黃 威，劉正杰

(安徽大學a.化學化工學院；b.物質科學與信息技術研究院，安徽合肥 230601)

黏度是細胞內的一個重要微環(huán)境參數(shù)，在維持細胞信號轉導、分子間相互作用、營養(yǎng)物質運輸和代謝產物擴散等生理過程起至關重要的作用[1-2]。人體細胞器黏度維持在一定范圍，黏度異常會影響細胞正常生理過程，從而誘發(fā)一系列的疾病[3-5]。例如，腫瘤細胞內的溶酶體黏度通常高于正常細胞，以此可作為腫瘤診斷的標志[6]。作為細胞中最重要的亞細胞結構之一，線粒體在細胞代謝和凋亡中起關鍵作用。研究證明，線粒體黏度的變化會影響線粒體的正常功能[7]，這與細胞色素C的釋放和膜的流動性變化有關。線粒體黏度異常能夠直接影響細胞代謝過程，進而引起神經退行性疾病、高血脂癥、惡性腫瘤等[8-9]。因此，監(jiān)測線粒體黏度具有重要意義。

傳統(tǒng)的黏度監(jiān)測工具如落球式、杯式和毛細管黏度計只適用于體外黏度測量，無法實現(xiàn)細胞層面的黏度監(jiān)測[10-11]。熒光探針具備非破壞性標記、高靈敏度和高時空分辨率等優(yōu)點，已成為監(jiān)測細胞內黏度的一種重要工具[12-13]。近年，監(jiān)測線粒體黏度的探針被相繼報道，Zou等[14]合成一種小分子熒光探針，實現(xiàn)了對線粒體黏度變化的實時成像追蹤，并發(fā)現(xiàn)線粒體在自噬過程中黏度升高；Cui等[15]合成一種對黏度較敏感的探針，實現(xiàn)了對正常和去極化線粒體黏度變化的可區(qū)分成像。然而，目前多數(shù)用于黏度測定的探針是基于熒光的強度信息，測定結果受到與黏度無關因素如光漂白、探針濃度、激發(fā)光強度等的影響[16]。與熒光強度不同，熒光壽命與熒光團濃度無關，這為監(jiān)測復雜細胞環(huán)境中的黏度提供了更可靠的信息[17]。針對上述問題，設計一種對線粒體黏度敏感且同時具有熒光強度和熒光壽命響應的小分子探針2-[2-(5-二苯胺噻吩基)乙烯基]-1,3,3-三甲基-H-吲哚碘鹽，以期通過熒光強度和壽命的變化實現(xiàn)對細胞凋亡過程中線粒體黏度的監(jiān)測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

實驗儀器為旋轉蒸發(fā)儀(RE-52AA，德國艾卡)、熒光光譜儀(F-7000，日本日立)、真空干燥箱(FD-1C-80，上海比朗儀器)、紫外-可見吸收光譜儀(UH5300，日本日立)、超快時間分辨熒光光譜儀(FLUOROMAXPLUS-P，日本掘場)、高分辨質譜儀(LTQ Orbitrap XL，美國賽默飛公司)、激光掃描共聚焦顯微鏡(TCS SP8，德國徠卡)。

碘甲烷、二苯胺、5-溴-2-噻吩醛、2,3,3-三甲基吲哚、甲基三辛基氯化銨、鄰二氯苯、碳酸鉀、小牛胸腺DNA、酵母RNA 均購于上海阿拉丁公司；乙醇、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、石油醚購于上海國藥試劑公司；MTT(噻唑藍溴化四唑)、硫氫化鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、過氧化氫、硫酸鈉、亞硫酸鈉、次氯酸、氯化鈣、賴氨酸、谷胱甘肽購于美國Sigma公司。

1.2 探針分子的合成

探針分子的合成路線如圖1。

圖1 探針分子的合成路線Fig.1 Synthetic routes of probe molecule

1.2.1 化合物1的合成

稱取2.03 g 二苯胺(12.0 mmol)、2.85 g 5-溴-2-噻吩醛(15.0 mmol)置于250 mL 的圓底燒瓶中，依次加入碳酸鉀(2.07 g，15.0 mmol)、銅(0.23 g，3.6 mmol)、甲基三辛基氯化銨(1.00 g，2.5 mmol)，再加入100 mL鄰二氯苯使其溶解，設置溫度為120 ℃，冷凝回流，反應48 h。反應液冷卻后進行減壓抽濾，取濾液，蒸除多余的溶劑，得到油狀物。使用柱層析對所得的粗產物進一步分離純化，洗脫劑為石油醚與乙酸乙酯(體積比=20∶1)，最終得到黃色固體化合物1(1.00 g，產率30%)?；衔?的核磁數(shù)據(jù)如圖2。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ9.56(s,1H),7.70(d,J=4.3 Hz,1H),7.46～7.40(m,4H),7.34～7.25(m,6H),6.30(d,J=4.3 Hz,1H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ182.29, 163.94, 146.07, 140.42, 130.65, 130.07, 127.10, 126.17, 111.89, 40.69, 40.48,40.27,40.06,39.85,39.64,39.43。

圖2 化合物1的1H NMR和13C NMRFig.2 1H NMR and 13C NMR spectrum of compound 1

1.2.2 化合物2的合成

稱取1.59 g 2,3,3-三甲基吲哚(10.0 mmol)、1.70 g 碘甲烷(12.0 mmol)置于250 mL 的圓底燒瓶中，取50 mL乙腈溶解，設置溫度為80 ℃，冷凝回流，反應12 h。反應冷卻后除去多余的溶劑，通過減壓抽濾得到紫紅色固體化合物2(2.20 g，產率73%)。所得產物用乙腈洗滌3 次即可，無需進一步純化。化合物2 的核磁數(shù)據(jù)如圖3。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ7.90～7.85 (m,1H),7.82～7.76 (m,1H),7.62～7.54 (m,2H),3.94 (s,3H),2.74(s,3H),1.49(s,6H);13C NMR(101 MHz,DMSO-d6)δ196.56,142.66,142.16,129.86,129.36,123.85,115.68,54.47,35.29,22.25,14.74。

圖3 化合物2的1H NMR和13C NMRFig.3 1H NMR and 13C NMR spectrum of compound 2

1.2.3 探針分子的合成

稱取0.28 g化合物1(1.0 mmol)、0.30 g化合物2(1.0 mmol)置于150 mL的圓底燒瓶中，取40 mL乙醇作為溶劑，溶解固體，設置溫度為80℃，冷凝回流，反應24 h。反應液冷卻后除去多余溶劑，使用洗脫劑二氯甲烷與甲醇(體積比=30∶1)的柱層析對粗產物進行純化，得到紫黑色固體2-[2-(5-二苯胺噻吩基)乙烯基]-1,3,3-三甲基-H-吲哚碘鹽(0.29 g，產率50%)。探針分子的核磁數(shù)據(jù)如圖4。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ8.44(d,J=15.0 Hz,1H),8.00(d,J=4.7 Hz,1H),7.66(d,J=7.4 Hz,1H),7.58～7.33(m,13H),6.51～6.41(m,2H),3.73(s,3H),1.64(s,6H);13C NMR(101 MHz,DMSO-d6)δ178.26,168.85,146.28,145.25,142.71,142.59,130.98,129.16,128.51,128.16,127.37,126.82,123.06,114.23,113.40,103.11,50.82,32.98,26.78。

圖4 探針分子的1H NMR和13C NMRFig.4 1H NMR and 13C NMR spectrum of probe molecule

1.3 探針分子光譜性質的表征

1.3.1 熒光及吸收光譜

將探針分子分別溶解在水和甘油(用水模擬低黏度環(huán)境，甘油模擬高黏度環(huán)境)體系中，配制成濃度為1×10-5mol/L的2種工作溶液。采用紫外-可見吸收光譜儀測量探針分子的吸收光譜，激發(fā)光波長為570 nm。

1.3.2 熒光強度選擇性實驗

配制一系列不同分析物(包括無機鹽、還原性硫、活性氧、氨基酸、核酸等)的溶液，加入探針使其濃度為1×10-5mol/L，使用熒光光譜儀測定探針在各溶液中的熒光強度。

1.3.3 黏度響應實驗

在水和甘油體系中，通過改變甘油比例來模擬不同的黏度(η)環(huán)境。將探針加入不同黏度的水-甘油混合體系中，配制成濃度為1×10-5mol/L 的探針溶液，使用熒光光譜儀和超快時間分辨熒光光譜儀測定不同黏度環(huán)境下探針分子的熒光強度和熒光壽命。

1.4 細胞培養(yǎng)及染色

細胞培養(yǎng)：Hep G2(人肝癌細胞)購于中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所，將其置于含10%(體積分數(shù))胎牛血清和1%(體積分數(shù))青霉素-鏈霉素抗生素的DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)；將細胞培養(yǎng)瓶置于5%CO2(體積分數(shù))培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。

活細胞成像：將探針分子以二甲基亞砜為溶劑配制成濃度為1 mmol/L 的母液，成像時用培養(yǎng)基稀釋；將接種的Hep G2 細胞在適量濃度的探針分子稀釋液中孵育30 min 后，采用PBS(磷酸鹽緩沖液)緩沖液清洗3～5次，通過共聚焦熒光顯微鏡成像，采用如下公式計算細胞的存活率D。

式中：A為加樣孔中在492 nm 處的吸光度；B為對照組孔在492 nm 處的吸光度；C為空白對照組孔在492 nm處的吸光度。

2 結果與分析

2.1 探針分子的光譜性質

2.1.1 吸收和熒光光譜性質

圖5顯示：探針處于水環(huán)境時，在波長為575 nm處有一個明顯的吸收峰，而(探針)處于高黏度的甘油環(huán)境中時，吸收峰紅移至585 nm 處；探針在水中幾乎沒有熒光信號，在甘油中有明顯的熒光增強，發(fā)射波長在650 nm 左右。這是由于高黏度的環(huán)境限制探針的分子內旋轉，抑制非輻射躍遷，從而導致熒光增強。

圖5 探針的光譜性質Fig.5 Spectral properties of probe

2.1.2 熒光強度選擇性

探針的熒光強度選擇性實驗結果如圖6。圖中：1 為blank；2 為Na+；3 為K+；4 為Mg2+；5 為Ca2+；6 為SO42-；7 為SO32-；8 為HPO4-；9 為H2S；10 為HClO；11 為H2O2；12 為賴氨酸；13 為谷胱甘肽；14 為RNA；15 為DNA；16 為甘油。樣品1～13 的濃度為100 mmol/L；樣品14，15 的質量濃度為0.025 mg/mL；樣品16 為純甘油。由圖6 可看出，探針僅對黏度有很強的熒光強度響應，對其他分析物如無機鹽、氨基酸、核酸等無響應。

圖6 探針的熒光強度選擇性Fig.6 Selectivity based on fluorescence intensity of probe

2.2 探針分子對黏度的響應

2.2.1 熒光強度對黏度的響應

圖7(a)為探針在不同黏度環(huán)境下的熒光光譜及其與黏度的響應關系。由圖7可知：在低黏度環(huán)境下探針分子有熒光響應，隨甘油含量的增加探針分子的熒光強度增強，純甘油中的熒光強度為純水中的50倍，表明探針對黏度高度敏感；探針的熒光強度與其所處環(huán)境黏度符合良好的線性關系，R2=0.99。

圖7 探針熒光強度對黏度變化的響應Fig.7 Response of probe fluorescence intensity to viscosity change

2.2.2 熒光壽命對黏度的響應

探針熒光壽命及其與黏度的響應關系如圖8。由圖8 可看出：在不同黏度環(huán)境下，探針的熒光壽命也表現(xiàn)出高度敏感，純水環(huán)境中探針的熒光壽命僅0.027 ns，純甘油中可達1.903 ns；與熒光強度相似，探針的熒光壽命與其所處環(huán)境黏度在一定范圍內也符合良好的線性關系，R2= 0.99。

圖8 探針熒光壽命對黏度變化的響應Fig.8 Response of probe fluorescence lifetime to viscosity change

2.3 探針分子的細胞毒性

細胞中加入外源性的物質或毒性大的探針分子時會對細胞正常的生理代謝活動產生影響，使細胞進入應激狀態(tài)，導致細胞產生過量的活性氧，繼而破壞細胞穩(wěn)態(tài)，毒性較大時甚至會引發(fā)細胞的自噬和凋亡。不同探針分子濃度下的細胞存活率如圖9。由圖9 可看出：探針濃度達10 μmol/L 時，Hep G2 細胞仍擁有80%以上的存活率；探針濃度為2 μmol/L時，Hep G2 細胞存活率可達90%，表明該濃度下的探針幾乎不會對細胞的存活和生長產生影響。

圖9 探針的細胞毒性實驗結果Fig.9 Cytotoxicity test results of probe

2.4 探針分子在細胞中的定位

探針在細胞中的定位情況如圖10。由圖10可看出，探針的熒光信號與線粒體商染重疊度較高。采用共聚焦軟件計算得到探針通道與線粒體商染的共定位系數(shù)為0.83，表明探針在細胞中能夠靶向線粒體，這是由于線粒體具有-180～-200 mV的膜電勢，探針帶正電，能夠較好地在線粒體內膜上富集。

圖10 探針的共定位實驗結果Fig.10 Co-location experimental results of probe

2.5 探針分子對線粒體黏度變化的實時監(jiān)測

為研究細胞凋亡過程中線粒體黏度的變化，使用外源性的制霉菌素刺激細胞凋亡，采用共聚焦顯微鏡觀察此過程中探針熒光強度和熒光壽命的變化，結果如圖11。

圖11 線粒體黏度的實時監(jiān)測Fig.11 Real-time monitoring of mitochondrial viscosity

由圖11(a)可見：探針在線粒體中的熒光強度隨時間的增加而增強，說明線粒體黏度上升；線粒體黏度隨凋亡水平的增加而逐漸增加，這一結果與之前的報道[12]是一致的。但是，由于熒光強度受到探針濃度或光漂白的干擾，僅通過熒光強度成像分析難以準確計算出黏度，因此使用熒光壽命成像對實驗結果進行分析。由圖11(a)中熒光壽命成像可見：在初始狀態(tài)下，探針在線粒體中的熒光壽命為0.824 ns，對應黏度為78.79 mPa·s；進一步培養(yǎng)30 min 后，熒光壽命延長至0.986 ns，相應黏度為121.09 mPa·s，如圖11(b)，(c)，證實線粒體黏度增加；用另一種凋亡誘導劑依托泊苷處理細胞時也得到了類似的結果，如圖11(d)～(f)。

3 結論

設計合成一種用于監(jiān)測線粒體黏度的小分子熒光探針2-[2-(5-二苯胺噻吩基)乙烯基]-1,3,3-三甲基-H-吲哚碘鹽。結果表明：探針對線粒體具有特異性靶向，對黏度敏感且熒光響應迅速；利用探針，結合共聚焦顯微鏡的熒光強度和壽命成像，可實現(xiàn)不同生理過程中黏度的雙模式成像。這種活細胞成像的策略可進一步用于動態(tài)監(jiān)測線粒體黏度的變化，為線粒體生理學的研究提供潛在工具。