＜0.05差異顯著，**表示P＜0.01差異極顯著。下同

圖3 MsCIPK2蛋白亞細(xì)胞定位

運用實時熒光定量PCR技術(shù)分析6個脅迫相關(guān)基因在對照和轉(zhuǎn)基因毛狀根中的表達(dá)水平（圖7），在3個過表達(dá)毛狀根株系中的表達(dá)量是對照（CK）的2倍之多在3個過表達(dá)毛狀根株系中均上調(diào)，在株系2-6中的上調(diào)倍數(shù)是對照的13倍，在3個過表達(dá)毛狀根株系中均上調(diào)，在株系2-2中上調(diào)倍數(shù)是對照的121倍，表達(dá)量變化不明顯，在3個過表達(dá)毛狀根株系中均被誘導(dǎo)表達(dá)，在株系2-3和2-6中的表達(dá)量達(dá)到對照的80倍，在3個過表達(dá)毛狀根株系中均上調(diào)，其中，在株系2-6中的上調(diào)倍數(shù)是對照的98倍（圖7）。

圖5 4個MsCBLs基因的組織特異性表達(dá)

2.7 轉(zhuǎn)基因MsCIPK2毛狀根生理指標(biāo)分析

檢測200 mmol·L-1NaCl和20% PEG6000脅迫下，轉(zhuǎn)基因毛狀根中丙二醛的含量、SOD的活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因毛狀根的相對丙二醛含量均低于對照（圖8-A和圖8-E)，表明轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿毛狀根遭受的氧化損傷比對照毛狀根??；轉(zhuǎn)基因毛狀根的SOD活性均高于對照（圖8-B和圖8-F），表明轉(zhuǎn)基因毛狀根清除活性氧自由基（ROS）的能力增強(qiáng)。轉(zhuǎn)基因毛狀根的脯氨酸和可溶性糖這兩種化合物的含量也都明顯高于對照（圖8-C、圖8-D、圖8-G和圖8-H），說明它們合成了更多的代謝物以抵御逆境脅迫。

A、B：過量表達(dá)MsCIPK2的毛狀根轉(zhuǎn)化；C：過量表達(dá)MsCIPK2毛狀根的PCR鑒定；D：過量表達(dá)MsCIK2毛狀根中基因表達(dá)量檢測

圖7 過量表達(dá)MsCIPK2毛狀根中脅迫相關(guān)基因的表達(dá)水平

A：200 mmol·L-1 NaCl處理下MDA含量；B 200 mmol·L-1 NaCl處理下SOD活性；C：200 mmol·L-1 NaCl處理下脯氨酸含量；D：200 mmol·L-1 NaCl處理下可溶性糖含量；E：20% PEG處理下MDA含量；F：20% PEG處理下SOD活性；G：20% PEG處理下脯氨酸含量；H：20% PEG處理下可溶性糖含量

3 討論

紫花苜蓿是世界上重要的牧草之一，蛋白質(zhì)含量豐富，飼喂價值高，但種植過程中遭受的各種逆境脅迫（鹽堿、干旱、低溫等），極大地降低了紫花苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的損失。因此，提高紫花苜蓿耐鹽耐旱等非生物脅迫抗性具有十分重要的意義。CIPK作為鈣信號響應(yīng)逆境途徑中的關(guān)鍵因子，在植物生長過程中發(fā)揮重要作用。

3.1 MsCIPK2的特征

本研究成功克隆了紫花苜蓿，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)序列特征符合大部分物種CIPK基因的共同特征，均具有ATP結(jié)合位點、激活環(huán)、NAF motif和PPI motif等特征結(jié)構(gòu)域，屬于CIPK家族基因（圖1）。

不同的CIPK基因在植物中的表達(dá)模式不同，同一CIPK基因在植物不同組織器官、不同脅迫條件下表達(dá)模式也不同，而這種特異性表達(dá)暗示它們參與不同組織器官的生長發(fā)育，在不同的信號通路中發(fā)揮功能。番茄在各組織中特異性表達(dá)，葉中表達(dá)量最高，其次是莖和根，花和果中表達(dá)量較少。番茄可能通過調(diào)控根、莖和葉中應(yīng)對非生物脅迫[21]。已經(jīng)報道的紫花苜蓿在根、莖、葉、花和種子中均有表達(dá)，在根中表達(dá)量最高，葉中表達(dá)量次之，種子中表達(dá)量最低[22]。本研究在紫花苜蓿各組織中均有表達(dá)，但在根中表達(dá)量最高，在花中表達(dá)量最低，在生長期總體表達(dá)量呈現(xiàn)由根、莖、葉、花逐級遞減趨勢（圖2），說明和在不同的組織中發(fā)揮功能。

蛋白是基因發(fā)揮功能的直接執(zhí)行者，解析蛋白在植物體內(nèi)的定位是了解基因功能、蛋白調(diào)控以及蛋白之間互作的關(guān)鍵[23]。本研究通過融合GFP蛋白導(dǎo)入煙草葉片細(xì)胞，確定MsCIPK2定位在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上（圖3）。前人研究表明，一個CIPK可以與多個CBL相互作用。本試驗利用酵母雙雜驗證了MsCIPK2與MsCBL2、MsCBL6、MsCBL7和MsCBL10具有相互作用，且與MsCBL10相互作用較強(qiáng)（圖4）。、、和的組織表達(dá)譜表明，與MsCIPK2相互作用較強(qiáng)的MsCBL10與其表達(dá)譜一致，在紫花苜蓿根中表達(dá)量最高，花中表達(dá)量最低（圖2和圖5）。在Held等[24]研究中，由AKT2YC和YN-CIPK6組裝形成的YFP熒光蛋白主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，同時證明了AKT2只與CIPK6特異性相互作用；該研究還利用酵母雙雜交篩選到CBL4與CIPK6特異性相互作用，并且證明了CBL4的豆蔻?；妥貦磅；碾p重脂質(zhì)修飾介導(dǎo)了Ca2+-CBL4-CIPK6激活鉀離子通道蛋白AKT2，將CIPK6-AKT2從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)到細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)揮功能。由此可以推測本研究定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紫花苜蓿MsCIPK2可能通過與其相互作用的MsCBL10調(diào)控下游靶蛋白在紫花苜蓿根中發(fā)揮功能。

3.2 MsCIPK2在非生物脅迫中的功能

為了進(jìn)一步研究響應(yīng)非生物脅迫的分子和生理機(jī)制，本研究利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因毛狀根（圖6）。利用qRT-PCR技術(shù)分析過表達(dá)株系對逆境脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)量變化，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因毛狀根株系的逆境脅迫響應(yīng)基因表達(dá)倍數(shù)均大于對照（圖7）。在非生物脅迫環(huán)境下，植物體細(xì)胞感知脅迫信號，調(diào)控相關(guān)基因，合成相應(yīng)蛋白，相關(guān)生理代謝被改變，啟動各種防護(hù)機(jī)制抵御和適應(yīng)逆境脅迫[25]。丙二醛是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，是有毒氧產(chǎn)生的指標(biāo)，與相對膜透性類似，對脅迫耐性同樣有負(fù)作用[26]。在脅迫條件下，超氧化物歧化酶（SOD）可以清除超氧陰離子自由基，較高的超氧化物歧化酶活性可以積極地提高植物的應(yīng)激耐力[27]。脯氨酸和可溶性糖是高等植物中常見的2種重要的親和性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它們被認(rèn)為與抗逆性有關(guān)。本研究中檢測轉(zhuǎn)基因毛狀根根系中丙二醛含量、SOD活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量均低于或高于對照（圖8）。對過量表達(dá)株系進(jìn)行非生物脅迫響應(yīng)基因相對表達(dá)量分析，對于了解基因在植物體內(nèi)可能的分子機(jī)制、發(fā)揮作用的原理以及響應(yīng)非生物脅迫的信號通路都具有重要非常重要的參考價值。玉米提高了脅迫應(yīng)答基因的相對表達(dá)量，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性[28]。過表達(dá)大豆毛狀根可以提高鹽脅迫響應(yīng)基因（和）和氧化脅迫響應(yīng)基因（和）的相對表達(dá)水平[29]。過表達(dá)小麥提高了轉(zhuǎn)基因植株中干旱脅迫相關(guān)基因（、和）的相對表達(dá)水平，在擬南芥中過表達(dá)提高植物的抗旱性，與對照相比，過量表達(dá)擬南芥中丙二醛含量相對較低、抗氧化酶活性和脯氨酸含量相對較高[30]。過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草在低溫和鹽脅迫下表現(xiàn)出較高的葉綠素和可溶性糖含量、較高的過氧化氫酶活性、較低的過氧化氫和丙二醛含量[31]。因此，過量表達(dá)可能通過提高抗逆相關(guān)基因的表達(dá)水平，產(chǎn)生更多的抵御氧化脅迫的物質(zhì)，從而提高紫花苜蓿的抗逆性。

綜上所述，在紫花苜蓿響應(yīng)鹽和干旱脅迫信號通路中發(fā)揮重要功能，可作為紫花苜?？鼓嬗N的候選基因，為紫花苜?？鼓嬗N提供理論與實踐支撐。

4 結(jié)論

成功克隆，發(fā)現(xiàn)其在紫花苜蓿根中表達(dá)量最高，在花中表達(dá)量最低，蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與MsCBL10具有較強(qiáng)的相互作用。過量表達(dá)提高轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿毛狀根中響應(yīng)非生物脅迫基因的表達(dá)水平；與對照相比，過量表達(dá)毛狀根丙二醛含量相對較低，POD活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量相對較高，具有更高的耐鹽和耐旱性。

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Cloning and Functional Analyses ofin

1Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;2School of Life Sciences, Inner Mongolia University, Hohhot 010021

【Objective】CIPKs are a group of important protein kinase involved in signaling pathway of plant in response to stress. They can form CBL-CIPK complex with CBL, to activate the expression of related responsive genes to cope with various abiotic stresses in cells. Exploration and study on the molecular mechanism ofgenes in alfalfa in response to abiotic stress will help to reveal the biological basis of stress resistance in alfalfa, and to provide new gene resources for alfalfa breeding with enhanced stress resistance. 【Method】Thegene was cloned by using PCR, the sequence was analyzed by bioinformatics tools, and the expression level of,,,andgenes in various tissues were analyzed by using qRT-PCR. The pCAMBIA1302-GFP-MsCIPK2 vector was transiently expressed in tobacco leaf epidermal cells, and the subcellular localization was observed under laser confocal microscope. Yeast two-hybrid assay was used to analyze interaction between MsCIPK2 and four MsCBLs proteins.was used to generate alfalfa hairy roots over-expressing. qRT-PCRs were used to analyze the expression levels of related genes in transgenic hairy root lines. 【Result】The coding sequence ofgene was obtained by using PCR, and it is 1 230 bp in length, encoding 409 amino acids. The deduced MsCIPK2 protein contained typical ATP binding site, activation loop, NAF motif and PPI motif as for the CIPK family genes. The expression level ofgene was the highest in roots, and the lowest in the flowers of alfalfa. Subcellular localization results showed that MsCIPK2 protein was localized in the endoplasmic reticulum. Yeast two-hybrid assays showed that MsCIPK2 protein interacted with MsCBL2, MsCBL6, MsCBL7 and MsCBL10 proteins, showing stronger interaction with MsCBL10 than with other MsCBLs. The expression levels of,, andwere the highest in roots of alfalfa, and the expression level ofwas the highest in pods. qRT-PCR results showed that the expression levels of abiotic stress-associated genes,,,,andwere significantly up-regulated in hairy roots over-expressing. Under the treatment of 200 mmol·L-1NaCl and 20% PEG, when compared with the control hairy root line, hairy roots over-expressinghad lower MDA content, and higher POD activity, proline content and soluble sugar content. 【Conclusion】MsCIPK2 can interact with CBL protein, and responded to salt and drought stress in roots of alfalfa. Over-expression ofcan improve salt and drought stress resistance in alfalfa, andcan be used as candidate gene for alfalfa breeding with improved abiotic stress resistance.

Alfalfa; CIPK; CBL; abiotic stress

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.19.002

2022-04-21；

2022-06-02

國家自然科學(xué)基金（31901386，U1906201）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項目（ASTIP-IAS10）

蘇倩，E-mail：2646335315@qq.com。通信作者龐永珍，E-mail：pangyongzhen@caas.cn。通信作者祁智，E-mail：qizhi@imu.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）