芘降解菌Pseudomonas sp. PR3的植物促生特性及其對芘脅迫下水稻生長的影響

高曉蓉 丁堯 呂軍

（1. 大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院，大連 116024；2. 遼寧省水稻研究所，沈陽 110101）

多 環(huán) 芳 烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一類強疏水性、難降解的持久性有機污染物，它們可通過多種途徑進入人體，威脅人類健康，而且隨著分子量的增加，其毒性也增加［1-2］。PAHs易被土壤顆粒吸附，環(huán)境中90%的PAHs都積累在表層土壤中，已成為我國農(nóng)業(yè)土壤中的主要有機污染物，是影響作物生長及食品安全的主要因素之一［3］。調(diào)查顯示，我國許多地區(qū)的小麥等糧食作物均受到不同程度的PAHs污染［4］。在PAHs脅迫下，植物體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，造成活性氧（reactive oxygen species，ROS）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）過度積累，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、脂質(zhì)過氧化、核苷酸降解等［5］。此外，PAHs還會影響葉綠素和植物激素的合成、糖和氨基酸的代謝，以及降低植物對水分及養(yǎng)分的利用率，從而抑制植物的生長和發(fā)育［6］。植物為應(yīng)對脅迫會產(chǎn)生可溶性物質(zhì)（糖、脯氨酸等）、抗氧化劑或抗氧化酶來降低氧化應(yīng)激造成的損傷，然而當(dāng)植物長期暴露于PAHs污染時，ROS的積累超過了抗氧化系統(tǒng)可處理的水平，損傷仍會發(fā)生，進而影響植物的生長［7］。通過提高土壤中PAHs的去除率或降低土壤中PAHs的生物利用度等途徑可減少PAHs對植物的脅迫［8］。然而，在不破壞土壤生態(tài)功能和不中斷農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的前提下，許多常規(guī)的物理和化學(xué)方法顯然不適合在農(nóng)業(yè)污染土壤中廣泛應(yīng)用。多項研究結(jié)果表明，土壤微生物在提高根際PAHs降解、降低植物對PAHs的吸收積累以及緩解PAHs脅迫等方面有很大潛能［9］。但是，也有研究認為，降解菌株僅可緩解污染物對植物生長的不良影響，并且污染物常與土壤貧瘠、鹽堿化等其他環(huán)境脅迫共存，因此降解菌株對植物生長的促進作用往往十分有限，極大限制了降解菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用［10］。植物根際促生菌（plant growthpromoting rhizobacteria，PGPR）作為與植物根際環(huán)境密切相關(guān)的微生物，能夠通過溶磷作用、產(chǎn)鐵載體等提高植物對營養(yǎng)物的利用能力、分泌植物激素（IAA、赤霉素等）、提高抗氧化酶活性等途徑提高植物抗逆性和促進植物生長，被廣泛研究應(yīng)用于各種環(huán)境中［11］。因此，降解菌與PGPR的聯(lián)合應(yīng)用較單一菌種更具優(yōu)勢，但這種方式大大增加了操作的復(fù)雜性和不確定性［12］。在此基礎(chǔ)上，Ghosal等［13］提出，兼具植物促生特性和降解污染物能力的菌株具有更廣闊的應(yīng)用前景。目前已分離到一些具有植物促生能力的PAHs降解菌，Li等［14］分離到的克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）PD3不僅在12 d內(nèi)對菲的降解率達到78.6%，而且還具有植物促生特性，可顯著降低水稻體內(nèi)的ROS積累、乙烯產(chǎn)生和電解質(zhì)滲漏，但多數(shù)PAHs降解菌的植物促生特性仍未得到充分研究。

多環(huán)芳烴分子中，含4個及以上芳香環(huán)的高分 子 量 PAHs（high-molecular-weight PAHs，HMWPAHs），由于其更強的生物毒性以及難降解性成為近年來研究的重點，分離獲得具有HMW-PAHs降解能力和同時兼具植物促生特性的菌株尚不多見。本研究從石油污染地的蘆葦根際篩選獲得一株具有芘降解能力和促進植物生長特性的菌株P(guān)seudomonas sp.PR3，通過探究其對芘的降解能力，以及芘脅迫下對水稻生長的促進作用，減少水稻體內(nèi)芘的吸收積累效果，以期為PAHs污染農(nóng)田中保障作物安全高效生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物及土壤樣品 從盤錦市某石油開采場地附近采集長勢良好的蘆葦（Phragmites australis）根及根際土壤，封裝于無菌保鮮袋中，帶回實驗室4℃保存?zhèn)溆?。無PAHs污染的土壤樣品取自附近村莊的農(nóng)田，自然風(fēng)干后過1 mm篩備用。水稻種子（‘越光’品種）由遼寧省水稻研究所提供。

1.1.2 試劑 萘（naphthalene，Nap）、菲（phenanthrene，Phe）、芘（pyrene，Pyr）標準品均購自百靈威科技有限公司（北京），苯并（a）芘（benzo（a）pyrene，Bap）購自東京化成工業(yè)株式會社（TCI），純度超過98%。丙酮、正己烷和乙腈均為色譜級，其他試劑均為分析級。

1.1.3 培養(yǎng)基 菌株生長及檢測促進植物生長特性所用的LB、King’s B、NBRIP和CAS檢測培養(yǎng)基與之前的研究描述的一致［15-17］。無機鹽培養(yǎng)基（MSM，pH7.0）含KH2PO44.4 g/L，K2HPO41.7 g/L，NaCl 2.1 g/L，NH4Cl 3.0 g/L，MgSO40.195 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，F(xiàn)eSO4·H2O 0.01 g/L，CaCl2·H2O 0.003 g/L。配置20 mg/mL芘的丙酮溶液，待丙酮完全揮發(fā)后，按比例加入滅菌的MSM，配制成不同芘濃度的無機鹽培養(yǎng)基（PMM）。

上述液體培養(yǎng)基中添加15 g/L瓊脂制備固體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 芘降解菌的篩選 用毛刷輕輕去除蘆葦根表黏附的土壤后，用無菌水緩慢沖洗根部30 s，濾紙吸干后，剪取5 g根浸泡在10 mL無菌水中，超聲處理1 min，得到根表菌懸液［18］。取5 mL菌懸液接種到含有50 mg/L芘的100 mL PMM培養(yǎng)基中，30℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)。每7 d取5 mL富集培養(yǎng)物接種至新鮮的PMM培養(yǎng)基中，共轉(zhuǎn)接3次，并逐步提高PMM中芘的濃度至200 mg/L。將最終的富集培養(yǎng)物用無菌水進行梯度稀釋，涂布于芘濃度為50 mg/L的PMM平板上，30℃培養(yǎng)7 d至長出可見菌落，將生長狀態(tài)良好的菌落初步標記為芘降解菌［19］。

將各菌株分別接種至LB培養(yǎng)基中，30℃ 170 r/min培養(yǎng)過夜，5 000 r/min離心10 min收集菌體，用新鮮的MSM清洗兩次，最后用MSM重懸菌液至OD600值為0.5。將5 mL菌液轉(zhuǎn)移至20 mL無菌棕色瓶，其中芘的終濃度為10 mg/L，30℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后，采用HPLC測定殘余芘含量。

芘的測定采用HPLC（Agilent-1200，美國），色 譜 柱 為 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18，4.6 mm×250 mm，柱溫25℃，流動相為乙腈和水（80∶20，V∶V），流速 1 mL/min，進樣量 20 μL，檢測波長為375 nm。

1.2.2 菌株植物促生特性測定 將菌株以1%接種至含有L-色氨酸（200 mg/L）的LB培養(yǎng)基中，30℃ 170 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后測定培養(yǎng)物中IAA含量。檢測方法參照文獻［20］。

利用改進的雙層平板法對鐵載體產(chǎn)生進行定性檢測［21］。取 2 μL過夜生長的菌液（OD600=1.0）接種于King’s B固體培養(yǎng)基上，30℃ 培養(yǎng)12 h，在上層緩慢倒入等體積的CAS檢測培養(yǎng)基（含1%瓊脂），30℃倒置培養(yǎng)4 h后觀察黃色暈圈的產(chǎn)生，測量顯色圈直徑/菌落直徑（D/d）的比值。利用King’s B液體培養(yǎng)基進行鐵載體的定量檢測［22］。菌株以1%的接種量于King’s B培養(yǎng)基中30℃ 170 r/min培養(yǎng)4 d后，10 000 r/min離心10 min，將上清液與等體積的CAS檢測液混合，靜置1 h后于630 nm處測得吸光值A(chǔ)s，將未接菌的培養(yǎng)基與CAS檢測液混合測得吸光值A(chǔ)r。培養(yǎng)物中產(chǎn)生的鐵載體含量以鐵載體活性單位（SU）表示，計算公式為：鐵載體活性單位（SU）=［（Ar-As）/Ar］×100%。

利 用 含 0.5%（W∶V）Ca3（PO4）2的 NBRIP培養(yǎng)基檢測菌株溶磷能力。將菌株以2%（OD600=1.0）接種量接種至NBRIP培養(yǎng)基中，30℃ 170 r/min培養(yǎng)7 d，根據(jù)鉬銻抗比色法測定上清液中可溶性磷含量［23］。

1.2.3 菌株16S rRNA基因序列分析 根據(jù)芘降解能力和促生特性篩選得到目的菌株P(guān)R3，將菌株送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行16S rRNA基因擴增及測序，選擇通用引物926F（5'-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3'） 和 518R（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'）。 測 序 結(jié) 果 利 用NCBI Blast進行序列比對分析，然后利用MEGA-X軟件Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株P(guān)R3對PAHs的降解能力測定 參照1.2.1所述方法檢測菌株P(guān)R3對20 mg/L芘的降解能力，在30℃ 170 r/min震蕩培養(yǎng)14 d。每隔24 h整瓶取樣，測定培養(yǎng)基中芘的濃度，并用稀釋涂布平板法測定其生長曲線。利用相同的方法，檢測PR3對5、10、50 mg/L芘以及50 mg/L萘、50 mg/L菲、10 mg/L苯并（a）芘的降解能力。萘、菲、苯并（a）芘的HPLC檢測基于之前的研究，作部分改進［24- 25］。

1.2.5 芘脅迫下的植物促生長試驗 將一定量芘的丙酮溶液均勻噴灑到土壤樣品中，使得土壤中芘的理論含量為10 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg。將土壤樣品暗處靜置7 d，待其中的丙酮完全揮發(fā)后，將其充分攪拌均勻，在室溫下暗處老化6個月。盆栽試驗前，檢測到不同污染水平的土壤樣品中芘的初始濃度分別為 0 mg/kg（S0）、9.58 mg/kg（S1）、43.80 mg/kg（S2）和 90.67 mg/kg（S3）。

選取籽粒飽滿、大小均勻的水稻種子，在50℃下孵育15 min，用0.5%的次氯酸鈉表面消毒后，立即用無菌水清洗3次，選取顆粒飽滿的種子轉(zhuǎn)移至濕潤的濾紙上，30℃避光發(fā)芽。

試驗共設(shè)置4組處理：CK，僅含污染土壤；CB，污染土壤中僅接種了PR3菌株；CP，污染土壤中僅種植水稻；CPR，污染土壤中種植水稻，并通過灌根法接種PR3菌株。每個處理設(shè)3個重復(fù)。在燒杯中稱取300 g不同污染水平的土壤，澆灌無菌水使其含水量在60%左右。取避光發(fā)芽7 d后的幼苗接種至燒杯中，每盆12株，用菌株P(guān)R3的無菌水菌懸液（OD600=1.0）灌溉土壤（CB和CPR），每個燒杯添加20 mL，并用等體積的無菌水澆灌CK和CP對照組的土壤，將所有樣品置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d，光照周期為16 h光照/8 h 黑暗，培養(yǎng)溫度為（28±2）℃，定期澆水并交換燒杯位置以保證均勻的光照。

1.2.6 植物生物量及葉綠素含量測定 從土壤中取出植物樣品，洗掉根表黏附的泥土，用吸水紙吸干植物表面的水，測量植物株高、根長，分離新鮮植物的根與莖葉，分別測量其鮮重（fresh weight，F(xiàn)W）。然后將植物組織在70℃烘箱中烘干48 h，以確定其干重（dry weight，DW）。

采用分光光度法測定植物中葉綠素的含量［26］。稱取0.02 g植物的葉片，剪碎后加入2 mL 80%的丙酮溶液，室溫條件下置于暗處靜置提取12 h，使用多功能酶標儀（瑞士帝肯公司）測定提取液在663 nm和645 nm處的吸光度值A(chǔ)663和A645。根據(jù)公式計算葉綠素a和葉綠素b的含量：

葉 綠 素 a含 量 Ca（mg/g FW）=（12.7×A663-2.69×A645）×V/W ；

葉綠素 b含量 Cb（mg/g FW）=（22.9×A645-4.68×A663）×V/W。

1.2.7 抗氧化酶活性及丙二醛含量測定 稱取新鮮的植物葉片，剪碎后加入5 mL預(yù)冷的含有1% PVP的0.1 mol/L PBS（pH 6.8）中，研磨制成勻漿，然后將其轉(zhuǎn)移至滅菌的離心管中，4℃ 10 000 r/min離心30 min。收集上清液作為粗酶提取液，4℃保存。取上清液用Bradford法測定總蛋白含量，過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）酶活性以及丙二醛（MDA）含量均使用Solarbio試劑盒（北京）進行測定，根據(jù)總蛋白含量進行計算［27］。

1.2.8 植物及土壤中芘含量的HPLC測定 植物樣品和土壤中芘的提取和檢測如前所述，并稍作改進［28］。稱取一定量凍干后的植物樣品，剪碎后加入10 mL丙酮和二氯甲烷的混合溶液（V∶V=1∶1），超聲萃取30 min，重復(fù)3次。收集萃取液，30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后加入4 mL丙酮溶解，用0.22 μm濾膜過濾后得到芘提取液，用HPLC對其進行分析。土壤中殘余的芘的提取方法與之相同。HPLC檢測條件與1.2.1中描述的一致。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2016進行處理和制圖，數(shù)據(jù)以均值±標準差（SD）的形式表示，圖中的每個數(shù)據(jù)表示至少有3個平行，平行樣品的標準差用誤差線表示。用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析，用單因素方差分析確定數(shù)據(jù)組間的統(tǒng)計學(xué)差異。不同字母標記表示P＜0.05水平下差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 具植物促生特性的芘降解菌株的分離篩選

30℃培養(yǎng)7 d后，在含有芘（50 mg/L）的PMM固體培養(yǎng)基上隨機挑取生長良好的單克隆菌落，分別在10 mg/L芘濃度下測定降解能力。其中有6個菌株具有明顯降解能力，7 d內(nèi)對芘的降解率均在90%以上。分別測定了這些菌株溶解無機磷、產(chǎn)IAA和鐵載體的能力（表1）。結(jié)果表明，6株菌均具有較強的溶磷能力，7 d內(nèi)溶磷量可達736.77-893.46 mg/L。而IAA合成能力差異較大，編號為1、3、4、5菌株具有較強的IAA合成能力，其中PR3菌株合成量最高，可達（14.46±0.20）mg/L。CAS固體培養(yǎng)基檢測和鐵載體單位測定均顯示菌株P(guān)R1、PR2、PR3的鐵載體合成能力遠高于其他3株，鐵載體活性單位在57.67%-62.57%之間。綜合以上結(jié)果，選擇促生特性最明顯的菌株P(guān)R3作為目的菌株。

表1 菌株的植物促生特性Table 1 Plant growth-promoting traits of the isolated strains

2.2 菌株P(guān)R3的鑒定

對菌株P(guān)R3進行多次劃線純化后，挑取單克隆菌落進行基因測序分析。通過在NCBI上進行Blast序列比對分析，菌株P(guān)R3的16S rRNA基因序列與Pseudomonas putida和Pseudomonas monteilii最為接近，同源性達到99%以上。菌株P(guān)R3為假單胞菌Pseudomonas sp.，構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹如圖1所示。

圖1 菌株P(guān)R3的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of strain PR3

2.3 菌株P(guān)R3對PAHs的降解

2.3.1 菌株P(guān)R3對芘的降解動力學(xué) 菌株P(guān)R3接種在含有20 mg/L 芘的PMM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)14 d測定其降解效果和生長情況。從圖2-A可以看出，第0-2天是菌株P(guān)R3生長的適應(yīng)期，之后進入對數(shù)生長階段，隨著菌株生物量的明顯增加，芘的降解速率也達到了最高。第10天時PR3的生物量達到最大值，為8.19 Log CFU/mL，此時芘降解率為80.30%，之后生長速率逐漸降低進入平臺期，其對芘降解速率也趨于平緩。培養(yǎng)14 d后，芘的降解率達到94%。

比較了不同芘濃度下菌株P(guān)R3的降解效果。如圖2-B所示，菌株P(guān)R3對5、10和20 mg/L的芘均具有較強的降解能力，分別在第8、12和16天降解完全（降解率大于99%），但當(dāng)芘的濃度達到50 mg/L時，其整體降解速率明顯較低，第15天時降解率為62.18%，之后降解趨于停止，第20天時降解率為63.82%，可能是高濃度芘對菌株P(guān)R3的生長產(chǎn)生抑制作用所致。

圖2 菌株P(guān)R3的芘降解能力Fig. 2 Degradation of pyrene by strain PR3

2.3.2 菌株P(guān)R3對其他PAHs的降解動力學(xué) 為探究菌株P(guān)R3對不同分子量的多環(huán)芳烴是否具有降解能力，選擇2環(huán)的萘（Nap）、3環(huán)的菲（Phe）和5環(huán)的苯并（a）芘（Bap），分別測定了該菌株培養(yǎng)7 d及14 d后的降解率（表2）。培養(yǎng)7 d后，PR3對Nap（50 mg/L）、Phe（50 mg/L）、Bap（10 mg/L）的降解率分別為91.56%、52.39%和46.37%，14 d后的降解率達到了92.45%、84.70%和47.16%。上述結(jié)果可以看出，菌株P(guān)R3對不同分子量的多環(huán)芳烴降解能力差異較大，這可能是由于隨著PAHs分子量的增加，其在水中的溶解度降低且生物毒性升高所導(dǎo)致。PR3對低分子量的多環(huán)芳烴（2環(huán)、3環(huán)）降解效率高，而對高分子量的苯并芘的降解速率明顯較低，但仍能實現(xiàn)部分降解。

表2 菌株P(guān)R3對其他PAHs的降解能力Table 2 Degradability of strain PR3 for other PAHs types

2.4 菌株P(guān)R3對芘污染土壤中水稻生長的影響

2.4.1 菌株P(guān)R3對水稻生物量的影響 圖3顯示出芘含量為未污染土壤（S0）、9.58 mg/kg（S1）、43.80 mg/kg（S2）和90.67 mg/kg（S3）不同污染水平下接種PR3對水稻生長的影響。如表3所示，芘對水稻生長的抑制作用與土壤中芘含量成正相關(guān)，低濃度芘（S1）脅迫對水稻生長的影響不明顯，在較高濃度芘處理（S2和S3）下，水稻地上部及根的生物量均顯著減少（P＜0.05）。在S3水平下，水稻地上部鮮重和干重分別降低了27.69%和36.27%，根鮮重和干重分別降低了34.96%和15.70%。接種PR3后水稻的生物量均顯著提高（P＜0.05），說明PR3可有效促進不同芘污染水平下水稻的生長。在S3水平下接種PR3，水稻地上部鮮重和干重分別增加了69.82%和69.91%，根鮮重和干重分別增加了82.95%和35.24%。

表3 接種菌株P(guān)R3 30 d后水稻的生物量Table 3 Biomass of rice at 30 d after inoculation with strain PR3

圖3 接種菌株P(guān)R3對水稻生長的影響Fig. 3 Effects of inoculated strain PR3 on rice growth

2.4.2 菌株P(guān)R3對水稻光合作用及氧化應(yīng)激水平的影響 為探究芘脅迫及接種PR3對水稻光合作用的影響，測定了不同處理下水稻的葉綠素含量。隨著芘含量的升高，水稻中總?cè)~綠素的含量均呈逐漸降低趨勢（圖4-A）。在高濃度芘（S3）脅迫下，葉綠素含量顯著降低（P＜0.05），其中葉綠素a和葉綠素b含量分別降低了20.81%和21.62%。接種PR3可顯著提高不同濃度芘脅迫下的葉綠素含量，對無污染條件下的葉綠素含量影響很小。其中，在S3水平下接種PR3，水稻葉綠素a和葉綠素b含量分別提高了56.15%和47.54%，表明接種PR3可顯著改善芘脅迫下水稻的光合作用。

SOD、POD等抗氧化酶可用于清除植物體內(nèi)在脅迫環(huán)境下產(chǎn)生的ROS，因此其酶活性可反映出植物氧化應(yīng)激的水平和自身調(diào)控以降低氧化損傷的能力，MDA則間接反映出植物體內(nèi)ROS的水平和膜損傷程度。如圖4-B、4-C所示，水稻葉片中SOD酶活性均顯著高于無污染對照組（P＜0.05），隨著芘污染濃度增加，SOD酶活性呈先升高后下降的趨勢，這表示其SOD酶活性的調(diào)控范圍有限，高濃度的芘脅迫下（S3），SOD酶活性受到一定抑制，而POD酶活性則與芘污染濃度呈正相關(guān)，顯示出其較強的調(diào)節(jié)能力。在接種PR3后，水稻的SOD和POD酶活性均有所提高。與未接菌對照組相比，SOD酶活性分別提高了21.31%（S1）、9.62%（S2）和11.49%（S3），POD酶活性分別提高了7.85%（S1）、36.74%（S2）和36.10%（S3）。如圖4-D所示，水稻葉片MDA含量與芘污染濃度呈正相關(guān)，與無污染對照組相比，其MDA含量上升了36.26%-75.08%，接種PR3后，其MDA含量均降至較低水平。以上結(jié)果均表明芘脅迫導(dǎo)致水稻中ROS增加以及膜損傷，接種PR3可提高水稻清除ROS的能力，減輕芘造成的氧化損傷。

圖4 菌株P(guān)R3對水稻光合作用及氧化應(yīng)激的影響Fig. 4 Effects of strain PR3 on photosynthesis and oxidative stress of rice

2.5 菌株P(guān)R3對土壤及水稻中芘含量的影響

隨著芘污染水平的提高，水稻中芘的積累量也逐漸增加，且根中芘含量顯著高于地上部（圖5-A）。接種菌株P(guān)R3后，各個污染水平下水稻中芘的含量均顯著降低（P＜0.05），與未接菌對照組相比，地上部中芘含量分別降低了57.17%（S1）、50.96%（S2）和49.81%（S3），根中芘含量分別降低了34.10%（S1）、53.01%（S2）和21.81%（S3），表明PR3在根際的定植可顯著減少水稻對芘的吸收積累。

根據(jù)圖5-B可知，在水稻（CP）、菌株P(guān)R3（CB）以及水稻與PR3協(xié)同（CPR）作用下，污染土壤中芘的含量均顯著降低（P＜0.05），其去除能力從高到低依次為CPR、CP和CB。接種PR3后，在水稻與PR3協(xié)同作用下，土壤中芘的去除率分別達到了86.22%（S1）、72.02%（S2）和74.31%（S3），與僅種植水稻（CP）相比，去除率提高了76.08%（S1）、14.15%（S2）和18.28%（S3）。此外，僅接種PR3對污染土壤中芘亦具有較強的去除能力，降解率可達37.19%（S1）、61.82%（S2）和55.28%（S3）。以上結(jié)果表明，根際接種PR3可有效降低土壤中芘含量，從而減少水稻對芘的吸收，降低芘對植物的損傷。

圖5 接種菌株P(guān)R3對水稻（A）及土壤（B）中芘含量的影響Fig. 5 Effects of strain PR3 on pyrene content in rice（A）and soil（B）

3 討論

由于燃煤、工業(yè)生產(chǎn)、石油開采等人類行為導(dǎo)致PAHs持續(xù)增加，近年來在許多農(nóng)田土壤及糧食作物中檢測到PAHs污染極大的引起人們關(guān)注，如何將糧食安全生產(chǎn)與污染物修復(fù)相結(jié)合是其中的關(guān)鍵。微生物修復(fù)由于其成本低，潛力大、對生態(tài)系統(tǒng)影響較小而得到了廣泛研究［29］。雖然污染土壤中普遍存在可降解PAHs的細菌，但有關(guān)高效降解HMW-PAHs的菌株研究較少。Nzila等［30］分離得到芘降解菌株Achromobacter xylosoxidans PY4，15 d內(nèi)對100 mg/L芘的降解率可達50%。Vaidya等［31］從污染土壤中分離得到由Pseudomonas sp. ASDP1，Burkholderia sp. ASDP2和Rhodococcus sp. ASDP3三個菌株組成的混合菌群，可在10 d內(nèi)有效降解100 mg/L的芘，同時對萘、菲也具有一定的降解能力。本研究從污染地植物根表分離到一株芘降解菌PR3，可在14 d內(nèi)降解20 mg/L芘，對萘、菲和苯并（a）芘也具有降解能力，對于較高濃度芘（50 mg/L）降解能力較低，降解率最高為63%，這可能由于高濃度芘具有更強的生物毒性，進而影響了菌株P(guān)R3的生長，該菌株降解芘的代謝路徑有待于進一步研究。

目前對于降解菌在土壤中的研究顯示，多數(shù)降解菌對老化土壤中PAHs的去除能力仍然有限，仍需與物理/化學(xué)/植物修復(fù)技術(shù)相結(jié)合，這也限制了其在農(nóng)業(yè)土壤中的應(yīng)用。張金寶等［32］將高效芘降解菌B4（單菌）和H4（混菌）與電修復(fù)相結(jié)合，90 d內(nèi)對老化土壤中芘（100 mg/kg）的降解率達到46.8%和64.4%，而僅接種降解菌的降解率僅為26.7%和31.4%。本研究中菌株P(guān)R3對老化6個月的土壤中不同濃度的芘均具有較強的降解能力，在30 d內(nèi)對初始濃度為90.67 mg/kg的芘降解率可達55%，顯示出其對土壤中結(jié)合的芘具有較強的利用能力，可為后續(xù)的作物生長提供良好的土壤環(huán)境。多項研究顯示，細菌胞外多糖可提高PAHs的生物利用度，同時也為在土壤顆粒及植物根際定植奠定了基礎(chǔ)［33］。在液體培養(yǎng)基中降解芘時，觀察到菌株P(guān)R3在未溶解的芘晶體上大量增殖并分泌胞外基質(zhì)形成生物膜，顯示出其具有較強的成膜能力以及分泌胞外多糖的能力，可能是其利用難溶性PAHs以及在植物根際有效定植的重要途徑。Chen等［34］研究發(fā)現(xiàn)菲降解菌RS1可有效定殖于多種植物根際及根組織內(nèi)，使得植物根部及地上部的菲含量分別降低了93.7%和75.2%。Liu等［35］利用菲降解菌Massilia sp. Pn2定殖于黑麥草根表及根內(nèi)，使得根系和地上部分菲的含量降低了54%和57%，有效降低了菲對植物的脅迫。本研究中，在根際接種菌株P(guān)R3可顯著降低水稻葉片及根中的芘積累量，顯示出其在安全的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有巨大的潛力，但其在植物根際的定植情況仍需進一步研究。

芘相較于更高分子量的PAHs，其更易通過根系吸收并轉(zhuǎn)運至地上各組織中積累，增加其在食物鏈中的暴露風(fēng)險［36］。長期脅迫或高濃度PAHs脅迫下，植物抗氧化系統(tǒng)表達受阻，導(dǎo)致ROS積累造成機體損傷。本研究中，在芘脅迫下，水稻葉片中葉綠素含量均顯著降低，進一步顯示出芘脅迫可通過影響植物光合作用等基礎(chǔ)生理活動來抑制植物生長。PGPR作為一類有益微生物，可通過多種途徑促進植物生長，還可通過刺激根系分泌多種氧化酶，促進根際環(huán)境中污染物的降解［37］。PGPR的溶磷作用通過將不溶的無機磷或有機磷轉(zhuǎn)化為可溶磷，易于被植物利用，在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，目前分離到的解磷菌的溶磷量大多為200-700 mg/L［38］。本研究中分離到的 Pseudomonas sp. PR3 在7 d內(nèi)的最大溶磷量可達（756.25±15.01）mg/L，具有較強的溶磷能力。研究顯示，PAHs導(dǎo)致的氧化應(yīng)激可影響植物激素（IAA、赤霉素等）和葉綠素的含量，進而抑制植物生長，在PAHs脅迫下IAA可通過提高植物根系表面積來促進植物生長，同時IAA還有利于植物根際菌群的建立［39］。目前分離到的產(chǎn)IAA菌株的合成能力差異較大，多數(shù)合成菌IAA的生成量在5-30 mg/L之間，在優(yōu)化培養(yǎng)條件后，某些菌株的IAA合成量甚至在數(shù)十至100 mg/L以上［40］。本研究中菌株P(guān)R3的IAA生成量為（14.46±0.20）mg/L，在常見IAA生成菌中處于中等水平。鐵載體是微生物分泌的可高效結(jié)合鐵的小分子有機物，能促進植物對鐵元素的吸收，在促進植物生長發(fā)育、提高抗逆性等方面發(fā)揮重要作用，目前利用鐵載體活性單位來評價菌株的合成能力［41］。菌株P(guān)R3產(chǎn)鐵載體活性高于50%，屬于高產(chǎn)鐵載體菌株。有研究顯示，PGPR的促生能力往往受到環(huán)境脅迫的抑制。Kotoky等［24］分離得到苯并（a）芘高效降解菌株Acinetobacter sp. PDB4，具有溶磷、產(chǎn)鐵載體及ACC脫氨酶等植物促生特性，但在苯并芘存在下，其促生特性均受到抑制。本研究表明，菌株P(guān)R3同時具有溶磷、產(chǎn)鐵載體和IAA幾種植物促生特性，且其植物促生能力在不同濃度芘脅迫下均保持較高水平。本研究由于在人工污染土壤中進行，而實際污染土壤中微生物與微生物以及不同污染物之間還會存在相互作用［42］，同時還受到不同溫度、濕度以及土壤pH影響，對污染物的修復(fù)效果以及植物吸收積累的水平亦會產(chǎn)生不同影響，因此本研究對芘污染條件下安全的作物生產(chǎn)提供一定依據(jù)，后續(xù)仍需在實際污染土壤中進行進一步研究。

4 結(jié)論

本研究從油田污染地植物根表分離到的菌株P(guān)R3具有溶磷、產(chǎn)IAA和鐵載體等促進植物生長特性，同時有較強的芘降解能力和對其他幾種PAHs的降解潛力，可在不同濃度人工老化芘污染土壤中有效降低氧化應(yīng)激水平，改善水稻的生長，提高土壤中芘去除率的同時減少植物組織中芘的吸收積累。