楊小峰 秦小偉 郭澤媛 呂麗華

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，太谷 030801；2. 忻州師范學院生物系，忻州 034000）

卵巢中的顆粒細胞（granulosa cells，GCs）是卵泡形成和發(fā)育過程中的主要功能細胞，能為卵母細胞的生長和成熟提供必要的營養(yǎng)和RNAs，自身也進行著增殖和分化，因此，探究顆粒細胞增殖和分化的影響因素對雌性繁殖性能的提高有很重要的意義。

原花青素（proanthocyanidins，PC）是植物中常見的一類多酚化合物，是公認的天然抗氧化劑，通常以黃烷-3-醇單體為基本單位構(gòu)成聚合體［1］。自然界中原花青素來源較廣，沙棘果、藍莓、葡萄籽、火龍果、黑玉米、黑枸杞等植物中原花青素含量較為豐富［2-3］。原花青素具有很強的清除自由基、抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)血脂等生理活性［4-5］。有研究表明，原花青素能促進雌性生殖干細胞的增殖［6］。細胞的增殖受細胞周期相關(guān)基因和細胞凋亡相關(guān)基因的調(diào)控。細胞周期調(diào)控分子包括細胞周期蛋白（cyclin）、細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CDKI）三大類。氨基末端結(jié)構(gòu)及功能高度相似的p21和p27都是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CDKIs）。p21蛋白可通過抑制CDK活性而阻滯細胞進入S期，p27則是通過與CyclinD-CDK4或CyclinE-CDK2復(fù)合物結(jié)合在靜止細胞和G1期細胞發(fā)揮作用［7］。p21、p27基因表達量上調(diào)可以引起周期阻滯在G1期［8］。半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族是導致細胞凋亡的蛋白酶系統(tǒng)，在細胞凋亡機制中居關(guān)鍵地位［9］。在Fas引發(fā)的凋亡反應(yīng)中，半胱氨酸蛋白酶級聯(lián)式地活化，其中caspase-8的活化是第一步反應(yīng)?；罨蟮腸aspase-8會引發(fā)下游的caspase活化，誘導細胞凋亡［10］。

本試驗旨在研究原花青素對體外培養(yǎng)綿羊卵巢顆粒細胞增殖的影響，并找出促進顆粒細胞增殖的最佳時間和最適濃度，在此濃度和時間下培養(yǎng)顆粒細胞，測定細胞周期相關(guān)基因和細胞凋亡相關(guān)基因的表達量，以此進一步佐證原花青素對體外培養(yǎng)綿羊卵泡顆粒細胞的增殖效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗以山西省太谷縣綿羊屠宰場性成熟綿羊的健康卵巢為研究對象。本試驗使用的主要試劑 為 ：PC（Solarbio）、MTT 試 劑 盒（Solarbio）、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa）、TB Green?TMPremix Ex TaqTMⅡ 試 劑 盒（TaKaRa）、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、DMSO、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、雙抗、PBS、臺盼藍。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

1.2.1.1 綿羊卵巢顆粒細胞的收集 將在屠宰場采集的卵巢浸泡在滅菌的杜氏磷酸緩沖鹽溶液（DPBS）中，置于冰上迅速帶回實驗室。用滅菌過的眼科剪剪離卵泡，選取大小適中的卵泡（3 mm＜直徑＜5 mm）在75%的酒精中浸洗幾秒，轉(zhuǎn)至超凈工作臺中。剪開卵泡，用刮刀刮卵泡內(nèi)壁，將刮取的顆粒細胞收集至培養(yǎng)基中。用細胞過濾篩過濾，去除雜質(zhì)。收集含有顆粒細胞的培養(yǎng)液，在4℃，1 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，加入完全培養(yǎng)液重懸細胞并在37℃，5% CO2的條件下培養(yǎng)。

1.2.1.2 活細胞密度測定 顆粒細胞鋪滿培養(yǎng)皿約80%-90%時，用胰蛋白酶消化細胞3-5 min，終止消化后離心，棄上清，再用完全培養(yǎng)液重懸細胞。取少量細胞懸液用等體積0.4%的臺盼藍染色1 min，用血球計數(shù)板計數(shù)活細胞數(shù)量，計算細胞濃度。用完全培養(yǎng)液稀釋并調(diào)整細胞懸液濃度約為5×104個/mL。

1.2.2 MTT試驗 將上述細胞懸液接種至3個96孔板中，每孔200 μL，每孔大約1×104個細胞。剩余細胞冷凍保存，備用。將96孔板置于37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)至細胞數(shù)量大約到整個孔的50%左右時，棄去原培養(yǎng)液，添加含有不同濃度（20、30、40、50、60、70和 80 μg/mL）PC的完全培養(yǎng)液并設(shè)置對照組（0 μg/mL），每個濃度的培養(yǎng)孔做3個重復(fù)，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h。吸去上清液，每孔加入90 μL完全培養(yǎng)液，再加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。再次棄去培養(yǎng)液，每孔加入110 μL Formazan溶解液，低速震蕩10-15 min，使結(jié)晶物溶解充分。在酶聯(lián)免疫檢測儀上，震蕩15 s，然后在490 nm測量吸光值（OD值）［11］，OD值的高低可間接反映細胞數(shù)量多少。

1.2.3 增殖基因表達量的檢測

1.2.3.1 總RNA的提取 將1.2.2冷凍保存的細胞復(fù)蘇后接種到6孔板中，細胞分為對照組（A組）和實驗組（B組），每組3個重復(fù)（A1、A2、A3/B1、B2、B3），繼續(xù)在 37℃，5% CO2的條件下培養(yǎng) 48 h。棄去原培養(yǎng)基，實驗組（B組）添加濃度為50 μg/mL PC的完全培養(yǎng)基（依據(jù)1.2.2的實驗結(jié)果），同時，對照組（A組）添加不含PC的完全培養(yǎng)基。然后用 Trizol法提取總 RNA［12］。

1.2.3.2 cDNA的合成 將對照組和實驗組（A1、A2、A3/B1、B2、B3）按照 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書分兩步進行反轉(zhuǎn)錄。第一步，去除基因組DNA反應(yīng)，按照以下體系配制反應(yīng)液 ：1 μL gDNA Eraser，2 μL 5×gDNA Eraser Buffer，1 μL RNA，RNase Free dH2O 定容到 10 μL。反應(yīng)條件為42℃，2 min，然后置于冰上。第二步，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在第一步反應(yīng)液的基礎(chǔ)上依次加入下列液體 ：1 μL PrimeScript RT Enzyme MixI，1 μL RT Prime Mix，4 μL 5×PrimeScript Buffer2，4 μL RNase Free dH2O，共計20 μL。反應(yīng)條件為37℃，15 min；85℃，5 s；然后置于冰上。反應(yīng)結(jié)束后，檢測產(chǎn)物純度以及濃度，于-20℃冰箱備用。

1.2.3.3 引物的設(shè)計與合成 依據(jù)NCBI上綿羊的預(yù)測序列（登錄號：XM027973596），利用Primer 5.0和Oligo 6軟件設(shè)計目的基因的引物，由上海生物工程股份有限公司合成。以綿羊18S基因作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences of RT-qPCR

1.2.3.4 RT-qPCR反應(yīng) 依據(jù)TB Green?TMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書，以cDNA為模板，構(gòu)建10 μL RT-qPCR反應(yīng)體系：PCR上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 5 μL，cDNA 模板 2 μL，RNase Free dH2O 2.2 μL。反應(yīng)條件為 95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，30 s，共45個循環(huán)。擴增后生成擴增曲線、溶解曲線，利用其CT值分析結(jié)果。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計 實驗數(shù)據(jù)利用SPSS 22.0進行分析，采用單因素方差分析和顯著性檢驗的方法。使用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。RT-qPCR相對表達量檢測結(jié)果采用2-ΔΔCt法計數(shù)，各基因表達量均經(jīng)過內(nèi)參18S校正。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度PC處理GCs不同時間后生長狀況

培養(yǎng)48 h后，與對照組（A1）相比，添加一定濃度PC的實驗組（B1、B2、B3）均可促進細胞增殖，濃度為50 μg/mL（B2）時細胞數(shù)量最多，增殖較為明顯。C為培養(yǎng)24 h，濃度為50 μg/mL時細胞數(shù)量圖，與對照組（A2）相比細胞數(shù)量增多，但是與培養(yǎng)48 h的B2圖相比，細胞數(shù)量較少。D為培養(yǎng)72 h，濃度為50 μg/mL時細胞數(shù)量圖，與對照組（A3）相比細胞數(shù)量明顯增多，與培養(yǎng)48 h的B2圖相比，細胞數(shù)量有一定的增加（圖1）。

圖1 不同濃度PC處理體外培養(yǎng)綿羊卵泡顆粒細胞不同時間后的生長狀況 （100×）Fig. 1 Growth status of sheep follicular granulosa cells in vitro cultured with different concentrations of PC for different time（100×）

2.2 MTT檢測不同濃度PC處理GCs不同時間后細胞數(shù)量變化

由圖2可知，體外培養(yǎng)綿羊顆粒細胞時，添加一定濃度的PC在一定時間內(nèi)可以促進細胞增殖。當培養(yǎng)基中PC濃度為50 μg/mL時，培養(yǎng)24 h、48 h和72 h的OD值均為最大，細胞數(shù)量最多，24 h和48 h時顯著度高于其它濃度（P＜0.05）。隨著濃度的增高，對細胞促進增殖效應(yīng)減弱。

圖2 不同濃度PC處理體外培養(yǎng)顆粒細胞24、48、72 h后的OD值Fig. 2 OD values of granulosa cells cultured in vitro after 24，48 and 72 h treatment with different concentration of PC

由于細胞處理48 h后的OD值較24 h高，且顯著度高于其它濃度（P＜0.05），因此后期實驗組處理條件為PC濃度為50 μg/mL，處理48 h。

2.3 特定濃度PC處理GCs增殖相關(guān)基因表達差異

由圖3可知，在PC濃度為50 μg/mL時，體外培養(yǎng)綿羊顆粒細胞48 h后，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21和p27 mRNA的表達量顯著降低（P＜0.01），同時，半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族中的caspase-8 的mRNA表達量顯也顯著降低（P＜0.01）。

圖3 綿羊顆粒細胞中增殖相關(guān)基因mRNA的表達Fig. 3 mRNA expression of proliferation-related genes in sheep granulosa cells

3 討論

原花青素是一種良好的抗氧化劑，其抗氧化能力比常見的抗氧化劑如VC、VE等還強［13］。原花青素具有抗腫瘤［14］、降血壓［15］、防治老年性疾?。?6］、增強免疫功能［17］、抗輻射［18］等功效，還可以緩解女性更年期癥狀［19］。其在防止卵巢衰老中具有重要的作用，研究表明原花青素對生殖干細胞增殖具有促進作用，與長壽基因SIRT1有關(guān)［6］。沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶類（sir2基因家族）是一類依賴于NAD+的高度保守去乙?；?，其同源性最高的同系物SIRT1參與調(diào)控哺乳動物的生殖功能［20］。SIRT1可以依賴NAD+在C-末端賴氨酸-382殘基處的p53脫乙?；档蚿53介導的轉(zhuǎn)錄活性，進而降低下游蛋白質(zhì)的表達，如p21、p27等。通過去乙?；饔?，SIRT1可以抑制p53調(diào)控的細胞周期阻滯和細胞凋亡，增強DNA修復(fù)機制，促進基因組完整性的維持，促進細胞存活及增殖［6，21］。

caspase-8以酶原形式（procaspase-8）形式存在于許多組織中。procaspase-8由479個氨基酸構(gòu)成，8種同分異構(gòu)體中有2種有酶活性，能啟動受體介導的細胞凋亡。這2種酶原的N-端的兩個串聯(lián)的70個氨基酸左右死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與適配蛋白N-端的DED同源，所以procaspase-8可與FADD結(jié)合。在哺乳動物中，caspase的活化途徑主要有細胞外和細胞內(nèi)途徑［10］。在凋亡的細胞內(nèi)途徑中，效應(yīng)蛋白在線粒體外膜透性的信號級聯(lián)后被激活，導致膜間蛋白的釋放，促進“凋亡小體”的形成，以及介導細胞死亡的caspases的激活；外部細胞凋亡依賴于死亡誘導信號復(fù)合物（DISC）的形成，DISC通常包括FADD和caspase-8。在這兩種凋亡形式中，細胞的死亡都是通過效應(yīng)物caspase誘導的細胞水泡、DNA碎片化、磷脂酰絲氨酸外化和“凋亡小體”的形成來實現(xiàn)的［22］。本研究表明，添加原花青素的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)顆粒細胞可以使得caspase-8表達量下調(diào)。

體內(nèi)研究表明，原花青素毒性較小，安全性較高。陳會從等［23］用原花青素對大鼠灌胃26周，劑量為 42、214、428 mg/（kg·d），大約相當于人日用量的10、50、100倍，過程中試驗動物沒有不良反應(yīng)。停藥觀察幾周，未發(fā)現(xiàn)蓄積毒性反應(yīng)。Huang等［24］在研究葡萄籽原花青素對大鼠血壓的影響時，未報到有不良反應(yīng)。Rodriguez等［25］綜述了原花青素在動物體內(nèi)毒性較小。本試驗對體外培養(yǎng)的綿羊卵泡顆粒細胞進行研究，發(fā)現(xiàn)原花青素可以促進卵泡顆粒細胞的增殖，一定程度上填補了原花青素對離體細胞生理機能影響的研究空白。

研究表明，通過抑制SIRT1的表達發(fā)現(xiàn)顆粒細胞凋亡率和卵泡閉鎖數(shù)增多，造成卵巢功能下降［26］。在小鼠實驗上發(fā)現(xiàn)可通過提高SIRT1的表達來提升卵泡的質(zhì)量與數(shù)量，達到延緩卵巢衰老的作用［27］。原花青素促進雌性生殖干細胞增殖與其調(diào)控SIRT1對下游底物p53去乙?；怪D(zhuǎn)錄活性失活，進而無法激活下游基因p21，其機制與SIRT1-p53-p21信號通路有關(guān)［6］。本研究從基因mRNA表達量水平做了分析，可以進一步從蛋白質(zhì)水平作分析研究；此外，原花青素促進GCs增殖的機理有待進一步證實。

卵巢衰老表現(xiàn)為卵泡的不斷喪失和卵泡質(zhì)量持續(xù)下降，導致雌性動物失去生育機能［28］。卵巢衰老及病變嚴重影響雌性動物的生殖機能，而卵巢衰老與GCs的衰老和凋亡有密切的聯(lián)系。研究表明原花青素可以促進體外培養(yǎng)的卵泡顆粒細胞增殖，為抗卵巢衰老機能乃至促進動物繁殖提供一定的理論研究支持。

4 結(jié)論

添加一定濃度的原花青素可以促進體外培養(yǎng)的綿羊卵泡顆粒細胞的增殖，培養(yǎng)48 h，在原花青素濃度為50 μg/mL時，促進效果最明顯，顆粒細胞的增殖可能與周期相關(guān)基因和凋亡相關(guān)基因表達量的變化有關(guān)，其機制可能與SIRT1-p53-p21信號通路有關(guān)。雌性動物的顆粒細胞在卵巢形成和發(fā)育過程中起著重要的作用，原花青素可能對雌性綿羊的生殖起到積極的作用。